CN108294163A - 超声波-微波辅助酶解河蚌蛋白工艺 - Google Patents

超声波-微波辅助酶解河蚌蛋白工艺 Download PDF

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周亚军
伊小丽
许雅宁
李江飞
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孙琦
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/04—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from fish or other sea animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products

Abstract

本发明提供了超声波‑微波辅助酶解河蚌蛋白工艺，该工艺设置以下4个变量：料液比、功率、处理时间和酶解时间；利用Design Expert软件根据Box‑Behnken设计方法对酶解工艺进行优化，得到最佳酶解工艺条件为料液比为1:10.18，功率：360.78W，处理时间：6.90min，酶解时间4.00h,在此条件下蚌肉蛋白水解度为48.40％。本发明的目的旨在提供一种以河蚌肉为原料，利用超声波‑微波技术辅助木瓜蛋白酶酶解河蚌蛋白的方法。该方法工艺简单、蛋白水解度高、成本较低，且野生河蚌资源丰富，价格低廉。以野生河蚌肉为原料制备的酶解液营养价值高，具有广阔的应用开发前景。

Description

超声波-微波辅助酶解河蚌蛋白工艺
技术领域：本发明涉及河蚌蛋白的超声波-微波辅助酶解技术，特别是涉及利用响应面优化河蚌蛋白酶解的方法。
背景技术：松花江野生河蚌价格低廉，营养价值高，含有丰富的蛋白质、糖类和矿物质，具有高蛋白、低脂肪的特点，另外还含有丰富的维生素和矿物质(铜、锌)。氨基酸种类齐全，必需氨基酸占氨基酸总量的44.43％，高于WHO/FAO模式的推荐值(35.38％)。另外，据医学记载，河蚌可用于清热消炎、滋阴养肝，并具有降血糖、降血脂等保健作用。因此，河蚌肉可作为食材和药材为人体利用，具有良好保健功效，具有重要的研究价值和广阔的应用前景。
目前对于河蚌蛋白质主要采用单一酶法水解，但是单一酶法水解耗时长，水解率低。而超声波-微波技术是一种辅助技术，它的原理是利用超声波在液体传播时产生的空化作用将细胞破碎，而空化作用还伴随着热效应、化学效应与机械效应。将超声波-微波联合技术与木瓜蛋白酶结合酶解河蚌蛋白，能提高水解效率，但国内外未见报道。
发明内容：基于上述现有技术存在的缺陷，本发明旨在提供一种以河蚌肉为原料，利用超声波-微波辅助木瓜蛋白酶酶解河蚌蛋白质的工艺方法。该方法工艺简单、条件温和、水解度高，可实现蚌肉蛋白的高效酶解。
其工艺流程及控制条件如下：
A.原料及预处理：新鲜的河蚌用清水洗净蚌壳表面污垢，用刀将其剖开，去除蚌壳、蚌泪及内脏组织，取蚌肉并用清水清洗干净，沥除表面水分，于-18℃下冷冻备用；
B.打浆：将蚌肉取出，在室温下解冻，并用打浆机打浆；
C.匀浆：将打浆后的蚌肉浆液于胶体磨中磨碎、均质，得到均一的蚌肉浆液；
D.超声波-微波处理：按料液比1:8，1:10，1:12将河蚌匀浆与水混合均匀，用均质机均质后经超声波-微波处理，功率200～400W，处理时间5～7min；
E.酶解：将经超声波微波处理过的浆液调节pH为6.5，按5000U/g加入木瓜蛋白酶，搅拌均匀后置于恒温水浴振荡器中于50℃下酶解反应4-6h，酶解过程中保持反应体系pH值恒定在6.5左右，反应结束后迅速置于90℃水浴中灭酶10min，灭酶后将反应物置于冷水中冷却至室温；
F.离心：将经灭酶和冷却后的蚌肉酶解液置于低速离心机中离心(4000r/min，20min)，取上清液，即为蚌肉蛋白酶解液。
本发明具有以下优点和效果：
1.本发明以松花江野生河蚌肉为原料，对合理利用野生河蚌资源，提高产品附加值具有重要意义；
2.本发明首次采用超声波-微波辅助酶解河蚌蛋白质，使河蚌肉中的蛋白质更易溶于水中，真正达到高效溶解；
3.本发明得到河蚌蛋白酶解液，可进一步浓缩作为海鲜调味料的反应基液，生产独具风味的河蚌调味料；也可作为食品添加剂应用于食品、饮料等领域。
附图说明
图1料液比对河蚌肉水解度的影响
图2功率对河蚌肉水解度的影响
图3处理时间对河蚌肉水解度的影响
图4酶解时间对河蚌肉水解度的影响
具体实施方式
实施例1、超声波微波辅助酶解河蚌蛋白工艺响应面优化试验
1、样品准备与试验过程
(1)新鲜河蚌用清水冲洗干净，用刀将壳剖开，去除蚌壳、蚌泪及内脏组织，取蚌肉并用清水清洗干净，沥尽表面水分，用打浆机打浆，然后将打浆后的蚌肉浆液置于胶体磨中磨碎、均质，得到均一的蚌肉浆液，即为河蚌肉样品。
(2)称取20g河蚌肉样品，按一定的比例加入蒸馏水并混合均匀，然后将样液置于超声波-微波联用装置内，在一定的功率(W)下处理一定的时间(min)。
(3)调节pH至6.5，加入5000U/g木瓜蛋白酶，混匀后置于50℃恒温水浴振荡器中酶解4-6h，酶解过程中保持反应体系pH值恒定在6.5左右，反应结束后迅速置于90℃水浴中灭酶10min，灭酶后将反应物置于冷水中冷却至室温；
(4)离心(4000r/min，20min)取上清液，用蒸馏水将上清液稀释到一定倍数，用甲醛滴定法测定氨基酸态氮含量。
(5)蛋白质水解度计算公式为：蛋白质水解度(％)＝(测得的酶解液中氨基酸态氮含量/水解前河蚌肉的总氮量)×100％
2、试验设计与统计分析
(1)单因素试验
以料液比、功率、处理时间、酶解时间为主要因素，河蚌蛋白的水解度为指标进行单因素试验，每次试验平行测定三次，取其平均值。
(2)响应面法优化设计
根据单因素试验结果，选取对蛋白质水解度影响较显著的料液比、功率、处理时间、酶解时间这四个因素，根据Box-Behnken设计原则设计试验，并利用Design Expert软件进行数据分析，建立二元多次回归模型，对试验结果进行预测分析。Box-Behnken设计因素水平表如表1。
表1响应面设计试验变量与编码表
以料液比(X1)、功率(X2)、处理时间(X3)和酶解时间(X4)为自变量，以河蚌蛋白质水解度为响应值(Y)，试验方案及结果见表2。
表2响应面设计方案及试验结果
(3)模型的建立与统计分析
对所得数据进行多元回归分析，得到响应变量(料液比、功率、处理时间和酶解时间)与响应值(蛋白水解度)之间的二次多项回归方程：
Y＝47.98+0.17X1+0.44X2+0.16X3+0.013X4-0.24X1X2-0.11X1X3-0.29X1X4
+0.14X2X3-0.16X2X4-0.51X3X4-0.61X1 2-0.56X2 2-0.41X3 2-0.096X4 2
F检验可判定各因子与响应值之间线性关系的显著性，P值越小，说明变量的显著性越高。由表3可知，模型的显著水平小于0.0001，所以该回归方差模型是极显著的。
表3响应面二次回归模型方差分析表
(4)试验结果分析与优化
根据模型分析得知，超声波微波辅助酶解河蚌蛋白最佳工艺参数：液料比10.18，功率：360.78W，处理时间：6.90min，酶解时间4.00h,在此条件下河蚌蛋白水解度为48.40％。
试验1、超声波微波辅助酶解河蚌蛋白质过程试验
(1)新鲜河蚌用清水冲洗干净，用刀将壳剖开，去除蚌壳、蚌泪及内脏组织，取蚌肉并用清水清洗干净，沥尽表面水分，用打浆机打浆，然后将打浆后的蚌肉浆液置于胶体磨中磨碎、均质，得到均一的蚌肉浆液，即为河蚌肉样品。
(2)称取20g河蚌肉样品，按一定的比例加入蒸馏水并混合均匀，然后将样液置于超声波-微波联用装置内，在一定的功率(W)下处理一定的时间(min)。
(3)调节pH至6.5，加入5000U/g木瓜蛋白酶，混匀后置于50℃恒温水浴振荡器中酶解4-6h，酶解过程中保持反应体系pH值恒定在6.5左右，反应结束后迅速置于90℃水浴中灭酶10min，灭酶后将反应物置于冷水中冷却至室温；
(4)离心(4000r/min，20min)取上清液，用蒸馏水将上清液稀释到一定倍数，用甲醛滴定法测定氨基酸态氮含量，测得蛋白质水解度为48.55％。
试验2、料液比变化对蛋白质水解度的影响
在功率300W、处理时间6min、酶解时间5h的条件下，将料液比设定为1:4-1:14共6个变化值；其余同试验1，结果如图1。
当料液比小于1:10时，河蚌蛋白的水解度随着料液比的增大而升高，而随着料液比继续增加，水解度不断下降。这可能是当物料在低料液比的水平时，物料的粘度较高，使得物料难以流动，造成底物与酶不能顺利或有效的结合，制约着反应的正常进行。当料液比升高到一个合适的水平时，溶液浓度随之降低，底物和酶流动速度相应加快，底物与酶的有效性结合的几率不断升高，最终结果是水解度呈现上升趋势。但当料水比在进一步升高时，虽然溶液流动性变得更好，但底物与酶浓度同时下降，使得酶与底物的有效结合效率也在不断的降低，导致水解度同样在降低。
由图1可知，当料液比为1:10时，河蚌蛋白水解度最大，因此选择料液比为1:10。
试验3、功率对蛋白质水解度的影响
在料液比1:10，处理时间6min，酶解时间5h的条件下，将功率设定为100-600W共6个变化值；其余同试验1，结果如图2。
当功率小于300W时，随着功率的增大，水解度不断增加，但是当功率超过300W时，河蚌蛋白水解度急剧下降。原因可能是功率急剧升高导致了温度升高的的速率增加，当功率增加时，温度在比原来所需时间少的条件下达到所需温度。所以，在较高的功率下，温度升高快，在较高的温度下可能会破坏蛋白质结构或使蛋白质变性，使水解度急剧下降。所以，选取300W为最佳功率。试验4、处理时间变化对蛋白质水解度的影响
在料液比1:10、功率300W、酶解时间5h的条件下，将处理时间设定为3-8min共6个变化值；其余同试验1，结果如图3。
当处理时间低于6min时，随着处理时间的增加，水解度不断提高，但当处理时间大于6min后，水解度降低。超声波和微波交替对反应物作用，超声波作用会破坏反应物的细胞膜，胞内物质释放，与溶剂接触充分，易于反应进行。但是随着处理时间的增加，导致微波作用时间延长，微波作用导致反应体系的温度增加，时间越久，增加温度越多。当温度过高，使得蛋白质变性沉淀，从而使得酶解过程受阻，水解度降低。所以，选取6min为最佳处理时间。
试验5、酶解时间变化对蛋白质水解度的影响
在料液比1:10、功率300W、处理时间6min的条件下，将酶解时间设定为2-7h共6个变化值；其余同试验1，结果如图4。
在反应初期，反应速度很快，这可能是因为木瓜蛋白酶是刚加入的，表现出有活力的酶的浓度较高，因此，反应速度在反应初期要高于剩下的反应阶段；但是随着时间的延长，木瓜蛋白酶渐渐失活，有效的酶的浓度不断降低，表现出的结果就是反应增长速度逐渐放缓；随着时间的持续延长，反应进入后期，大部分的酶已经失活，并且前期积累的酶解产物越来越多，使整个反应的平衡向左边移动，最终导致整个反应看上去停止。反应5h之后，水解度还有微弱增加，但不明显。综合考虑，为缩短周期，选择酶解时间为5h。

Claims (4)

1.一种超声波-微波辅助酶解河蚌蛋白工艺，其特征在于：以河蚌肉为原料，利用超声波-微波技术辅助酶解河蚌蛋白并借助响应面优化酶解工艺的新方法，其工艺流程和操作步骤如下：
超声波-微波辅助酶解河蚌蛋白工艺流程：原料及预处理→打浆→匀浆→超声波-微波处理→酶解→灭酶→离心→收集上清液
超声波-微波辅助酶解河蚌蛋白操作步骤与要点如下：
(1)原料及预处理：新鲜的河蚌用清水洗净蚌壳表面污垢，用刀将其剖开，去除蚌壳、蚌泪及内脏组织，取蚌肉并用清水清洗干净，沥除表面水分，于-18℃下冷冻备用；
(2)打浆：将蚌肉取出，在室温下解冻，并用打浆机打浆；
(3)匀浆：将打浆后的蚌肉浆液于胶体磨中磨碎、均质，得到均一的蚌肉浆液；
(4)超声波-微波处理：按料液比1:8，1:10，1:12将蚌肉匀浆与水混合均匀，用均质机均质，经超声波-微波处理，功率200～400W，处理时间5～7min；
(5)酶解：将经超声波-微波处理过的浆液调节pH为6.5，按5000U/g加入木瓜蛋白酶，搅拌均匀后置于恒温水浴振荡器中于50℃下酶解反应4-6h，酶解过程中保持反应体系pH值恒定在6.5左右，反应结束后迅速置于90℃水浴中灭酶10min，灭酶后将反应物置于冷水中冷却至室温；
(6)离心：将经灭酶和冷却后的蚌肉酶解液置于低速离心机中离心(4000r/min，20min)，取上清液，即为蚌肉蛋白酶解液。
2.如权利要求书1所述的超声波-微波辅助酶解河蚌蛋白工艺，其特征在于，所述反应物中酶添加量为5000U/g，于50℃、pH 6.5条件下酶解4-6h。
3.如权利要求书1所述的超声波-微波辅助酶解河蚌蛋白工艺，其特征在于，所述的酶制剂为木瓜蛋白酶，酶活力为1×105U/g，酶加入量为5000U/g(酶活力与底物质量之比)；蛋白酶作用于蚌肉组织，将大分子蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，且具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等优点。
4.如权利要求书1所述的超声波微波辅助酶解河蚌蛋白工艺，其特征在于，所述的河蚌肉匀浆液经超声波-微波辅助酶解设置4个变量(料液比、功率、处理时间和酶解时间)，根据Box-Behnken设计原理利用Design Expert软件进行数据处理及工艺优化。
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