CN108277247A - 从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法 - Google Patents

从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法，具体为：将鱿鱼缠卵腺中加入NaOH水溶液中超声波浸泡，水洗至中性，最后用异丙醇溶液浸泡脱脂，洗净沥干；向预处理的缠卵腺中加入甘氨酸‑NaOH缓冲液，混合均匀，依次用碱性蛋白酶和中性蛋白酶水解得酶解液；将酶解液经超滤膜进行分级得到超滤酶解液，然后将超滤酶解液依次经凝胶柱层析、离子交换树脂层析和反相高效液相色谱纯化，即得抗氧化活性多肽。有益效果为：本发明提取方法提取率高，提取方法简单，易于工业化生产，安全性更高，提高鱿鱼缠卵腺附加值，得到的抗氧化活性多肽颜色较白、无鱼腥味、热稳定性好。

Description

从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法
技术领域
本发明涉及鱼类产品深加工技术领域，尤其是涉及从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法。
背景技术
鱿鱼，虽然习惯上称它们为鱼，其实它并不是鱼，而是生活在海洋中的软体动物。鱿鱼属于软体动物门，头足纲，枪乌贼科，通称枪乌贼。体色苍白，体圆锥形，头大，有淡褐色斑，前方生有10条触足，常成群游弋于深约20米的海洋中。常活动于浅海中上层，垂直移动范围达百余米。肉质细嫩，风味类似于鲍鱼，但价格很低，被成为“穷人的鲍鱼”。西方人因为鱿鱼表皮暗且易变，而称鱿鱼为“魔鬼鱼”；西班牙人吃鱿鱼比较多，他们把鱿鱼加工成不同风味的罐头，鱿鱼酱油，鱿鱼圈等；美国人近几年来也开始提倡吃鱿鱼，他们把鱿鱼加工成类似鲍鱼的形态出售；鱿鱼在日本很受欢迎，已成为日本日常生活中必不可少的水产品，日本人把鱿鱼一般加工成冷冻制品、干制品、珍味制品、盐渍制品、加热杀菌制品。近年来，鱿鱼加工产量日益扩大，但在加工过程中一般仅对其酮体进行加工，产生50%左右的内脏等副产物，其中生殖腺(缠卵腺、精巢、卵巢等)占了鱿鱼内脏的20%～30%。缠卵腺在头足类中普遍存在，位于直肠两侧内脏囊壁上，墨囊的两侧，呈白色卵状，与头足类的生殖活动密切相关。据相关研究报道，海洋生物的生殖腺大都营养丰富，常含有多种活性物质，但这部分研究常常被人们忽视，未得到合理和高值化的开发，亟待能获得合理充分的利用。符合当今海洋生物活性物质研究的发展趋势，亦是高值化利用低值加工副产物的重要途径，为今后水产品加工和活性物质的开发利用起到了良好的科学先导作用；能够提高鱿鱼加工的附加值，增加企业的经济效益；同时，这也是合理利用资源开展综合利用、减少资源浪费及环境污染、保护环境维持生态平衡、实现可持续发展的重要方式。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗氧化活性多肽提取率高，提取方法简单，易于工业化生产，安全性更高，提高鱿鱼缠卵腺附加值，得到的抗氧化活性多肽颜色较白、无鱼腥味、热稳定性好的从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法，包括预处理、双酶水解、分离纯化，其具体步骤为：
预处理：将鱿鱼缠卵腺清水洗净，沥干，切碎后再组织捣碎，按料液比为1:7-9加入浓度为0.8-1.3‰的NaOH水溶液中，NaOH水溶液中含有0.4-0.6%微波改性活性炭，在超声波功率为150-200W、温度为2-5℃下超声波浸泡2-4h，水洗至中性，最后按料液比为1:20-24向鱿鱼缠卵中加入浓度为8-12%的异丙醇溶液，在温度为2-5℃浸泡脱脂10-15h，用蒸馏水洗净沥干，备用，鱿鱼缠卵腺中含有很多杂蛋白及脂肪，所以要先进行前处理，来去除这些杂蛋白、脂肪及色素等，可减少此类物质对鱿鱼缠卵腺蛋白的影响，该步骤可以去除缠卵腺上的杂蛋白、脂肪及色素等，采用微波改性活性炭和超声波结合进行脱色，超声波具有强烈的分散作用和空化效应，使得活性炭能和缠卵腺充分接触，能使活性炭快速吸附色素，能显著提高活性炭和鱿鱼缠卵腺的反应效果，提高活性炭的利用率；
双酶水解：按料液比1:20-25（w/v）向匀浆缠卵腺中加入pH为9.5-10.5的甘氨酸-NaOH缓冲液，混合均匀，然后在45-50℃水浴中预热10-15min，再按匀浆缠卵腺重量的1.0-1.5%加入酶活力≥1.9×104U/g的碱性蛋白酶，在45-55℃下酶解50-60min，反应结束后升温至90-100℃灭酶10-20min，调整pH至中性，然后在温度为0-5℃、转速为7000-9000rpm的离心机中离心10-20min，然后将上清液的pH至6.0-7.5，按原料重量的1.0-1.5%加入酶活力≥1.0×105U/g的中性蛋白酶，再加入中性蛋白酶重量0.25-0.30%的聚六亚甲基胍，在45-50℃下酶解3-6h后升温至90-95℃，保持灭酶10-15min，得酶解液，备用，聚六亚甲基胍的加入可以促使中性蛋白酶能快速地找到缠卵腺蛋白两端的端肽，进而切除，提高抗氧化活性多肽的提取速率，且聚六亚甲基胍的加入可以适当提高抗氧化活性多肽的热稳定性，具有意想不到的效果，酶法水解安全性更高，在温和条件下进行定位水解，水解过程也比较容易控制，依次采用双酶对缠卵腺进行酶解，能够使酶切作用位点被完全打开后，使具有清除自由基作用的抗氧化活性多肽得到有效释放，提高抗氧化活性多肽的得率，成本较低，安全性高，不仅不会破坏活性多肽的成分和活性，而且能改善活性多肽的品质，且该抗氧化活性多肽颜色较白、无鱼腥味，可以作为药品、保健食品和食品的添加剂；
分离纯化：将酶解液经截留分子量为3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于3kDa组分，得到超滤酶解液，然后将超滤酶解液依次经凝胶柱层析、离子交换树脂层析和反相高效液相色谱纯化，即得抗氧化活性多肽，该步骤可制得纯度较高的抗氧化活性多肽，该抗氧化活性多肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用，且具有良好的脂质抗氧化能力，同时具有良好的抗氧化活性，易于消化吸收，安全无毒副作用。
作为优选，预处理中用的活性炭为微波改性活性炭，其制备方法为：将活性炭置于浓度为3-6%的盐酸溶液中煮沸，并保持40-50min，滤去水分后用去离子水反复冲洗至中性，接着在100-120℃下烘干20-30h，然后将活性炭在微波功率为600-700W的条件下微波辐射4-6min，即得改性活性炭，上述盐酸溶液中含有0.021-0.025%的马兜铃酸，用含有马兜铃酸的盐酸溶液预处理活性炭，可使活性炭中的杂质在微波处理时能够不被晶化，不会造成活性炭微晶层间距变小，且可避免活性炭基本微晶发生热膨胀而造成孔隙塌的现象，保障活性炭的吸附效果，经微波改性后，活性炭孔壁变薄，以前闭塞、半闭塞的孔径也打开，孔隙更发达，表面粗糙不平，这些变化都有利于活性炭对色素和腥味物质的吸附，还能提高吸附速率，同时微波改性还使得活性炭表面碱性官能团增多，表面含氧量减少，有利于活性炭对鱿鱼缠卵腺中酸性基的胶体和有机酸的吸附，且该活性炭能循环利用，对鱿鱼缠卵腺蛋白无不良影响，无环境污染，不腐蚀设备，经济适用，具有良好的前景，从环保的观点来看，改性活性炭是一种环境友好型的材料。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明提取简单，易于工业化生产，安全性更高，抗氧化活性多肽的提取率高，大大提高了鱿鱼缠卵腺的附加值，市场发展潜力大；2）该提取方法可制得纯度较高的抗氧化活性多肽，该抗氧化肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用，且具有良好的脂质抗氧化能力，同时具有良好的抗氧化活性，易于消化吸收，安全无毒副作用；3）本发明脱色使用的活性炭对色素和腥味物质具有良好的吸附作用，吸附速率高，同时对鱿鱼缠卵腺中酸性基的胶体和有机酸的吸附，且该活性炭能循环利用，对鱿鱼缠卵腺蛋白无不良影响，具有良好的前景，从环保的观点来看，改性活性炭是一种环境友好型的材料；4）本发明采用双酶对缠卵腺进行酶解，能够使酶切作用位点被完全打开后，使具有清除自由基作用的抗氧化活性多肽得到有效释放，提高抗氧化活性多肽的得率，成本较低，安全性高，不会破坏活性多肽的成分和活性，能改善活性多肽的品质。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法，包括预处理、双酶水解、分离纯化，其具体步骤为：
1）预处理：将鱿鱼缠卵腺清水洗净，沥干，切碎后再组织捣碎，按料液比为1:7加入浓度为1.3‰的NaOH水溶液中，NaOH水溶液中含有0.4%微波改性活性炭，在超声波功率为200W、温度为2℃下超声波浸泡4h，水洗至中性，最后按料液比为1:20向鱿鱼缠卵中加入浓度为12%的异丙醇溶液，在温度为2℃浸泡脱脂15h，用蒸馏水洗净沥干，备用，鱿鱼缠卵腺中含有很多杂蛋白及脂肪，所以要先进行前处理，来去除这些杂蛋白、脂肪及色素等，可减少此类物质对鱿鱼缠卵腺蛋白的影响，该步骤可以去除缠卵腺上的杂蛋白、脂肪及色素等，采用微波改性活性炭和超声波结合进行脱色，超声波具有强烈的分散作用和空化效应，使得活性炭能和缠卵腺充分接触，能使活性炭快速吸附色素，能显著提高活性炭和鱿鱼缠卵腺的反应效果，提高活性炭的利用率；
2）双酶水解：按料液比1:20（w/v）向匀浆缠卵腺中加入pH为10.5的甘氨酸-NaOH缓冲液，混合均匀，然后在45℃水浴中预热15min，再按匀浆缠卵腺重量的1.0%加入酶活力≥1.9×104U/g的碱性蛋白酶，在55℃下酶解50min，反应结束后升温至100℃灭酶10min，调整pH至中性，然后在温度为5℃、转速为7000rpm的离心机中离心20min，然后将上清液的pH至6.0，按原料重量的1.5%加入酶活力≥1.0×105U/g的中性蛋白酶，再加入中性蛋白酶重量0.25%的聚六亚甲基胍，在50℃下酶解3h后升温至95℃，保持灭酶10min，得酶解液，备用，聚六亚甲基胍的加入可以促使中性蛋白酶能快速地找到缠卵腺蛋白两端的端肽，进而切除，提高抗氧化活性多肽的提取速率，且聚六亚甲基胍的加入可以适当提高抗氧化活性多肽的热稳定性，具有意想不到的效果，酶法水解安全性更高，在温和条件下进行定位水解，水解过程也比较容易控制，依次采用双酶对缠卵腺进行酶解，能够使酶切作用位点被完全打开后，使具有清除自由基作用的抗氧化活性多肽得到有效释放，提高抗氧化活性多肽的得率，成本较低，安全性高，不仅不会破坏活性多肽的成分和活性，而且能改善活性多肽的品质，且该抗氧化活性多肽颜色较白、无鱼腥味，可以作为药品、保健食品和食品的添加剂；
3）分离纯化：将酶解液经截留分子量为3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于3kDa组分，得到超滤酶解液，然后将超滤酶解液依次经凝胶柱层析、离子交换树脂层析和反相高效液相色谱纯化，即得抗氧化活性多肽，该步骤可制得纯度较高的抗氧化活性多肽，该抗氧化肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用，且具有良好的脂质抗氧化能力，同时具有良好的抗氧化活性，易于消化吸收，安全无毒副作用。
上述预处理中用的活性炭为微波改性活性炭，其制备方法为：将活性炭置于浓度为6%的盐酸溶液中煮沸，并保持40min，滤去水分后用去离子水反复冲洗至中性，接着在120℃下烘干20h，然后将活性炭在微波功率为700W的条件下微波辐射4min，即得改性活性炭，上述盐酸溶液中含有0.025%的马兜铃酸，用含有马兜铃酸的盐酸溶液预处理活性炭，可使活性炭中的杂质在微波处理时能够不被晶化，不会造成活性炭微晶层间距变小，且可避免活性炭基本微晶发生热膨胀而造成孔隙塌的现象，保障活性炭的吸附效果，经微波改性后，活性炭孔壁变薄，以前闭塞、半闭塞的孔径也打开，孔隙更发达，表面粗糙不平，这些变化都有利于活性炭对色素和腥味物质的吸附，还能提高吸附速率，同时微波改性还使得活性炭表面碱性官能团增多，表面含氧量减少，有利于活性炭对鱿鱼缠卵腺中酸性基的胶体和有机酸的吸附，且该活性炭能循环利用，对鱿鱼缠卵腺蛋白无不良影响，无环境污染，不腐蚀设备，经济适用，具有良好的前景，从环保的观点来看，改性活性炭是一种环境友好型的材料。
实施例2：
从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法，包括预处理、双酶水解、分离纯化，其具体步骤为：
1）预处理：将鱿鱼缠卵腺清水洗净，沥干，切碎后再组织捣碎，按料液比为1:9加入浓度为0.8‰的NaOH水溶液中，NaOH水溶液中含有0.6%微波改性活性炭，在超声波功率为150W、温度为5℃下超声波浸泡2h，水洗至中性，最后按料液比为1:24向鱿鱼缠卵中加入浓度为8%的异丙醇溶液，在温度为5℃浸泡脱脂10h，用蒸馏水洗净沥干，备用，上述预处理中用的活性炭为微波改性活性炭，其制备方法为：将活性炭置于浓度为6%的盐酸溶液中煮沸，并保持40min，滤去水分后用去离子水反复冲洗至中性，接着在120℃下烘干20h，然后将活性炭在微波功率为700W的条件下微波辐射4min，即得改性活性炭，上述盐酸溶液中含有0.025%的马兜铃酸；
2）双酶水解：按料液比1:20（w/v）向匀浆缠卵腺中加入pH为10.5的甘氨酸-NaOH缓冲液，混合均匀，然后在45℃水浴中预热15min，再按匀浆缠卵腺重量的1.0%加入酶活力≥1.9×104U/g的碱性蛋白酶，在55℃下酶解50min，反应结束后升温至100℃灭酶10min，调整pH至中性，然后在温度为5℃、转速为9000rpm的离心机中离心10min，然后将上清液的pH至7.5，按原料重量的1.0%加入酶活力≥1.0×105U/g的中性蛋白酶，再加入中性蛋白酶重量0.30%的聚六亚甲基胍，在45℃下酶解6h后升温至90℃，保持灭酶15min，得酶解液，备用；
3）分离纯化：将酶解液经截留分子量为3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于3kDa组分，得到超滤酶解液，然后将超滤酶解液依次经凝胶柱层析、离子交换树脂层析和反相高效液相色谱纯化，即得抗氧化活性多肽，该步骤可制得纯度较高的抗氧化活性多肽。
实施例3：
从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法，包括预处理、双酶水解、分离纯化，其具体步骤为：
1）预处理：将鱿鱼缠卵腺清水洗净，沥干，切碎后再组织捣碎，按料液比为1:8加入浓度为1.0‰的NaOH水溶液中，NaOH水溶液中含有0.5%微波改性活性炭，在超声波功率为180W、温度为4℃下超声波浸泡3h，水洗至中性，最后按料液比为1:22向鱿鱼缠卵中加入浓度为10%的异丙醇溶液，在温度为4℃浸泡脱脂12h，用蒸馏水洗净沥干，备用，上述预处理中用的活性炭为微波改性活性炭，其制备方法为：将活性炭置于浓度为5%的盐酸溶液中煮沸，并保持45min，滤去水分后用去离子水反复冲洗至中性，接着在110℃下烘干25h，然后将活性炭在微波功率为650W的条件下微波辐射5min，即得改性活性炭，上述盐酸溶液中含有0.023%的马兜铃酸；
2）双酶水解：按料液比1:22（w/v）向匀浆缠卵腺中加入pH为10.0的甘氨酸-NaOH缓冲液，混合均匀，然后在48℃水浴中预热12min，再按匀浆缠卵腺重量的1.2%加入酶活力≥1.9×104U/g的碱性蛋白酶，在50℃下酶解55min，反应结束后升温至95℃灭酶15min，调整pH至中性，然后在温度为4℃、转速为8000rpm的离心机中离心15min，然后将上清液的pH至7.0，按原料重量的1.2%加入酶活力≥1.0×105U/g的中性蛋白酶，再加入中性蛋白酶重量0.28%的聚六亚甲基胍，在48℃下酶解5h后升温至95℃，保持灭酶12min，得酶解液，备用；
3）分离纯化：将酶解液经截留分子量为3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于3kDa组分，得到超滤酶解液，然后将超滤酶解液依次经凝胶柱层析、离子交换树脂层析和反相高效液相色谱纯化，即得抗氧化活性多肽，该步骤可制得纯度较高的抗氧化活性多肽。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法，包括预处理、双酶水解、分离纯化，其特征在于：所述的预处理步骤为：将鱿鱼缠卵腺清水洗净，沥干，切碎后再组织捣碎，加入NaOH水溶液中超声波浸泡，水洗至中性，最后用异丙醇溶液浸泡脱脂，洗净沥干，备用，所述的NaOH水溶液中含有微波改性活性炭。
2.据要求1所述的从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法，其特征在于：所述的预处理步骤中鱿鱼缠卵腺和NaOH水溶液的料液比为1:7-9，所述的NaOH水溶液的浓度为0.8-1.3‰，超声波浸泡功率为150-200W、温度为2-5℃、时间为2-4h。
3.权利要求1所述的从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法，其特征在于：所述的NaOH水溶液中含有0.4-0.6%微波改性活性炭，所述的微波改性活性炭的制备方法为：将活性炭置于浓度为3-6%的盐酸溶液中煮沸，并保持40-50min，滤去水分后用去离子水反复冲洗至中性，接着在100-120℃下烘干20-30h，然后将活性炭在微波功率为600-700W的条件下微波辐射4-6min，即得改性活性炭。
4.权利要求4所述的从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法，其特征在于：所述的盐酸溶液中含有0.021-0.025%的马兜铃酸。
5.权利要求1所述的从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法，其特征在于：所述的鱿鱼缠卵和异丙醇溶液的料液比为1:20-24，所述的异丙醇溶液的浓度为8-12%，所述的浸泡脱脂温度为2-5℃，时间为10-15h。
6.权利要求1所述的从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法，其特征在于：所述的双酶水解步骤为：按料液比1:20-25（w/v）向匀浆缠卵腺中加入pH为9.5-10.5的甘氨酸-NaOH缓冲液，混合均匀，然后在45-50℃水浴中预热10-15min，再按匀浆缠卵腺重量的1.0-1.5%加入碱性蛋白酶，在45-55℃下酶解50-60min，反应结束后灭酶，调整pH至中性，离心，然后将上清液的pH至6.0-7.5，按原料重量的1.0-1.5%中性蛋白酶，再加入聚六亚甲基胍，在45-50℃下酶解3-6h后灭酶，得酶解液。
7.权利要求6所述的从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法，其特征在于：所述的双酶水解步骤中聚六亚甲基胍的添加量为中性蛋白酶重量0.25-0.30%。
8.权利要求1所述的从鱿鱼缠卵腺中提取抗氧化活性多肽的方法，其特征在于：所述的分离纯化步骤为：将酶解液经截留分子量为3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于3kDa组分，得到超滤酶解液，然后将超滤酶解液依次经凝胶柱层析、离子交换树脂层析和反相高效液相色谱纯化，即得抗氧化活性多肽。
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