CN110759969A - 一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鱿鱼寡肽的制备技术领域，为进一步提升北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽的提取率，本发明方法在前期研究基础上，提供了一种北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽的提取方法，使用离子液体EMIMBF4与γ‑丁内酯按1:1混合制成复配溶剂处理鱿鱼内脏组织，并在‑50～‑60℃低温协同脉冲电场处理，然后再碱性蛋白酶酶解，提高了北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽的提取率，相比前期研究可以提升12.14%～13.66%，而且北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽的生物活性也有一定程度的提高。

Description

一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法
技术领域
本发明涉及鱿鱼寡肽的制备技术领域，具体涉及一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法。
背景技术
鱿鱼是海洋生物中重要的头足类动物，其生长周期短、繁殖能力强及资源恢复迅速，是一种可持续发展的海洋渔业资源。近年随着国内外深海捕捞技术的发展，鱿鱼业已成为中国主要的远洋捕捞和水产加工品种。目前，中国年鱿鱼加工量达40～50万t，居世界第一位，加工品种主要为阿根廷鱿鱼、北太平洋鱿鱼和秘鲁鱿鱼。在鱿鱼的加工过程中，一般对其胴体进行加工，产生约有35％的鱿鱼头、内脏及表皮等下脚料。其中生殖腺(缠卵腺、精巢、卵巢等)占内脏的20％，这些内脏副产物通常被加工成饲料，鱿鱼缠卵腺等通常只作烹饪食用，生物附加值低并且未及时处理会对环境造成一定的污染。本申请的发明人团队从开发鱿鱼下胶料、提升鱿鱼附加值角度出发，以北太平洋鱿鱼缠卵腺为原料，提取制备了一种鱿鱼缠卵腺寡肽，见中国专利申请CN201710160710.4，专利名称“一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法”，所得寡肽分子量497.50Da，氨基酸序列为Ala-Tyr-Ala-Ser-Ser，属于短肽，具有抗氧化特性，可以作为抗氧化药品、功能食品进行进一步研发，见中国专利申请201710160381.3，发明名称“一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽”，具有积极的应用前景。因此如何深化课题研究，进一步北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制取方法，提高提取效率，并相应的提升生物活性，具有重要的意义。
目前动物多肽的提取方法有匀浆、超声波、酶解等。由于离子液体表现的良好溶剂特性，目前也有用离子液体进行多肽提取的研究，但是离子液体低温下粘度增加，非常不利于操作。清华大学的骞伟中课题组在超级电容器的研究中发现，将离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1复配得到的二元体系可以保持较低的玻璃态温度，将超级电容器的工作温度下探至-70℃，表现了较好的低温特性。但是目前还未出现将这种二元体系应用在多肽提取上的研究。发明人团队在前期研究基础上，根据北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽的低分子量特点，开展这种二元体系在北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽提取方面的研究，提升北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽的提取率。
发明内容
为进一步提升北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽的提取率，本发明方法提供了一种北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽的提取方法，将离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1复配得到的二元体系应用在北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备上，达到提高北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽的提取率的目的。
本发明提供如下的技术方案：
一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，所述被太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的氨基酸序列为Ala-Tyr-Ala-Ser-Ser，包括以下步骤：
(1)取北太平洋鱿鱼缠卵腺捣碎后匀浆处理得到匀浆液；
(2)将匀浆液与复配溶剂按料液比1:2～5混合均匀获得浸泡液，所用复配溶剂为离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1混合制成；
(3)降低浸泡液温度至-50～-60℃的低温，向浸泡液中通入脉冲电场处理，然后升至室温；
(4)离心分离步骤(3)处理后的浸泡液，回收上清液，去离子水洗涤固体并离心得破碎物；
(5)向破碎物中加入碱性蛋白酶溶液处理得到酶解液，灭酶活性，离心分离；
(6)将步骤(5)中离心分离后的上清液经0.22μm滤膜过滤后，超滤膜处理，截留分子量在3～5kDa的分子段产物得到粗肽液；
(7)将粗肽液经层析分离，收集第一个峰对应的组份，然后经HPLC分离纯化，冷冻干燥，得到北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽。
作为本发明方法的优选，步骤(3)中的脉冲电场处理方法为：脉冲数为300～400次，电场强度15～25kV/cm，脉冲宽度为50～60μs，脉冲频率1500～2000Hz，浸泡液在低温保持时间为7～8小时。
作为本发明方法的优选，步骤(4)中将浸泡液离心分离3～5次，然后去离子水洗涤3～5次并离心分离。
作为本发明方法的优选，步骤(5)中碱性蛋白酶液的酶解时间5～8小时，酶解温度为35～50℃，料液比1:3～6，pH值为7～10，酶加入量为2000～3500U/g。
作为本发明方法的优选，步骤(5)中碱性蛋白酶液的酶解时间7小时，酶解温度为50℃，料液比1:6，pH值为9，酶加入量为3500U/g。
作为本发明方法的优选，步骤(7)中所用层析柱为聚葡糖层析柱Sephadex G25柱，洗脱波长280nm。
作为本发明方法的优选，步骤(7)中HPLC所用色谱柱为Zorbax SB-C18色谱柱，色谱分离波长219nm。
作为本发明方法的优选，离心分离的温度为在0～4℃，离心转速10000～12000r/min。
本发明的北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，依据这种寡肽小分子量、短肽的特点，在前期专利申请CN201710160710.4的基础上，将离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按1:1混合制成复配溶剂，然后加入到匀浆液中提取北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽，利用离子液体EMIMBF4的良好溶剂特性来溶解脂质，破坏北太平洋鱿鱼缠卵腺的细胞组织。在此基础上，一方面降低温度至-50～-60℃，利用低温效果来强化细胞组织破坏；另一方面，在低温环境下引入脉冲电场，利用脉冲电场的高强度冲击强化对细胞组织的破坏，同时降低脉冲电场产生的臭氧环境对蛋白质的影响。更重要的是，离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按1:1的二元体系在低温下仍可以保持良好的通电特性和流动性，而北太平洋鱿鱼缠卵腺浸泡在这种二元体系中，当施加脉冲电场时，二元体系的通电特性可以反过来增强脉冲电场效果。在低温保持结束后10～20min的时间内迅速升温至室温，这样利用复合溶剂的急剧热胀效应进一步强化对细胞组织的破坏。这样处理后的缠卵腺破碎物可以直接使用碱性蛋白酶酶解，使蛋白质得到充分分解，非常适合分子量小的短分子肽的制备，所得北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽的提取率比原提取方法提升12.14％～13.66％，北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽的抗氧化活性也有一定程度的提高。
本发明的有益效果如下：
本发明的北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽制备方法中加入离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按1:1混合制成复配溶剂，低温协同脉冲电场处理，然后再碱性蛋白酶酶解，提高了北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽的提取率，而且寡肽的生物活性也有一定程度的提高。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
对比例1
一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，以专利申请CN201710160710.4中公开的最优结果的制备方法为对比例1，即：
(1)取北太平洋鱿鱼缠卵腺捣碎匀浆，加入碱性蛋白酶，在温度50℃、加酶量3500U/g、pH值9.0、料液比为1：6条件下酶解7h，然后灭活，在4℃、12000r/min的条件下离心；
(2)取步骤(1)所得上清液，超滤截留分子量为3-5KD分子段的超滤组分；
(3)取超滤组分进行琼脂糖凝胶层析分离，收集280nm处出现三个峰中的第一个峰的组分；
(4)取第一个峰的组分过HPLC进一步分离得到北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽，经测序氨基酸序列为Ala-Tyr-Ala-Ser-Ser，分子量为497.50Da，属短分子肽；相应的制备方法也可见专利申请CN201710160381.3，发明名称“一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽”或者论文文献“北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备”(刘倩茹等，湖北农业科学，2018.7，57(13):70～74)。
实施例1
一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)取北太平洋鱿鱼缠卵腺捣碎后匀浆处理得到匀浆液；
(2)将匀浆液与复配溶剂按料液比1:5混合均匀获得浸泡液，所用复配溶剂为离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1混合制成；
(3)降低浸泡液温度至-60℃，向浸泡液中通入脉冲电场处理，脉冲数为300次，电场强度25kV/cm，脉冲宽度为60μs，脉冲频率1500Hz，浸泡液在-60℃低温保持8小时，结束后5min内快速升至室温23±2℃；
(4)将步骤(3)处理后的浸泡液在4℃离心分离5次，回收每次分离的上清液，去离子水洗涤残留的固体5次，并离心分离得到破碎物，离子转速12000r/min；
(5)向破碎物中加入碱性蛋白酶溶液处理得到酶解液，酶解温度为40℃，料液比1:3，pH值为9，酶加入量为3000U/g，酶解8小时，酶解结束后灭酶活性，离心分离；
(6)将步骤(5)中离心分离后的上清液经0.22μm滤膜过滤后，超滤膜处理，截留分子量在3～5kDa的分子段产物得到粗肽液；
(7)将粗肽液经聚葡糖层析柱Sephadex G25柱层析分离，洗脱波长280nm，收集第一个峰对应的组份，然后经HPLC分离纯化，HPLC所用色谱柱为Zorbax SB-C18色谱柱，色谱分离波长219nm，冷冻干燥，得到北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽，经测序氨基酸序列为Ala-Tyr-Ala-Ser-Ser，分子量为497.50Da，属短分子肽，与对比例1相比，提取率提升12.68％。
实施例2
一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)取北太平洋鱿鱼缠卵腺捣碎后匀浆处理得到匀浆液；
(2)将匀浆液与复配溶剂按料液比1:3混合均匀获得浸泡液，所用复配溶剂为离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1混合制成；
(3)降低浸泡液温度至-50℃，向浸泡液中通入脉冲电场处理，脉冲数为360次，电场强度22kV/cm，脉冲宽度为50μs，脉冲频率2000Hz，浸泡液在-50℃低温8小时，结束后10min内快速升至室温23±2℃；
(4)将步骤(3)处理后的浸泡液在4℃离心分离3次，回收每次分离的上清液，去离子水洗涤残留的固体3次，并离心分离得到破碎物，离子转速12000r/min；
(5)向破碎物中加入碱性蛋白酶溶液处理得到酶解液，酶解温度为50℃，料液比1:6，pH值为7，酶加入量为3500U/g，酶解7小时，酶解结束后灭酶活性，离心分离；
(6)将步骤(5)中离心分离后的上清液经0.22μm滤膜过滤后，超滤膜处理，截留分子量在3～5kDa的分子段产物得到粗肽液；
(7)将粗肽液经聚葡糖层析柱Sephadex G25柱层析分离，洗脱波长280nm，收集第一个峰对应的组份，然后经HPLC分离纯化，HPLC所用色谱柱为Zorbax SB-C18色谱柱，色谱分离波长219nm，冷冻干燥，得到北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽，经测序氨基酸序列为Ala-Tyr-Ala-Ser-Ser，分子量为497.50Da，属短分子肽，与对比例1相比，提取率提升13.66％。
实施例3
一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)取北太平洋鱿鱼缠卵腺捣碎后匀浆处理得到匀浆液；
(2)将匀浆液与复配溶剂按料液比1:2混合均匀获得浸泡液，所用复配溶剂为离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1混合制成；
(3)降低浸泡液温度至-55℃，向浸泡液中通入脉冲电场处理，脉冲数为400次，电场强度15kV/cm，脉冲宽度为57μs，脉冲频率1500Hz，浸泡液在-55℃低温保持7小时，结束后13min内快速升至室温23±2℃；
(4)将步骤(3)处理后的浸泡液在0℃离心分离4次，回收每次分离的上清液，去离子水洗涤残留的固体4次，并离心分离得到破碎物，离子转速10000r/min；
(5)向破碎物中加入碱性蛋白酶溶液处理得到酶解液，酶解温度为35℃，料液比1:5，pH值为10，酶加入量为2000U/g，酶解5小时，酶解结束后灭酶活性，离心分离；
(6)将步骤(5)中离心分离后的上清液经0.22μm滤膜过滤后，超滤膜处理，截留分子量在3～5kDa的分子段产物得到粗肽液；
(7)将粗肽液经聚葡糖层析柱Sephadex G25柱层析分离，洗脱波长280nm，收集第一个峰对应的组份，然后经HPLC分离纯化，HPLC所用色谱柱为Zorbax SB-C18色谱柱，色谱分离波长219nm，冷冻干燥，得到北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽，经测序氨基酸序列为Ala-Tyr-Ala-Ser-Ser，分子量为497.50Da，属短分子肽，与对比例1相比，提取率提升12.14％。
对比例2
该对比例2的北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽与实施例3的不同之处在于，步骤(3)中将浸泡液置于室温23±2℃下引入脉冲电场，所得北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽，经测序氨基酸序列为Ala-Tyr-Ala-Ser-Ser，分子量为497.50Da，属短分子肽，与对比例1相比，提取率提升5.22％。
对比例3
该对比例3的北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽与实施例3的不同之处在于，步骤(3)中在浸泡液中引入脉冲电场，并在-55℃保持7小时结束后，自然升温至室温23±2℃，经测序，所得北太平洋缠卵腺抗氧化酶解寡肽氨基酸序列为Ala-Tyr-Ala-Ser-Ser，分子量为497.50Da，属短肽，与对比例1相比，提取率提升8.46％。
北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的抗氧化活性测试
测试方法见上述论文文献的1.3.4节部分，配置上述实施例和对比例所得寡肽的溶液，浓度为0.5mol/L，测试对DPPUH的清除率，结果见表1所示。
表1，北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽对DPPH的清除效果。
Figure BDA0002232968570000061

Claims (8)

1.一种北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，所述被太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的氨基酸序列为Ala-Tyr-Ala-Ser-Ser，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取北太平洋鱿鱼缠卵腺捣碎后匀浆处理得到匀浆液；
（2）将匀浆液与复配溶剂按料液比1:2～5混合均匀获得浸泡液，所用复配溶剂为离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1混合制成；
（3）降低浸泡液温度至-50～-60℃的低温，向浸泡液中通入脉冲电场处理，然后升至室温；
（4）离心分离步骤（3）处理后的浸泡液，回收上清液，去离子水洗涤固体并离心得破碎物；
（5）向破碎物中加入碱性蛋白酶溶液处理得到酶解液，灭酶活性，离心分离；
（6）将步骤（5）中离心分离后的上清液经0.22μm滤膜过滤后，超滤膜处理，截留分子量在3～5kDa的分子段产物得到粗肽液；
（7）将粗肽液经层析分离，收集第一个峰对应的组份，然后经HPLC分离纯化，冷冻干燥，得到青蛤多肽。
2.根据权利要求1所述的北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，其特征在于，步骤（3）中的脉冲电场处理方法为：脉冲数为300～400次，电场强度15～25kV/cm，脉冲宽度为50～60μs，脉冲频率1500～2000Hz，浸泡液在低温保持时间为7～8小时。
3.根据权利要求1所述的北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，其特征在于，步骤（4）中将浸泡液离心分离3～5次，然后去离子水洗涤3～5次并离心分离。
4.根据权利要求1所述的北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，其特征在于，步骤（5）中碱性蛋白酶液的酶解时间5～8小时，酶解温度为35～50℃，料液比1:3～6，pH值为7～10，酶加入量为2000～3500 U/g。
5.根据权利要求1或4所述的北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，其特征在于，步骤（5）中碱性蛋白酶液的酶解时间7小时，酶解温度为50℃，料液比1:6，pH值为9，酶加入量为3500 U/g。
6.根据权利要求1所述的北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，其特征在于，步骤（7）中所用层析柱为聚葡糖层析柱Sephadex G25柱，洗脱波长280nm。
7.根据权利要求1所述的北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，其特征在于，步骤（7）中HPLC所用色谱柱为Zorbax SB-C18色谱柱，色谱分离波长219nm。
8.根据权利要求1所的北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备方法，其特征在于，离心分离的温度为在0~4℃，离心转速10000～12000 r/min。
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