CN105192718A - 虾仁下脚料锌螯合肽的用途 - Google Patents
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Classifications
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- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Abstract
本发明涉及一种虾仁下脚料锌螯合肽用于制备补锌食品和保健食品的用途，具体讲是该虾仁下脚料锌螯合肽的氨基酸序列为Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met，ESI/MS检测分子量为1027.20？Da。锌螯合胶原肽由于其独特的螯合和转运机制，吸收利用度高，又可同时补充多肽/氨基酸和锌，是一种理想的补锌物质。<b><u /></b>
Description
技术领域
本发明属于水产品精深加工技术领域，涉及一种离子螯合肽的用途，尤其涉及虾仁下脚料锌螯合肽的用途。
背景技术
我国的虾类资源非常丰富，近年来随着虾仁加工业的迅速发展，产生了大量的加工下脚料，这些下脚料中富含蛋白质、甲壳素以及虾青素等有效物质。经调查发现，我国以虾为主要原料的生产企业在处理虾类加工下脚料时，一部分以极低价格作为废料外售，或者运送到养殖场烘干粉碎作为饲料，还有很多未来得及处理的下脚料由于堆砌一处发霉腐烂，最终直接运往垃圾场。不但造成严重的资源浪费，而且还会引起环境污染。国外对虾加工下脚料的综合利用非常重视，并进行了深入的研究，在理论和实践方面均取得了系列成果，为我国虾仁加工下脚料的回收利用提供了依据。近年来，我国随着对环境保护的加强，虾仁加工下脚料的回收利用成为水产加工企业迫切需要解决的问题。目前我国主要还是用于生产甲壳素，对于蛋白和虾青素的回收利用由于成本高尚实现工业化生产。
经检索，以虾仁加工下脚料制备锌螯合肽未见报道。基于此，本发明根据锌螯合肽和虾仁加工下脚料的研究现状，提供一种具有金属锌螯合活性的多肽，并提供这种锌螯合肽的制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状提供一种源于虾仁加工下脚料的虾仁下脚料锌螯合肽的用途。
本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：虾仁下脚料锌螯合肽的用途，即该虾仁下脚料锌螯合肽用于制备制备补锌食品和保健食品的用途。
上述虾仁下脚料锌螯合肽的氨基酸序列为Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met，ESI/MS检测分子量为1027.20Da。
上述肽的制备方法如下：
1）虾仁加工下脚料蛋白酶解物的制备：将冷冻虾仁加工下脚料（虾头和虾壳）用组织捣碎机粉碎，按照料液比1g：4～5mL加入磷酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH6.5～7.5），于45～50℃下于超声功率400～500W下超声60～90min，然后加入中性蛋白酶（酶活力≥5.0×104U/g），于45～50℃保温2～3h后，温度升至90～95℃并保持10～15min；溶液温度降至37～40℃，pH调至7.5～8.0，加入胰蛋白酶（酶活力≥2.5×104U/g）保温2～3h后，温度升至90～95℃并保持10～15min后，于9000～10000g离心15～20min，得上清液，即虾仁加工下脚料蛋白酶解物。
2）虾仁加工下脚料锌螯合肽的制备：将制备的酶解物采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有8～10倍NKA-9大孔树脂的层析柱中，用2～3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用3～5倍柱体积的30%和60%乙醇进行洗脱，收集60%乙醇洗脱液，于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经固定化锌离子层析柱层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到虾仁加工下脚料锌螯合肽。
作为优选，所述步骤4）的固定化锌离子层析柱层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：
固定化锌离子层析柱层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10～20mg/mL的溶液，以0.5～1.5mL/min的流速通过固定化锌离子亲和层析柱，分别用3～5柱体积的水和0.1mol/LNaCl洗脱，收集0.1mol/LNaCl洗脱组分，即为亲和层析组分。
凝胶柱层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10～20mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高Zn螯合活性的峰为凝胶层析酶解物。
RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45～55μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对Zn的螯合活性得1个高Zn螯合肽Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met（WGFTCWPM）。
再优选，固定化锌离子层析柱填料的制备方法为：烧瓶内依次加入液体石蜡140mL，乙酸乙酯40mL，和TritonX-1008mL，搅拌30min后，加入100mL2%的壳聚糖乙酸溶液（乙酸浓度5%），60℃搅拌3h，缓慢滴加40%的甲醛10mL，反应30min，再缓慢滴加50%的戊二醛7mL，反应90min。用NaOH调pH至12～13，然后70℃下继续搅拌2h，过滤，分别用水、乙醇清洗，80℃干燥至恒重后转移至烧瓶中，依次向烧杯中加入1mol/LNaOH150mL，无水乙醇150mL，NaBH48g，室温下搅拌，抽滤，水洗至中性，乙醇清洗，干燥至恒重，得交联壳聚糖。转移交联壳聚糖至烧瓶中，加入1mol/LNaOH100mL，搅拌，缓慢滴加环氧氯丙烷47mL，室温下搅拌24h，抽滤，分别用水、乙醇清洗，干燥后转移至烧瓶中，加入1mol/LNaOH60mL，缓慢滴加乙二胺25mL，65～70℃下保温24h后，蒸馏水清洗，抽滤，干燥，得到配基螯合壳聚糖。用超纯水悬浮配基螯合壳聚糖，装柱，用两倍柱体积的超纯水平衡，再用5倍柱体积的0.1mol/LZnCl2溶液以0.5～1.0mL/min过柱后，用2～3倍柱体积超纯水清洗，得到壳聚糖锌离子固定化亲和层析填料。
再优选，所述RP-HPLC条件为：进样量8～10μL；色谱柱为ZorbaxC18；流动相：15%乙腈；洗脱速度0.5～0.8mL/min；紫外检测波长220nm。
本发明基于多肽与金属离子螯合的理论基础，以及多肽-Zn螯合物的独特功效（可同时补充多肽/氨基酸和Zn），以虾仁加工下脚料为原材料，通过对中性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解条件控制，制备具有高Zn螯合活性的多肽。本发明即为补锌保健食品和药物开发提供了一种技术支持，同时也为虾仁加工下脚料的高值化利用提供了一条新思路。
附图说明
图1是本发明的葡聚糖凝胶G-15层析图。
图2是本发明的葡聚糖凝胶G-15制备酶解物的RP-HPLC分析图。
图3是本发明的Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met（WGFTCWPM）的质谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一种源于虾仁加工下脚料的锌螯合肽及其制备方法，制备工艺流程如下：虾仁加工下脚料-蛋白提取、酶解-酶解物-超滤-大孔树脂纯化-固定化锌离子层析柱层析凝胶过滤层析-RP-HPLC制备-锌螯合肽。
实施例：
1）虾仁加工下脚料蛋白酶解物的制备：将冷冻虾仁加工下脚料（虾头和虾壳）用组织捣碎机粉碎，按照料液比1g：5mL加入磷酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH7.0），于47℃下于超声功率500W下超声90min，然后加入中性蛋白酶（酶活力≥5.0×104U/g），于47℃保温2h后，温度升至95℃并保持10min；溶液温度降至37℃，pH调至7.8，加入胰蛋白酶（酶活力≥2.5×104U/g）保温3h后，温度升至95℃并保持10min后，于10000g离心15min，得上清液，即虾仁加工下脚料蛋白酶解物。
2）虾仁加工下脚料锌螯合肽的制备：将制备的酶解物采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有10倍NKA-9大孔树脂的层析柱中，用3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用3倍柱体积的30%和60%乙醇进行洗脱，收集60%乙醇洗脱液，于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经固定化锌离子层析柱层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到虾仁加工下脚料锌螯合肽。利用氨基酸序列分析和质谱测定其结构，具体过程为：
①固定化锌离子层析柱层析:将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10～20mg/mL的溶液，以0.5～1.5mL/min的流速通过固定化锌离子亲和层析柱，分别用3～5柱体积的水和0.1mol/LNaCl洗脱，收集0.1mol/LNaCl洗脱组分，即为亲和层析组分。
②凝胶柱层析：将上述胶原肽混合物（亲和层析组分）溶于双蒸水配成浓度为10～20mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据214nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高Zn螯合活性的峰为凝胶层析酶解物（F3）（图1）；
③RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45～55μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（所述RP-HPLC条件为：进样量8～10μL；色谱柱为ZorbaxC18；流动相：15%乙腈；洗脱速度0.5～0.8mL/min；紫外检测波长220nm），根据对Zn的螯合活性得1个高Zn螯合活性胶原肽（图2）。
④结构检测：Zn螯合胶原肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met（WGFTCWPM），ESI/MS检测分子量为1027.20Da（图3）。
再优选，固定化锌离子层析柱填料的制备方法为：烧瓶内依次加入液体石蜡140mL，乙酸乙酯40mL，和TritonX-1008mL，搅拌30min后，加入100mL2%的壳聚糖乙酸溶液（乙酸浓度5%），60℃搅拌3h，缓慢滴加40%的甲醛10mL，反应30min，再缓慢滴加50%的戊二醛7mL，反应90min。用NaOH调pH至12～13，然后70℃下继续搅拌2h，过滤，分别用水、乙醇清洗，80℃干燥至恒重后转移至烧瓶中，依次向烧杯中加入1mol/LNaOH150mL，无水乙醇150mL，NaBH48g，室温下搅拌，抽滤，水洗至中性，乙醇清洗，干燥至恒重，得交联壳聚糖。转移交联壳聚糖至烧瓶中，加入1mol/LNaOH100mL，搅拌，缓慢滴加环氧氯丙烷47mL，室温下搅拌24h，抽滤，分别用水、乙醇清洗，干燥后转移至烧瓶中，加入1mol/LNaOH60mL，缓慢滴加乙二胺25mL，65～70℃下保温24h后，蒸馏水清洗，抽滤，干燥，得到配基螯合壳聚糖。用超纯水悬浮配基螯合壳聚糖，装柱，用两倍柱体积的超纯水平衡，再用5倍柱体积的0.1mol/LZnCl2溶液以0.5～1.0mL/min过柱后，用2～3倍柱体积超纯水清洗，得到壳聚糖锌离子固定化亲和层析填料。
再优选，所述RP-HPLC条件为：进样量8～10μL；色谱柱为ZorbaxC18；流动相：15%乙腈；洗脱速度0.5～0.8mL/min；紫外检测波长220nm。
Zn螯合胶原肽对锌离子的螯合作用采用EDTA滴定法测定。取螯合物100mg于100mL小烧杯中，加水50mL，滴入HCl（6mol/L）数滴。摇匀后在水浴上加热使之完全溶解，冷却后定容至l00mL，从中吸取l0mL于三角瓶，平行3份，加入pH10的NH3-NH4Cl缓冲液l0mL，铬黑T指示剂适量，然后用0.01mol/LNa2EDTA液滴定至蓝色；记录消耗EDTA的毫升数，计算螯合物含锌量。
测定结果表明：纯化得到的Zn螯合胶原肽Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met（WGFTCWPM）对锌离子的螯合能力为83.56μg/mg，与胶原蛋白酶解产物（30.12μg/mg）相比其对Zn的螯合能力取得了出乎意料的效果，具有很好的补锌预期。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQUENCELISTING
<110>浙江海洋学院
<120>虾仁下脚料锌螯合肽的用途
<130>zjou-2015-wb0706
<160>1
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>人工合成
<400>1
TrpGlyPheThrCysTrpProMet
15
Claims (2)
1.虾仁下脚料锌螯合肽的用途，其特征是：该虾仁下脚料锌螯合肽用于制备制备补锌食品和保健食品的用途。
2.根据权利要求1所述的虾仁下脚料锌螯合肽的用途，其特征是：所述的虾仁下脚料锌螯合肽的氨基酸序列为Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met，ESI/MS检测分子量为1027.20Da。
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