CN109938156A

CN109938156A - 利用超声-离子液体处理制备低抗原性乳清蛋白酶解产物的方法

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Publication number: CN109938156A
Application number: CN201910220439.8A
Authority: CN
Inventors: 何国庆; 张琦; 陈启和
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2019-06-28
Anticipated expiration: 2039-03-22
Also published as: CN109938156B

Abstract

本发明公开了一种利用超声‑离子液体处理制备低抗原性乳清蛋白酶解产物的方法，包括：在乳清蛋白溶液中加入离子液体，进行超声处理，离心分离，取乳清蛋白层；将乳清蛋白层复溶于水，然后加入蛋白酶进行水解，水解完成后离心分离，收集上清液，冷冻干燥，得到低抗原性乳清蛋白酶解产物。本发明方法简单易行，制备得到的乳清蛋白水解产物不仅抗原性低、安全无毒，而且小分子肽含量更高，易于推广应用。

Description

利用超声-离子液体处理制备低抗原性乳清蛋白酶解产物的方法

技术领域

本发明涉及生物工程和食品免疫学技术领域，尤其涉及一种利用超声-离子液体处理制备低抗原性乳清蛋白酶解产物的方法。

背景技术

食物过敏是全世界广泛关注的公共健康问题之一，牛乳是联合国粮农组织(FAO)认定的八大类主要过敏食物之一，其引起的过敏严重威胁婴幼儿健康，严重时甚至导致死亡。食品法典委员会(CAC)、美国以及欧盟等的标签法明确要求必须在食品标签上明确标示牛奶过敏原。牛乳过敏是由牛乳蛋白引起的一种不良反应，主要是由IgE介导的免疫反应，可引起过敏性鼻炎、哮喘、湿疹、腹泻、胃肠出血等症状。据调查显示，学龄前儿童对牛乳过敏占0.6％～2.5％，5～16岁人群占0.3％，成年人小于0.5％。对婴幼儿来说，牛乳过敏是最常见的过敏疾病，发病率高达2％～7.5％。

近年来，乳清蛋白(WP)因为其高营养价值和功能特性的优势备受功能性食品产业的关注，浓缩乳清蛋白(WPI)已成为制造附加值产品的重要成分，包括各种乳制品、婴幼儿配方奶粉、运动营养食品、肉类、面包、糖果等等。然而，WP中的两种主要成分β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，BLG；55-60％)和α-乳白蛋白(α-lactalbumin，ALA；25％)也是引起儿童过敏反应的主要过敏原蛋白。过去十年的研究报道中，酶解乳清蛋白法由于其条件温和、可行性高而颇受青睐，与热加工的结合也被广泛应用。

热加工主要是利用高温对牛乳进行处理，使乳蛋白结构和功能发生改变，但同时容易导致蛋白变性、营养成分流失。而非热加工处理不仅能够使蛋白改性，又能维持乳蛋白原有的感官品质和营养成分，这是热加工无法比拟的优势。

离子液体是一类由体积相对较大、结构不对称的有机阳离子和体积相对较小的无机阴离子构成的盐类物质，是继“超临界流体”和“双水相”之后的第三种绿色溶剂，由于它的良溶性、不挥发、热稳定及化学惰性等特点，已被逐渐应用于医药、化妆品、制药及食品等方面。在用离子液体对蛋白质进行预处理时，会使蛋白质的结构发生伸展和重聚，令蛋白质聚集体变得疏松，使其在酶解过程中底物与酶的结合率增加，从而提高了蛋白质酶解效率。然而，离子液体的高粘度(通常比常规有机溶剂高2-3个数量级)会导致反应过程中的一些传质被限制。超声技术在食品工业中已经被普遍应用，液体在超声波作用下会产生声空化现象、机械力及热效应，不仅可以增强液-液系统中的传质，并且也会对蛋白质的结构产生影响。

因此，研究超声波与离子液体的联合处理在促进酶解反应中的作用值得我们关注，本发明在前人研究的基础上，研究了超声波-离子液体处理对乳清蛋白水解度及其产物抗原性的影响，以期为开发低敏性乳制品提供新的思路和方向。

发明内容

本发明提供了一种利用超声-离子液体处理制备低抗原性乳清蛋白酶解产物的方法，简单易行，安全无毒，蛋白质水解度较高，且产物中小分子肽含量较高，抗原性低。

一种利用超声-离子液体处理制备低抗原性乳清蛋白酶解产物的方法，包括：

(1)在乳清蛋白溶液中加入离子液体，进行超声处理，离心分离，取乳清蛋白层；

(2)将乳清蛋白层复溶于水，然后加入蛋白酶进行水解，水解完成后离心分离，收集上清液，冷冻干燥，得到低抗原性乳清蛋白酶解产物；

其中，所述离子液体为1-丁基-3-甲基六氟磷酸盐、1-甲基-3-辛基六氟磷酸盐中的至少一种；

所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的至少一种。

离子液体会使蛋白质的结构发生伸展和重聚，令蛋白质聚集体变得疏松，使其在酶解过程中底物与酶的结合率增加，从而提高了蛋白质酶解效率。超声处理不仅可以增强液-液系统中的传质，并且也会对蛋白质的结构产生影响。

步骤(1)中，所述乳清蛋白可以为浓缩乳清蛋白(whey protein concentrate)WPC80。

所述离子液体可以为1-丁基-3-甲基六氟磷酸盐([BMIM]PF₆)。

所述乳清蛋白溶液的质量浓度可以为5-15％(w/v)，优选为10％(w/v)。

所述乳清蛋白溶液与离子液体的体积比可以为1∶1-1∶2；优选为1∶1，该条件下，乳清蛋白溶液与离子液体接触充分，且后续易于分离，成本较低。

所述超声功率可以为200-500W。当功率在300W以上时处理效果不再有显著提高，故超声功率优选为300W。

所述超声处理时间可以为10-25min，当时间在15min以上时处理效果不再有显著提高，故超声处理时间优选为15min。

步骤(2)中，以每克乳清蛋白计，所述蛋白酶的添加量为1000-1500个酶活单位(U)。

蛋白酶的种类对于水解产物的组成影响较大。所述水解条件依据所用蛋白酶的最适pH和最适温度进行。

优选地，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶，水解体系pH值为6-7，水解温度为55-65℃，水解时间为3-5h。木瓜蛋白酶的酶活力可以为7000-8000u/g。以每克乳清蛋白计，所述木瓜蛋白酶的添加量为0.125-0.214g。

本发明还提供了一种采用上述方法制备得到的低抗原性乳清蛋白酶解产物。该酶解产物中1486Da以下肽段含量为96.45％，BLG抗原性下降89.3％，ALA抗原性下降91.3％。

本发明还提供了上述低抗原性乳清蛋白酶解产物在乳制品制备中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以乳清蛋白为底物、以蛋白酶为水解酶、以超声-离子液体联合处理为前处理方法进行水解制备乳清蛋白酶解产物，制备方法简单易行，安全无毒，蛋白质水解度较高，且酶解产物中小分子肽含量较高，抗原性低，增强了产物的易消化性，具推广应用价值。

附图说明

图1为本发明利用超声-离子液体处理制备低抗原性乳清蛋白酶解产物的方法流程图。

图2为蛋白质分子量检测中标准品的图谱。

图3为实施例1中获得的产物样品的蛋白质纯化图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例中所使用的离子液体为1-丁基-3-甲基六氟磷酸盐([BMIM]PF₆)，购买于国家标准物质网；浓缩乳清蛋白WPC80购于河南和田食品有限公司。

实施例1

(1)超声-离子液体处理乳清蛋白：将浓缩乳清蛋白WPC80配制成质量浓度为10％(w/v)的溶液，加入等体积[BMIM]PF₆溶液，将超声探头浸入水相，在300W超声功率下处理15min，处理后的样品3000r/min离心10min，除去水相，取乳清蛋白层，回收下层离子液体。

(2)水解乳清蛋白：将乳清蛋白配制成10％(w/v)的溶液，体系pH为6.5，温度55℃，以酶活/底物比值1000u/g加入蛋白酶，水解3h，过程中维持溶液pH和温度恒定，每0.5h取样，立即90℃水浴灭酶5min，12000r/min转速下离心15min，收集上清液，用于后续测定。

(3)水解度(DH)测定：将酶解液稀释100倍，取600μL样品加入含4.5mLOPA溶液的试管中，混匀，精确反应2min后，测定OD₃₄₀。配制不同浓度的丝氨酸标准溶液与OPA反应，测定OD₃₄₀，制作标准曲线。

其中，以250mL体积计，OPA溶液由以下组分构成：9.525g四硼酸钠，250mg十二烷基硫酸钠，200mg邻苯二甲醛，220mg二硫苏糖醇。

经测定，水解度为22.65％，如表1所示。

(4)分子量分布测定：采用AKTApure蛋白纯化仪检测水解产物的相对分子质量分布。

水解后，将样品稀释50倍，微孔滤膜过滤后进样。并以抑肽酶(Mw 6511Da)、杆菌肽锌(Mw 1486Da)、氧化型谷胱甘肽(Mw 612Da)、酪氨酸(Mw 181Da)为标准品，测定样品中肽段的分布情况。

其中，层析条件为：层析柱：Superdex peptide 10/300GL；流动相体积比：乙腈+TFA+水＝30+30+40；检测波长：215nm；流速：0.5mL/min。

经测定，1486Da以下肽段含量为96.45％，如表1所示。

(5)抗原性测定：采用夹心式酶联免疫吸附法(ELISA)测定酶解乳清蛋白中两种过敏原的抗原性。将β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的ELISA试剂盒从冷藏温度取出后在室温下平衡15-30min。将样品稀释至适宜浓度，12000r/min离心15min后进行测定。

经测定，BLG抗原性下降89.3％，ALA抗原性下降91.3％。

表1实施例1用于水解蛋白酶种类、水解度、短肽含量及抗原性下降率

实施例2-4

(2)水解乳清蛋白：将乳清蛋白配制成10％(w/v)的溶液，依据最适pH和温度，以酶活/底物比值1000u/g分别加入碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶，水解3h，过程中维持溶液pH和温度恒定，每0.5h取样，立即90℃水浴灭酶5min，12000r/min转速下离心15min，收集上清液，用于后续测定。

(3)水解度(DH)测定：将酶解液稀释100倍，取600μL样品加入含4.5mLOPA溶液的试管中，混匀，精确反应2min后，测定OD340。配制不同浓度的丝氨酸标准溶液与OPA反应，测定OD₃₄₀，制作标准曲线。

实施例2-4的水解度，如表2所示。

实施例2-41486Da以下肽段含量，如表2所示。

实施例2-4BLG抗原性下降率、ALA抗原性下降率，如表2所示。

表2实施例2-4用于水解蛋白酶种类、水解度、短肽含量及抗原性下降率

由实施例1-4结果可以看出，以浓缩乳清蛋白为底物，加入离子液体[BMIM]PF₆，在300W超声功率下处理15min后，加入木瓜蛋白酶进行水解，pH 6.5、温度55℃条件下水解至少3h后，得到的水解产物性能最佳，水解度为22.65％；1486Da以下肽段含量为96.45％；BLG抗原性下降89.3％，ALA抗原性下降91.3％。

Claims

1.一种利用超声-离子液体处理制备低抗原性乳清蛋白酶解产物的方法，包括：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离子液体为1-丁基-3-甲基六氟磷酸盐。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乳清蛋白溶液的质量浓度为5-15％。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乳清蛋白溶液与离子液体的体积比为1∶1-1∶2。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超声功率为200-500W；超声处理时间为10-25min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，以每克乳清蛋白计，所述蛋白酶的添加量为1000-1500个酶活单位。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述水解体系pH值为6-7，水解温度为55-65℃，水解时间为3-5h。

9.一种采用如权利要求1所述的方法制备得到的低抗原性乳清蛋白酶解产物。

10.如权利要求9所述的低抗原性乳清蛋白酶解产物在乳制品制备中的应用。