CN107177650B - 一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法。本发明以北太平洋鱿鱼缠卵腺为原料，通过超滤、HPLC纯化制得北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽，该寡肽的氨基酸序列为Ala‑Tyr‑Ala‑Ser‑Ser，分子量为497.50Da。
Description
技术领域
本发明涉及一种海洋生物活性物质的制备方法，具体涉及一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法。
背景技术
机体在新陈代谢过程中产生的中间产物如超氧化物阴离子（O2-）、H2O2、过氧化自由基（ROO）和羟自由基（-OH）具有很强的氧化作用。正常生理情况下，体内的抗氧化酶及非酶类因子可以将自由基有效地清除，从而维持自由基的平衡状态。但在病理情况下，能迅速引起脂质的过氧化造成细胞膜、DNA和蛋白活性的损伤，从而导致多种人类疾病相关。因此，对体内自由基的清除是防御机体疾病发生的一个重要途径。由于合成的抗氧化剂多数存在安全隐患，因此，筛选高效、低毒抗氧化剂已成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势。已有研究表明，来源于多种蛋白的活性肽都具有抗氧化活性，酶解方法是从蛋白中获得生物活性肽的有效方法之一，作为一种提高蛋白质活性功能和营养价值的方法已被广泛应用。饮食当中的蛋白质在肠道中主要以多肽和氨基酸的形式被吸收，多肽在机体抗氧化过程中起着重要的作用。近年来对海洋生物活性肽，特别是抗氧化活性肽的研究取得了很大进展。但海洋活性肽尚未形成规模产业，因此，借鉴陆地活性肽开发的酶工程技术，以海洋生物蛋白资源为原料，通过对酶解、制备等工艺的综合研究，即可研制出陆地蛋白源和化学合成所无法生产的系列天然、高效、新颖的生物活性肽。
鱿鱼是世界上重要的海洋头足类动物，其生长周期短、繁殖能力强和资源恢复迅速，是一种可持续的海洋渔业资源。近年来，随着国内外深海捕捞技术的发展，鱿鱼已成为我国主要的海洋捕捞和水产加工品种。目前，我国每年鱿鱼加工量高达40~50万t，居世界第一位，加工品种主要为北太平洋鱿鱼、阿根廷鱿鱼和秘鲁鱿鱼。鱿鱼因其肉质细腻营养，风味鲜美，具有高蛋白低脂肪、富含人体所需的多种必须氨基酸，备受消费者青睐。在鱿鱼的加工过程中一般对其胴体进行加工，产生50％左右的内脏等副产物，其中生殖腺（缠卵腺、精巢、卵巢等）占内脏的20％，这些内脏等副产物通常被加工成饲料，作为鱼的诱饵；鱿鱼肝脏被提取鱿鱼油后掩埋；而得到的鱿鱼缠卵腺通常只作烹饪食用，生物附加值低并且未及时处理会对环境造成一定的污染。关于鱿鱼缠卵腺酶解多肽的提取目前尚未见报导。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种制备具有抗氧化功效的北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法。
本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：
北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，具有如下步骤：
1）取北太平洋鱿鱼缠卵腺捣碎匀浆，以活性酶在设定的酶解温度及pH值条件下，加蛋白酶、保温进行酶解；然后灭活，在0~4 oC、6000~12000 r/min的条件下离心，取上清；
2）取上清液，超滤截留分子量为3-5 KD分子段的超滤组分待用；
3）取所述的超滤组分进行琼脂糖凝胶层析分离，收集280 nm处出现三个峰中的第一个峰的组分；
4）取所述的第一个峰的组分过HPLC进一步分离得到北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽，其分子结构为：
上述活性酶为碱性蛋白酶，优选的，酶解温度位于40～50℃之间、水解时间在5～7h之间、pH 在8.0～10.0之间、加酶量位于2500～3500U/g 、料液比位于1：3～1：5。
优选的酶解的条件为：温度 50℃、酶解时间7 h、加酶量 3500 U/g、pH 值9.0、料液比为1：6为最佳酶解条件
步骤3）所述的洗脱的条件为：柱尺寸：10×300-310 mm；柱料：琼脂糖；柱料颗粒大小：10 ± 2 µm；上样量：500 µL；流动相：超纯水；洗脱液流速：0.5 mL/min；检测波长：280nm；自动收集体积：3.2 mL/管。
与现有技术相比，本发明提供的一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法的优点在于：本发明工艺科学合理，操作简单，产物活性高，产品产率稳定。同时，本发明所制备的北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽是天然原料经酶解制得，安全、无毒副作用，抗氧化活性显著。
附图说明
图1为本发明实施例1抗氧化酶解寡肽氨基酸分子结构式；
图2 为本发明实施例1超滤组分3-5 KD分子段在280 nm处的吸光度（吸光度-管数）；
图3为本发明图2中不同峰的DPPH清除率；
图4为本发明实施例1酶解多肽不同分子段的超氧阴离子清除率；
图5为本发明实施例1酶解多肽不同分子段对DPPH的清除率；
图6 为本发明实施例1酶解多肽不同分子段的还原能力；
图7 为本发明实施例1酶解多肽不同分子段的羟自由基清除率；
图8为本发明实施例1峰Ⅰ在280 nm处高效液相色谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：
北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，具有如下步骤：
1）取北太平洋鱿鱼缠卵腺捣碎匀浆，以活性酶在最适酶解温度及pH值条件下，加蛋白酶、保温进行酶解；然后灭活，在0~4 oC、6000~12000 r/min的条件下离心，取上清；
2）取上清液，超滤截留分子量为3-5 KD分子段的超滤组分待用；
3）取所述的超滤组分进行琼脂糖凝胶层析分离，收集280 nm处出现三个峰中的第一个峰的组分；
4）取所述的第一个峰的组分过HPLC进一步分离得到北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽，其分子结构为：
上述活性酶为碱性蛋白酶，优选的，酶解温度位于40～50℃之间、水解时间在5～7h之间、pH 在8.0～10.0之间、加酶量位于2500～3500U/g 、料液比位于1：3～1：5。
优选的酶解的条件为：温度 50℃、酶解时间7 h、加酶量 3500 U/g、pH 值9.0、料液比为1：6为最佳酶解条件
步骤3）所述的洗脱的条件为：柱尺寸：10×300-310 mm；柱料：琼脂糖；柱料颗粒大小：10 ± 2 µm；上样量：500 µL；流动相：超纯水；洗脱液流速：0.5 mL/min；检测波长：280nm；自动收集体积：3.2 mL/管。
实施例2：
材料与方法
供试材料
北太平洋鱿鱼缠卵腺购置于本地水产企业；碱性蛋白酶购置于亚太恒信生物科技（北京）有限公司；DPPH购置于西亚试剂；菲洛嗪、邻二氮菲、三氯化铁、磷酸氢二钠购置于阿拉丁试剂公司；其余试剂均为分析纯，购置于国药集团化学试剂有限公司。
主要仪器
SSW-420-2S恒温水浴锅，上海民仪电子有限公司；BSA124S型电子天平，德国SartoriusAG公司；DS-1组织捣碎机，上海标本模型厂；PHS-250PH计，上海理达仪器厂；CF16RXⅡ型高速低温离心机，日本日立公司；Direct-Q 5 UV-R型超纯水系统，美国Millipore公司；Cogent u Scale型超滤系统，美国Millipore公司；ALPHA 1-4/LDplus型冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；紫外分光光度计（752FC），上海光谱仪器有限公司；Agilent-1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司。
方法
单因素实验
选用碱性蛋白酶进行酶解试验，考虑酶解温度、酶解时间、加酶量、溶液 pH和料液比。水解工艺如下:
鱿鱼缠卵腺捣碎→匀浆→ 1 mol/L 氢氧化钠调pH值→保温→加酶后水解→灭酶(90℃加热15 min) →离心 (10000 r/min、15 min) →上清液定容→氨基氮含量(AAN)测定。当温度位于40～50℃之间、水解时间在5～7h之间、pH 在8.0～10.0之间、加酶量位于2500～3500U/g 、料液比位于1：3～1：5时水解效果较好，得到的游离ANN 量最多，水解程度越高。然而，温度 50℃、酶解时间7 h、加酶量 3500 U/g、pH 值9.0、料液比为1：6为最佳酶解条件。
Sephadex G-25分离纯化结果
取3-5 KD分子段冻干样品进行琼脂糖凝胶Sephadex G-25层析，于280 nm处出现三个峰，即峰Ⅰ、峰Ⅱ和峰Ⅲ，分别收集三个峰组分经冷冻干燥后检测其对DPPH清除率，得出峰Ⅰ有较好的清除能力，见图3，取峰Ⅰ分子段进行HPLC的纯化。
HPLC分离、纯度检测及目标肽序列测定结果
峰Ⅰ经HPLC色谱柱制备结果如图8所示，保留时间约为18min时，出现单一峰，峰高为161.2，经氨基酸序列仪N端序列检测，其氨基酸序列为Ala-Tyr-Ala-Ser-Ser（AYASS），相对分子质量为497.50 Da，其结构式如下：
经琼脂糖凝胶G-25层析后，得出三个峰，根据对DPPH清除率的测定，得出峰Ⅰ效果明显确，对DPPH的清除率达61.8%，后经HPLC分离纯化并经氨基酸序列仪N端序列检测，得到目标肽的氨基酸序列为Ala-Tyr-Ala-Ser-Ser。北太平洋鱿鱼缠卵腺通过酶解可获得抗氧化活性较好的寡肽，可开发鱿鱼副产品的精深加工,提高生物附加值具有重要的意义。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法
<130> zjou-yzs-20161202
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Ala Tyr Ala Ser Ser
1 5
Claims (1)
1.一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，其特征在于：具有如下步骤：
1)取北太平洋鱿鱼缠卵腺捣碎匀浆，加碱性蛋白酶在料液比为1:6、温度50℃、酶解时间7h、加酶量3500U/g、pH值9.0条件下酶解；然后灭活，在0~4℃、6000~12000r/min的条件下离心，取上清；
2)取上清液，超滤截留分子量为3-5KD分子段的超滤组分待用；
3)取所述的超滤组分进行琼脂糖凝胶层析分离，洗脱的条件为：柱尺寸：10×300-310mm；柱料：琼脂糖；柱料颗粒大小：10±2µm；上样量：500µL；流动相：超纯水；洗脱液流速：0.5mL/min；检测波长：280nm；自动收集体积：3.2mL/管；收集280nm处出现三个峰中的第一个峰的组分；
4)取所述的第一个峰的组分过HPLC进一步分离得到北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽；
所述的北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的氨基酸序列是Ala-Tyr-Ala-Ser-Ser(AYASS)，分子量为497.50Da。
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