CN111153835A - 一种超高压辅助酶解河蚌肉制取牛磺酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种超高压辅助酶解河蚌肉制取牛磺酸的方法，包括原料预处理、超高压处理、酶水解、去除蛋白质、过滤、分离纯化、结晶等步骤，本发明以牛磺酸提取率为指标，采用超高压辅助酶法从河蚌肉中提取牛磺酸，通过大量实验研究了压强、保压时间、酶解时间和酶添加量这四个因素对牛磺酸提取率的影响，并应用正交试验优化出最佳提取工艺进而得到本发明的提取方法。通过本发明的方法从河蚌肉中提取牛磺酸的提取率最高为11.63mg/g，得到纯度90.7％的天然牛磺酸产品，高于本领域其他方法的提取率和纯度。

Description

一种超高压辅助酶解河蚌肉制取牛磺酸的方法

技术领域

本发明涉及一种制取牛磺酸的方法，特别涉及一种超高压辅助酶解河蚌肉制取牛磺酸的方法。

背景技术

牛磺酸，学名为β-氨基乙磺酸，得名于首次从牛胆汁中分离。纯品为无色或白色斜状晶体，无臭，其化学性质稳定，不溶于乙醚等有机溶剂。牛磺酸是一种含硫氨基酸，以游离氨基酸的形式普遍存在于动物各组织中，并且具有生理活性和多种营养功能，包括增强细胞的抗氧化能力，参与三大有机质代谢，调节免疫反应和机体内分泌以及保证动物神经系统的正常发育等。目前牛磺酸的生产方法有两种：化学合成法和天然提取法，由于化学合成法的原料和生产过程中存在有毒物质，因此人们更提倡使用绿色安全的天然提取法提取牛磺酸。但目前缺少直接从河蚌肉中提取牛磺酸的方法，其他提取方法存在操作复杂、提取率低、纯度低等问题。

发明内容

由于现有技术中没有从河蚌肉中提取牛磺酸的方法，而直接将其他提取方法应用于河蚌肉提取出的牛磺酸纯度低、提取率低，并且存在提取率无法进一步提高的技术壁垒，因此本发明采用超高压辅助酶解提取河蚌肉中的牛磺酸，并对其提取工艺进行优化，既提高了牛磺酸的提取率和纯度，又解决了河蚌副产物资源浪费、污染环境等问题。

本发明提供的一种超高压辅助酶解河蚌肉制取牛磺酸的方法，包括以下步骤：

(1)原料预处理：

将河蚌肉去壳分离内脏和肉质部，将肉质部洗净、沥水、匀浆后分装备用；

(2)超高压处理：

向河蚌肉匀浆加入蒸馏水进行均质，蒸馏水添加量与河蚌肉匀浆质量按照8:1(mL/g)加入，均质后用真空包装袋密封真空包装并摇匀，注意要排干净袋内的空气，然后进行加压处理，压强150-250MPa，保压时间2-4min；

(3)酶水解：

调节超高压处理后的均质液pH值为6.5后，向均质液加入3000-5000U/g酶制剂，水浴锅50℃预热10min后，将均质液在50℃水浴锅中进行水浴处理2-4h，水浴酶解完成后沸水灭酶10min，灭酶后冷却到室温；

(4)去除蛋白质：

向酶解后样品液中加2.5％-3％(v/v)沉淀剂Ⅰ，沉淀剂Ⅰ为15.0g/100mL亚铁氰化钾溶液，涡旋混合，再加入2.5％-3％(v/v)沉淀剂Ⅱ，沉淀剂Ⅱ为30.0g/100mL乙酸锌溶液，涡旋混合，混合后离心获取上清液；

(5)过滤：

向上清液中加入活性炭，活性炭的添加量为2％-3％w/v上清液，静置，脱色过滤；

(6)分离纯化：

采用阳离子交换树脂柱，用蒸馏水洗脱，收集牛磺酸洗脱液；

(7)结晶：

利用旋转蒸发仪将收集到的洗脱液进行浓缩，浓缩到10％以下后，加入无水乙醇，放入4℃冰箱中，结晶析出，离心收集结晶，得到高纯度的牛磺酸结晶。

优选的，步骤(3)中，采用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节超高压处理后的样品液pH值，酶制剂为木瓜蛋白酶。

优选的，步骤(4)中，离心条件为5000r/min下离心10min。

优选的，步骤(7)中，无水乙醇添加量为提取液的3-4倍，结晶后离心收集，用蒸馏水溶解结晶，再加入无水乙醇，放入4℃冰箱中重结晶，重复结晶提取三次。

本发明的有益效果：

本发明通过原料预处理、超高压处理、酶解、过滤、纯化、结晶等步骤得到天然牛磺酸产品，有效的从河蚌肉中提取出牛磺酸，并且试验操作简单，既提高了牛磺酸的提取率和纯度，又解决了河蚌副产物资源浪费、污染环境等问题，对于提高牛磺酸的生产具有重要意义，填补了从河蚌肉中提取牛磺酸的技术空白，克服了从河蚌肉中提取牛磺酸存在的无法准确、定量实施的壁垒。

本发明以牛磺酸提取率为指标，采用超高压辅助酶法从河蚌肉中提取牛磺酸，通过大量实验研究了压强、保压时间、酶解时间和酶添加量这四个因素对牛磺酸提取率的影响，并应用正交试验优化出最佳提取工艺进而得到本发明的提取方法。通过本发明的方法从河蚌肉中提取牛磺酸的提取率最高为11.63mg/g，得到纯度90.7％的天然牛磺酸产品，高于本领域其他方法的提取率和纯度。

附图说明

图1为本发明压强对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响示意图。

图2为本发明保压时间对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响示意图。

图3为本发明酶解时间对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响示意图。

图4为本发明酶添加量对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响示意图。

具体实施方式

实施例一：

一种超高压辅助酶解河蚌肉制取牛磺酸的方法，包括以下步骤：

(1)原料预处理：

取新鲜河蚌或解冻的河蚌，将河蚌肉去壳分离内脏和肉质部，将肉质部洗净、沥水、匀浆后分装备用；

(2)超高压处理：

取4g河蚌肉匀浆，向河蚌肉匀浆加入蒸馏水进行均质，蒸馏水添加量与河蚌肉匀浆质量按照8:1(mL/g)加入，均质后用真空包装袋密封真空包装并摇匀，注意要排干净袋内的空气，然后进行加压处理，压强200MPa，保压时间3min；

(3)酶水解：

采用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节超高压处理后的均质液pH值为6.5，向均质液加入5000U/g酶制剂，酶制剂为木瓜蛋白酶，水浴锅50℃预热10min后，将均质液在50℃水浴锅中进行水浴处理3.5h，水浴酶解完成后沸水灭酶10min，灭酶后冷却到室温；

(4)去除蛋白质：

向酶解后样品液中加2.5％(v/v)沉淀剂Ⅰ即15.0g/100mL亚铁氰化钾溶液，涡旋混合，再加入2.5％(v/v)沉淀剂Ⅱ即30.0g/100mL乙酸锌溶液，涡旋混合，混合后在5000r/min转数条件下离心10min获取上清液；

(5)过滤：

向上清液中加入活性炭，活性炭的添加量为2％-3％w/v上清液，静置，脱色过滤；

(6)分离纯化：

采用732型Na⁺阳离子交换树脂柱，用蒸馏水洗脱，收集牛磺酸洗脱液；

(7)结晶：

利用旋转蒸发仪将收集到的洗脱液进行浓缩到10％后，加入浓缩液3-4倍的无水乙醇，放入4℃冰箱中，结晶析出，离心收集结晶，用刚好使结晶全部溶解的蒸馏水溶解结晶，再加入无水乙醇，放入4℃冰箱中重结晶，重复结晶提取三次，得到高纯度的牛磺酸结晶。

此条件下，河蚌肉中牛磺酸的提取率为11.63mg/g，牛磺酸的纯度为90.7％。

实施例二：

一种超高压辅助酶解河蚌肉制取牛磺酸的方法，包括以下步骤：

(1)原料预处理：

取新鲜河蚌或解冻的河蚌，将河蚌肉去壳分离内脏和肉质部，将肉质部洗净、沥水、匀浆后分装备用；

(2)超高压处理：

取4g河蚌肉匀浆，向河蚌肉匀浆加入蒸馏水进行均质，蒸馏水添加量与河蚌肉匀浆质量按照8:1(mL/g)加入，均质后用真空包装袋密封真空包装并摇匀，注意要排干净袋内的空气，然后进行加压处理，压强150MPa，保压时间4min；

(3)酶水解：

采用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节超高压处理后的均质液pH值为6.5，向均质液加入5000U/g酶制剂，酶制剂为木瓜蛋白酶，水浴锅50℃预热10min后，将均质液在50℃水浴锅中进行水浴处理3.5h，水浴酶解完成后沸水灭酶10min，灭酶后冷却到室温；

(4)去除蛋白质：

向酶解后样品液中加2.5％(v/v)沉淀剂Ⅰ即15.0g/100mL亚铁氰化钾溶液，涡旋混合，再加入2.5％(v/v)沉淀剂Ⅱ即30.0g/100mL乙酸锌溶液，涡旋混合，混合后在5000r/min转数条件下离心10min获取上清液；

(5)过滤：

向上清液中加入活性炭，活性炭的添加量为2％-3％w/v上清液，静置，脱色过滤；

(6)分离纯化：

采用732型Na⁺阳离子交换树脂柱，用蒸馏水洗脱，收集牛磺酸洗脱液；

(7)结晶：

利用旋转蒸发仪将收集到的洗脱液进行浓缩到10％后，加入浓缩液3-4倍的无水乙醇，放入4℃冰箱中，结晶析出，离心收集结晶，用刚好使结晶全部溶解的蒸馏水溶解结晶，再加入无水乙醇，放入4℃冰箱中重结晶，重复结晶提取三次，得到高纯度的牛磺酸结晶。

此条件下，河蚌肉中牛磺酸的提取率为11.14mg/g。

实施例三：

一种超高压辅助酶解河蚌肉制取牛磺酸的方法，包括以下步骤：

(1)原料预处理：

取新鲜河蚌或解冻的河蚌，将河蚌肉去壳分离内脏和肉质部，将肉质部洗净、沥水、匀浆后分装备用；

(2)超高压处理：

取4g河蚌肉匀浆，向河蚌肉匀浆加入蒸馏水进行均质，蒸馏水添加量与河蚌肉匀浆质量按照8:1(mL/g)加入，均质后用真空包装袋密封真空包装并摇匀，注意要排干净袋内的空气，然后进行加压处理，压强150MPa，保压时间3min；

(3)酶水解：

采用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节超高压处理后的均质液pH值为6.5，向均质液加入4000U/g酶制剂，酶制剂为木瓜蛋白酶，水浴锅50℃预热10min后，将均质液在50℃水浴锅中进行水浴处理3h，水浴酶解完成后沸水灭酶10min，灭酶后冷却到室温；

(4)去除蛋白质：

向酶解后样品液中加2.5％(v/v)沉淀剂Ⅰ即15.0g/100mL亚铁氰化钾溶液，涡旋混合，再加入2.5％(v/v)沉淀剂Ⅱ即30.0g/100mL乙酸锌溶液，涡旋混合，混合后在5000r/min转数条件下离心10min获取上清液；

(5)过滤：

向上清液中加入活性炭，活性炭的添加量为2％-3％w/v上清液，静置，脱色过滤；

(6)分离纯化：

采用732型Na⁺阳离子交换树脂柱，用蒸馏水洗脱，收集牛磺酸洗脱液；

(7)结晶：

利用旋转蒸发仪将收集到的洗脱液进行浓缩到10％后，加入浓缩液3-4倍的无水乙醇，放入4℃冰箱中，结晶析出，离心收集结晶，用刚好使结晶全部溶解的蒸馏水溶解结晶，再加入无水乙醇，放入4℃冰箱中重结晶，重复结晶提取三次，得到高纯度的牛磺酸结晶。

此条件下，河蚌肉中牛磺酸的提取率为10.67mg/g。

验证实验：

实验一、超高压辅助酶解提取河蚌肉中牛磺酸单因素试验：

(1)压强对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响

根据上述提取方法，将6组4g左右河蚌肉匀浆液样品，分别在酶添加量4000U/g、保压时间5min、酶解时间2h的条件下，研究压强分别为50、100、150、200、250和300MPa时对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响。

单因素试验中压强对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响如图1所示。当压强在50～200MPa之间时，随着压强的增加，牛磺酸提取率呈现逐渐上升的趋势，当压强达到200MPa后，牛磺酸提取率开始逐渐下降。压强在150～250MPa之间的提取率较高，因此根据结果，选择压强为150～250MPa进行后续的优化试验。

(2)保压时间对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响

根据上述提取方法，将6组4g左右河蚌肉匀浆液样品，分别在酶添加量4000U/g、压强200MPa、酶解时间2h的条件下，研究保压时间分别为1、2、3、4、5和6min时对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响。

单因素试验中保压时间对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响如图2所示。当保压时间在1～3min之间时，随着保压时间的延长，河蚌肉中牛磺酸的提取率呈现上升趋势，当保压时间超过3min时，提取率逐渐下降。保压时间在2～4min之间时提取率较高，因此选择超高压处理的保压时间在2～4min的范围内进行正交优化试验。

(3)酶解时间对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响

根据上述提取方法，将6组4g左右河蚌肉匀浆液样品，分别在酶添加量4000U/g、压强200MPa、保压时间5min的条件下，研究酶解时间分别为1.5、2、1.5、3、3.5和4h时对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响。

单因素试验中酶解时间对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响如图3所示。当酶解时间在1.5～3h范围内时，随着酶解时间的增加，河蚌肉中牛磺酸的提取率逐渐升高，但酶解时间超过3h后，随着酶解时间的延长，酶活逐渐降低，河蚌肉中牛磺酸的提取率也逐渐降低。酶解时间在2.5～3.5h范围内，提取率较高，因此选择该范围进行正交优化试验。

(4)酶添加量对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响

根据上述提取方法，将6组4g左右河蚌肉匀浆液样品，分别在压强200MPa、保压时间5min、酶解时间2h的条件下，研究酶添加量分别为1000、2000、3000、4000、5000和6000U/g时对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响。

单因素试验中酶添加量对河蚌肉中牛磺酸提取率的影响如图4所示。酶添加量在1000～6000U/g范围内，随着酶添加量的增加，河蚌肉中牛磺酸的提取率逐渐升高，但随着酶制剂添加量的增加，结合位点达到饱和，继续添加酶制剂，牛磺酸提取率也不再有明显上升。因此选择3000～5000U/g范围进行正交优化试验。

实验二、超高压辅助酶解提取河蚌肉中牛磺酸正交优化试验：

根据单因素试验结果，筛选出了主要因素及优水平，通过L₉(3⁴)正交试验表，确定超高压辅助酶解提取河蚌肉中牛磺酸的最佳提取工艺条件。正交试验因素水平表如表1所示。试验结果采用Excel软件整理分析，并应用SPSS Statistics 24.0统计软件对数据进行方差分析，判断因素的显著性。

表1正交试验因素水平表

根据单因素试验结果，选择压强、保压时间、酶解时间和酶添加量四个影响因素及水平，以河蚌肉中牛磺酸的提取率为评价指标，进行正交试验工艺优化。试验结果及极差分析表如表2所示，方差分析表如表3所示。

表2正交试验结果及极差分析表

表3正交试验方差分析表

注：a.R²＝0.990(调整后R²＝0.985)；**极显著，*显著

结合表2、表3的极差分析和方差分析可知，影响牛磺酸提取率最显著的因素是酶添加量，其次是保压时间和酶解时间，压强相对最小。由表3方差分析可知，压强、保压时间、酶解时间和酶添加量都对牛磺酸含量的影响极显著(P＜0.01)。而牛磺酸提取率的方差分析也得出相当大的测定系数(R²＝0.990)，表明该试验优化方法具有可靠性。由表2可知，最优组合为A₂B₂C₃D₃，即压强、保压时间、酶解时间以及酶添加量分别为200MPa、3min、3.5h和5000U/g。根据此最优条件进行三次平行试验，得到超高压辅助酶解提取河蚌肉中的牛磺酸提取率为11.63mg/g，牛磺酸的纯度为90.7％。

实验三、河蚌肉中提取牛磺酸的对比试验：

对比酶法提取河蚌肉中牛磺酸、超声波辅助酶法提取河蚌肉中牛磺酸和超高压辅助酶法提取河蚌肉中牛磺酸三种方法：

1)试验材料与试剂

河蚌肉：松花江野生河蚌，购于吉林省松原市。

牛磺酸标准品：CAS：107-35-7，纯度≥99％；购于中国食品药品检定研究院。

其他试剂为实验室常用试剂。

2)提取步骤

(1)酶法提取河蚌肉中牛磺酸：该方法过程与本发明实施例一基本相同，区别在于步骤(2)均质后直接进行步骤(3)处理；

(2)超声波辅助酶法提取河蚌肉中牛磺酸：该方法过程与本发明实施例一基本相同，区别在于步骤(2)均质后调整超声时间(10-30min)、超声功率(100-300W)等设备参数对样品液进行超声波处理；

(3)超高压辅助酶法提取河蚌肉中牛磺酸：该方法过程即本发明实施例一。

以牛磺酸提取率为评价指标，对比分析酶法提取河蚌肉中牛磺酸、超声波辅助酶法提取河蚌肉中牛磺酸和超高压辅助酶法提取河蚌肉中牛磺酸这三种方法最优条件下的效果。结果如表4所示。

表4三种提取方法下的牛磺酸提取率

通过超高压辅助酶法提取、超声波辅助酶法提取和酶法提取得到的牛磺酸提取率都表示为三次平行试验的平均值，由表可知，本发明提出的超高压辅助酶法提取河蚌肉中牛磺酸的提取率最高，达到了11.63mg/g，且与酶法提取相比牛磺酸提取率显著提高。

Claims (6)

1.一种超高压辅助酶解河蚌肉制取牛磺酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)原料预处理：

将河蚌肉去壳分离内脏和肉质部，将肉质部洗净、沥水、匀浆后分装备用；

(2)超高压处理：

向河蚌肉匀浆加入蒸馏水进行均质，均质后用真空包装袋密封真空包装并摇匀，然后进行加压处理，压强150-250MPa，保压时间2-4min；

(3)酶水解：

调节超高压处理后的均质液pH值为6.5后，向均质液加入3000-5000U/g酶制剂，在50℃水浴锅中进行水浴处理2-4h，水浴酶解完成后沸水灭酶，灭酶后冷却到室温；

(4)去除蛋白质：

向酶解后样品液中加2.5％-3％(v/v)沉淀剂Ⅰ，涡旋混合，再加入2.5％-3％(v/v)沉淀剂Ⅱ，涡旋混合，混合后离心获取上清液；

(5)过滤：

向上清液中加入活性炭，活性炭的添加量为2％-3％(w/v)上清液，静置，脱色过滤；

(6)分离纯化：

采用阳离子交换树脂柱，用蒸馏水洗脱，收集牛磺酸洗脱液；

(7)结晶：

利用旋转蒸发仪将收集到的洗脱液进行浓缩，浓缩后加入无水乙醇，放入4℃冰箱中，结晶析出，离心收集结晶，得到高纯度的牛磺酸结晶。

2.根据权利要求1所述的一种超高压辅助酶解河蚌肉制取牛磺酸的方法，其特征在于：步骤(2)中，向河蚌肉匀浆加入蒸馏水进行均质的过程中，蒸馏水添加量与河蚌肉匀浆质量按照8:1加入，蒸馏水单位为mL，河蚌肉匀浆质量单位为g。

3.根据权利要求1所述的一种超高压辅助酶解河蚌肉制取牛磺酸的方法，其特征在于：步骤(3)中，采用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节超高压处理后的样品液pH值，酶制剂为木瓜蛋白酶。

4.根据权利要求1所述的一种超高压辅助酶解河蚌肉制取牛磺酸的方法，其特征在于：步骤(4)中，沉淀剂Ⅰ为15.0g/100mL的亚铁氰化钾溶液；沉淀剂Ⅱ为30.0g/100mL的乙酸锌溶液。

5.根据权利要求1所述的一种超高压辅助酶解河蚌肉制取牛磺酸的方法，其特征在于：步骤(4)中，离心条件为5000r/min下离心10min。

6.根据权利要求1所述的一种超高压辅助酶解河蚌肉制取牛磺酸的方法，其特征在于：步骤(7)中，洗脱液浓缩到10％以下；无水乙醇添加量为浓缩液的3-4倍，结晶后离心收集，用蒸馏水溶解结晶，再加入无水乙醇，放入4℃冰箱中重结晶，重复结晶提取三次。

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