CN104946715A - 高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供了高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质工艺，该具体过程为：步骤a，原料及预处理；步骤b，打浆；步骤c，均质；步骤d，高压脉冲电场预处理；步骤e，酶解提取；步骤f，分离；步骤g，除腥；步骤h，浓缩；步骤i，干燥。该工艺设置3个变量：电场强度、脉冲数和酶解时间；利用design expert软件根据Box-Behnken设计优化出最佳提取工艺为电场强度19.29kV/cm，脉冲数8.12个，酶解时间2.07h，河蚌蛋白提取率预测值为77.1417％。本发明以松花江野生河蚌肉为原料，利用高压脉冲电场辅助木瓜蛋白酶解提取河蚌蛋白质，工艺简单、条件温和，提取率高。野生河蚌资源丰富，价格低廉仅为打捞成本0.5元/斤。河蚌肉提取蛋白粉营养价值高，应用广，具有广阔的应用开发前景。

Description

高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质工艺

技术领域：本发明涉及河蚌蛋白质的高压脉冲电场辅助酶解提取技术，特别是涉及利用响应曲面优化河蚌蛋白质提取条件的方法。

背景技术：河蚌，是贝壳类水生动物的一种，属瓣腮纲、珍珠科，是中国特有资源。河蚌早在医学记载就可用于清热消炎，具有明目、除湿、止消渴的功效，且可滋阴养肝，并具有降血糖、降血脂、提高免疫力、抗衰老等保健作用。现代研究表明，河蚌肉高蛋白、低脂肪，富含人体必需多种氨基酸、不饱和脂肪酸和矿物元素。因此，河蚌肉可作为食材和药材为人体利用，具有良好保健功效，具有重要的研究价值和广阔的应用前景。

近年来，国内外关于肉类蛋白的研究较多，但大多集中在牛肉、鸡肉、猪肉、鱼肉等蛋白的开发研究，关于河蚌蛋白的研究鲜有报道。国内河蚌养殖业逐渐扩大，季节性较强，且易于腐败变质，运输贮藏困难，严重影响蚌肉消费，有相当一部分被直接丢弃，造成资源浪费。蚌肉本身腥味较重，且肉质较粗韧，烹饪后口感较硬，味道欠佳，使得蚌肉直接食用和开发利用受到一定的限制。因此，以蚌肉为原料，开发营养价值高的河蚌蛋白粉，不仅可以充分利用国内河蚌资源，且可满足人们日益增长的消费需求，研究开发潜力较大。

目前，肉类蛋白提取方法主要有盐法、酸碱法、酶解法等。盐提法易于操作，由于浸提液pH值接近中性，对蛋白质破坏较小，但提取效率较低，耗时长；酸碱法是利用其pH值偏离蛋白质等电点来提取的，提取效率较高，但酸碱消耗量较大，且反应环境过酸或过碱会使蛋白质可解离基团发生改变，使蛋白质构象发生不可逆转变；酶提法反应条件较温和，对蛋白质破坏较小，提取效率也较高。

发明内容：基于上述现有技术存在的缺陷，本发明旨在提供一种以河蚌肉为原料，利用高压脉冲电场与蛋白酶水解相结合方法提取河蚌蛋白质。该方法工艺简单、提取率高、条件温和、节约资源、耗时少，可实现河蚌肉蛋白质的高效快速提取。

其工艺流程及其控制条件如下：

A.原料及处理：新鲜的河蚌用水清洗其表面泥污，用刀将其剖开，去除蚌壳、蚌泪及内脏组织，取蚌肉用清水清洗干净，沥除其表面水分，-18℃以下冷冻备用。

B.打浆：将冷冻的蚌肉从冰柜中取出，室温下解冻，用打浆机打浆。

C.均质：将打浆后的蚌肉浆液置于胶体磨中均质，得到均一的蚌肉浆液。

D.高压脉冲电场预处理：底物浓度以蚌肉中总蛋白含量计算，加入一定比例的蒸馏水，调节底物浓度为4％，将料液混合均匀，以10mL/min流速经蠕动泵泵送高压脉冲电场处理室，电场强度15-25kV/cm，脉冲数6-10个。

E.酶解提取：调节经高压脉冲电场预处理后的浆液pH至5.5，加入酶活4000U/g蛋白质的木瓜蛋白酶，搅拌均匀后于50℃恒温水浴振荡器中酶解反应1.5-2.5h，酶解过程中保持反应体系pH值恒定在5.5左右，反应结束后迅速于沸水浴中加热10-15min以使酶失活，灭酶后将反应物置于冷水中冷却至室温。

F.分离：将经灭酶和冷却后的蚌肉酶解液置于低速离心机中离心(4000r/min，10min)，取上清液，即为蚌肉蛋白提取液。

G.除腥：在蚌肉蛋白提取液中加入1％(质量体积比)活性干酵母，混合均匀后，于35℃恒温水浴振荡器中反应60min，将经除腥处理后的反应物进行离心分离(10000r/min,10min)，上清液即为除腥后的蚌肉蛋白提取液。

H.浓缩：将得到的除腥后的蚌肉蛋白提取液置于旋转蒸发仪中，在50℃条件下减压浓缩至可溶性固形物含量为15％-25％，即为蚌肉蛋白浓缩液。

I.干燥：将蚌肉蛋白浓缩液经喷雾干燥后即得河蚌蛋白粉。

本发明具有以下优点和效果：

1.本发明以松花江野生河蚌肉为原料，对合理利用野生河蚌资源，变废为宝，提高产品附加值、扩大淡水资源开发及节能环保具有重要的现实意义和深远的社会意义；

2.本发明首次采用高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质，使河蚌肉中蛋白质更易溶出提取，真正达到高效提取。

3.本发明得到的河蚌蛋白质，可作为一种新资源食品添加剂应用于食品、饮料、蛋白粉冲剂和保健食品等各领域。

附图说明：

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是电场强度变化对蛋白提取率的影响规律图；

图2是脉冲数变化对蛋白提取率的影响规律图；

图3是酶解时间变化对蛋白提取率的影响规律图。

具体实施方式

实施例1、高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质工艺响应面优化试验

1、样品准备与试验过程

(1)新鲜河蚌用水清洗其表面泥污，用刀将其剖开，去除蚌壳、蚌泪及内脏组织，取蚌肉用清水清洗干净，沥除其表面水分，用打浆机打浆，将打浆后的蚌肉浆液置于胶体磨中均质，得到均一的蚌肉浆液，即为河蚌肉样品。

(2)称取25g河蚌肉样品，加入一定比例蒸馏水，使反应体系中总蛋白浓度为4％，将样液用蠕动泵以10mL/min流速泵送高压脉冲电场处理室，在一定的电场强度(kV/cm)和脉冲数(个)条件下进行脉冲电场处理。

(3)调节pH至5.5，加入4000U/g木瓜蛋白酶，混匀后置于50℃恒温水浴振荡器中酶解1.5-2.5h，酶解过程中保持反应体系pH值恒定在5.5左右，反应结束后迅速于沸水浴中灭酶10min，并将反应物置于冷水中冷却至室温。

(4)离心(4000r/min、10min)取上清液，用蒸馏水将上清液稀释到一定倍数，用双缩脲法测定上清液中可溶性蛋白浓度。

(5)蛋白提取率计算公式为：蛋白提取率(％)＝[测得的可溶性蛋白浓度×稀释倍数×上清液体积/蚌肉质量×蚌肉蛋白含量]×100％。

2、试验设计与统计分析

(1)单因素试验

以电场强度、脉冲数、酶解时间为主要影响因素，河蚌蛋白提取率为指标进行单因素试验，每次试验平行测定三次，取其平均值。

(2)响应面法优化设计

根据单因素试验结果，选取对蛋白提取效果影响较显著的电场强度、脉冲数、酶解时间这三个因素，根据Box-Behnken设计原则设计试验，并利用designexpert软件进行数据处理，建立二次多项回归模型，对试验结果进行预测分析。Box-Behnken设计因素水平表如表1。

表1响应面设计试验变量与编码表

以电场强度(X₁)、脉冲数(X₂)和酶解时间(X₃)为自变量，以河蚌蛋白提取率为响应值(Y)，试验方案及结果见表2。试验点1-12为析因点，13-17是零点。

表2响应面设计方案及试验结果

(3)模型的建立和统计分析

对所得数据进行多元回归分析，得到响应变量(电场强度、脉冲数和酶解时间)与响应值(蛋白提取率)之间的二次多项回归方程：

Y＝-2.65+3.32575X₁+4.18312X₂+29.63X₃+0.0175X₁X₂-0.167X₁X₃

-0.2575X₂X₃-0.0809X₁ ²-0.24562X₂ ²-5.86X₃ ²

F检验可判定各因子与响应值之间线性关系显著性，P值越小，说明变量越显著。由方差分析表(表3)可知，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著(R²＝0.9931)，模型的显著水平小于0.0001，所以该回归方差模型极显著。

表3响应面二次回归模型方差分析表

(4)试验结果分析与优化

模型分析可知，高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质最佳工艺参数：电场强度19.29kV/cm，脉冲数8.12个，酶解时间2.07h，在此条件下预测的蛋白提取率可达到77.1417％。

试验1、高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质过程试验

(1)新鲜河蚌用水清洗其表面泥污，用刀将其剖开，去除蚌壳、蚌泪及内脏组织，取蚌肉用清水清洗干净，沥除其表面水分，用打浆机打浆，将打浆后的蚌肉浆液置于胶体磨中均质，得到均一的蚌肉浆液，即为河蚌肉样品。

(2)称取25g河蚌肉样品，加入一定比例蒸馏水，使反应体系中总蛋白浓度为4％，将样液用蠕动泵以10mL/min流速泵送高压脉冲电场处理室，在一定的电场强度(kV/cm)和脉冲数(个)条件下进行高压脉冲电场处理。

(3)调节pH至5.5，加入4000U/g木瓜蛋白酶，混匀后置于50℃恒温水浴振荡器中酶解1.5-2.5h，酶解过程中保持反应体系pH值恒定在5.5左右，反应结束后迅速于沸水浴中灭酶10min，并将反应物置于冷水中冷却至室温。

(4)离心(4000r/min、10min)取上清液，用蒸馏水将上清液稀释到一定倍数，用双缩脲法测定上清液中可溶性蛋白浓度，测得河蚌蛋白质提取率为77.08％。

试验2、电场强度变化对蛋白提取率的影响

在脉冲数8个、酶解时间2h的条件下，将电场强度设定为10-35kV/cm共6个变化值；其余同试验1，结果如图1。

当电场强度小于20kV/cm时，河蚌蛋白提取率随电场强度增大而提高，这可能是由于较大电场强度会加快电场中极性溶剂运动速度，溶剂较易在细胞内外运动，胞内物质较易释放出来；另一方面，细胞内外电场强度差异使细胞极化破坏细胞膜，胞内物质释放，与溶剂接触充分，易于反应进行。当电场强度大于20kV/cm时，蛋白提取率下降，这可能是由于当电场强度达到20kV/cm时，已不再有更多胞内物质溶出，溶剂与反应物接触已足够充分，此时再增大电场强度可能会破坏蛋白质结构或使蛋白质变性，降低蛋白提取率。因此，电场强度选择为20kV/cm为最佳值。

试验3、脉冲数变化对蛋白提取率的影响

在电场强度20kV/cm、酶解时间2h的条件下，将脉冲数设定为2-12个共6个变化值；其余同试验1，结果如图2。

当脉冲数小于8个时，河蚌蛋白提取率随着脉冲数增大而提高，这可能是由于增大脉冲数，脉冲电场对料液的作用时间和频率都有所加大，细胞膜的破坏程度也随之增加，提取率增大。当脉冲数大于8个时，蛋白提取率下降，这可能是由于电场作用时间过长，频率过大，较强电场作用使蛋白质发生了一些不可逆的转变，影响蛋白提取率。因此，脉冲数选择8个为最佳值。

4、酶解时间变化对蛋白提取率的影响

在电场强度为20kV/cm、脉冲数为8个的条件下，将酶解时间设定为0.5-3.0h共6个变化值；其余同试验1，结果如图3。

当酶解时间从0.5h增加到1.0h时，河蚌蛋白提取率显著提高，这是由于当酶解时间为0.5h时，作用时间较短，木瓜蛋白酶与料液接触不充分，发挥作用较小；当酶解时间增加到1.0h时，木瓜蛋白酶与料液接触增多，反应迅速进行，蛋白提取率增加幅度较大；酶解时间从1.0h到2.0h增加时，提取率也随之提高，到2.0h时，河蚌蛋白提取率达到最高，再增加酶解时间，河蚌蛋白提取率不再提高，反而略有下降，这可能是因为酶解时间为2.0h时，木瓜蛋白酶已经作用比较充分，使蛋白最大限度进入溶液中，再增加反应时间已经不能使提取率增加，且可能由于过度反应破坏蛋白而降低蛋白提取率。另外，酶解时间过长也会引起酶解液腐败，产生不良风味，随着底物减少，酶活力下降，水解程度也趋于平缓。因此，酶解时间选择2.0h为最佳值。

Claims (5)

1.一种高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质工艺，其特征在于，以河蚌肉为原料，利用高压脉冲电场辅助木瓜蛋白酶酶解河蚌肉蛋白并借助响应面优化提取工艺，其工艺流程和操作步骤如下：

高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质工艺流程：原料及预处理→打浆→均质→高压脉冲电场预处理→酶解提取→分离→除腥→浓缩→干燥→河蚌蛋白粉；

高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质操作步骤与要点如下：

(1)原料及预处理：新鲜的河蚌用水清洗其表面泥污，用刀将其剖开，去除蚌壳、蚌泪及内脏组织，取蚌肉用清水清洗干净，沥除其表面水分，-18℃以下冷冻备用；

(2)打浆：将冷冻的蚌肉从冰柜中取出，室温下解冻，用打浆机打浆；

(3)均质：将打浆后的蚌肉浆液置于胶体磨中均质，得到均一的蚌肉浆液；

(4)高压脉冲电场预处理：底物浓度以蚌肉中总蛋白含量计算，加入一定比例蒸馏水，调节底物浓度为4％，将料液混合均匀，以10mL/min流速经蠕动泵泵送高压脉冲电场处理室，电场强度15-25kV/cm，脉冲数6-10个；

(5)酶解提取：调节经高压脉冲电场预处理后的浆液pH至5.5，加入酶活为4000U/g蛋白质的木瓜蛋白酶，搅拌均匀后于50℃恒温水浴振荡器中酶解反应1.5-2.5h，酶解过程中保持反应体系pH值恒定在5.5左右，反应结束后迅速于沸水浴中加热10-15min以使酶失活，灭酶后将反应物置于冷水中冷却至室温；

(6)分离：将经灭酶和冷却后的蚌肉酶解液置于低速离心机中离心(4000r/min，10min)，取上清液，即为蚌肉蛋白提取液；

(7)除腥：在蚌肉蛋白提取液中加入1％(质量体积比)活性干酵母，混合均匀后，于35℃恒温水浴振荡器中反应60min，将经除腥处理后的反应物进行离心分离(10000r/min,10min)，上清液即为除腥后的蚌肉蛋白提取液；

(8)浓缩：将得到的经除腥后的蚌肉蛋白提取液置于旋转蒸发仪中，在50℃条件下减压浓缩至可溶性固形物含量为15％-25％，即为蚌肉蛋白浓缩液；

(9)干燥：将蚌肉蛋白浓缩液经喷雾干燥后即得河蚌蛋白粉。

2.如权利要求书1所述的高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质工艺，其特征在于，所述反应物中底物(蛋白质)浓度为4％，酶添加量为4000U/g，于50℃、pH5.5条件下酶解1.5-2.5h。

3.如权利要求书1所述的高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质工艺，其特征在于，所述的酶制剂为木瓜蛋白酶，酶活力为1×10⁵U/g，酶加入量为4000U/g蚌肉蛋白质；蛋白酶可作用于蚌肉组织，酶解大分子蛋白，使其降解为可溶性小分子蛋白，且反应条件温和、效率高、时间短、安全性高。

4.如权利要求书1所述的高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质工艺，其特征在于，所述的干燥过程中进料浓度为15-25％，进风温度为170-180℃，进风量为80％，进料速度为8-12mL/min。

5.如权利要求书1所述的高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质工艺，其特征在于，所述的河蚌肉匀浆液经高压脉冲电场辅助酶解设置3个变量(电场强度、脉冲数和酶解时间)，根据Box-Behnken设计原理利用design expert软件进行数据处理及工艺优化。