CN113429448B - 一种从发酵液中提取肌苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品微生物、发酵技术领域,具体涉及一种从发酵液中提取肌苷的方法。其步骤为:A、将肌苷发酵液调节pH值为12~13,加热分离除去菌体,得到滤液,加热温度为65~90℃;B、将步骤A的滤液连续加入到机械蒸汽再压缩蒸发结晶系统中,蒸发结晶,连续排出蒸发结晶液到分离机中,连续卸料,得到肌苷粗品滤饼;C、将步骤B的肌苷粗品精制,得到肌苷产品。所述步骤C中的精制包括溶解、脱色、过滤、结晶和分离过程。与离子交换树脂法和间歇冷却结晶法相比,本发明具有提高收率、节省能耗、缩短周期、减少杂质的效果。
Description
技术领域
本发明属于食品微生物、发酵技术领域,具体涉及一种从发酵液中提取肌苷的方法。
背景技术
肌苷(Inosine),也称为次黄嘌呤核苷,化学式C10H12N4O5,化学名称为9-β-D-呋喃核糖次黄嘌呤。肌苷为白色结晶性粉末,在水中略溶,在乙醇中不溶,在盐酸溶液或氢氧化钠溶液中易溶。
肌苷在医药和食品添加剂领域有着广泛的用途。在医药领域中,用作辅酶类药物,对细胞膜具有较好的通透性,可以进入细胞,参与转化为核苷酸,参与机体的物质代谢和能量代谢。用于预防和治疗心脏和肝脏等器官的细胞损伤,有助于肝功能恢复正常,并能预防及解除部分药物引起的对心脏或肝脏的副作用,是治疗冠心病、肝炎、白血球减少症等的有效药物。在食品添加剂领域中,用作生产核苷酸的主要原料。用肌苷为原料生产的肌苷酸具有增加鲜味的作用,可添加到酱油、调味包等产品中,广泛应用于饮食、食品加工生产等行业。目前,肌苷市场需求旺盛,开发适合生产应用、降低生产成本、提高产品品质的生产工艺具有及其重要的意义。
发酵法是目前最常用的肌苷生产方法,具有生产效率高、生产条件温和、生产环境友好等优点,适宜于大规模工业化生产。其中,从发酵液中分离提取肌苷是发酵法生产肌苷的重要步骤,直接影响肌苷产品生产效率和生产成本。中国发明专利申请CN1056897A和CN1063873A采用离子交换树脂提取分离肌苷。离子交换法耗水量非常大,含有大量COD的离子交换废水造成环保处理困难,并且大量的废水带走肌苷,收率难以得到保障,生产周期长。
中国发明专利申请CN1074711A和CN1445012A采用絮凝剂沉淀,然后分离除菌,分离的菌体中含有大量的絮凝剂,影响了菌体进一步加工利用的价值。
中国发明专利申请CN1074711A将除去菌体后的滤液进行浓缩,然后置0~10℃低温中进行结晶,结晶完全一般需24~35小时。这种间歇冷却结晶法生产周期长,结晶降温过程耗费大量的搅拌动力和冷媒能量,并且由于温度低、时间长,大量的有机杂质随着结晶沉淀出来,为了提高粗品质量,通常在分离过程中加入大量洗水,溶解杂质的同时,也会造成肌苷的损失,因此,低温结晶沉淀不利于后续的进一步提纯以及收率的稳定。
发明内容
针对上述技术缺陷,本发明提供一种提高肌苷产量,增加肌苷晶体纯度的提取肌苷的方法。
为解决上述技术问题,本发明的技术方案是:一种从发酵液中提取肌苷的方法,其步骤为:A、将肌苷发酵液调节pH值为12~13,加热分离除去菌体,得到滤液,加热温度为65~90℃;B、将步骤A的滤液连续加入到机械蒸汽再压缩蒸发结晶系统中,蒸发结晶,连续排出蒸发结晶液到分离机中,连续卸料,得到肌苷粗品滤饼;C、将步骤B的肌苷粗品精制,得到肌苷产品。所述步骤C中的精制包括溶解、脱色、过滤、结晶和分离过程。
进一步:在上述从发酵液中提取肌苷的方法中,所述步骤A的优选加热温度为80~90℃。将肌苷发酵液调节pH值优选为12.5,所述步骤A中的分离是指采用微滤膜设备进行固液分离。本发明采用的微滤膜是一种微孔陶瓷膜,其组件通道直径φ8mm,比传统通道直径φ3.5~6mm的组件具有更大的流通面积,使过滤分离的浓缩菌液可以获得更高的浓缩倍数,菌液浓度高,菌液干燥成固体饲料蛋白的蒸汽成本更低,且浓缩倍数高,透过微滤膜的肌苷滤液体积多,致使菌液中残留的肌苷少,增加产品收率,同时浓缩倍数高,过滤洗涤使用的洗水量减少,后期的浓缩成本减少,可谓一举多得。所述步骤B中的机械蒸汽再压缩蒸发结晶系统是单效、双效、多效蒸发结晶系统中的任意一种。所述步骤B中的分离机是活塞推料离心机或者螺旋卸料过滤离心机,它们都是一种连续固液分离设备,一边进料一边分离得到固体和母液。所述的步骤B中排出蒸发结晶液的温度为70~90℃。所述的步骤B中排出蒸发结晶液的肌苷含量为30~60%。所述的步骤B中连续排出蒸发结晶液到分离机中的同时,流加洗水,洗涤粗品滤饼。所述的步骤C中肌苷粗品滤饼溶解浓度为25~40%,pH值6.5~7.5,溶解温度为65~98℃,所述的步骤C中脱色过程是指加入活性炭量为肌苷的0.5~3.5%,分离结晶的温度为5~25℃。
与现有技术相比,本发明加热分离除去菌体,得到滤液,加热温度为65~90℃”,优选80~90℃,试验发现,肌苷发酵液中蛋白质加热至80~90℃时,失去溶解性,蛋白质变性,可以形成颗粒团聚物,不易堵塞微滤膜孔,大幅度节省微滤膜再生药剂的使用量和频次,且发酵液粘度降低,过滤速度快,利于微滤分离,缩短生产周期,节省电力成本。肌苷粗品的工艺从分离除菌、蒸发结晶、连续分离整个工序形成了一个连续的生产线,改变了传统工艺分步间歇操作的生产模式。“步骤B中排出蒸发结晶液的温度为70~90℃”,试验发现,排出蒸发结晶液的温度为70~90℃时发酵。另外本发明革除添加絮凝剂步骤,通过调节发酵液的pH值和温度,即将肌苷发酵液调节pH值为12~13,发明人反复调试这个pH值,只有在这个pH值条件下,浓缩粗品结晶颗粒大,容易脱水,分离效率高,纯度高。发酵液中蛋白质变性,粘度降低,利于微滤分离,分离后的副产物菌液含有丰富的营养蛋白质,且不含絮凝剂杂质,适用于进一步加工成饲料蛋白,创造经济价值;本发明革除离子交换和碳柱吸附工序,采用蒸发结晶后高温分离技术,杂质随母液除去,利于提高粗品的质量,节省后续精制的活性炭的添加量,且由于粗品质量好,精制收率更加高,总收率提高;本发明采用机械蒸汽再压缩蒸发结晶系统,其中机械蒸汽再压缩(简称MVR)蒸发技术原理是:蒸发器产生的二次蒸汽经过压缩机压缩,热焓值增加,作为蒸发器的热源加热物料,物料吸收热量后继续产生二次蒸汽,重复上述过程循环蒸发,蒸发系统只需要提供压缩机的电能,从而节省大量新鲜蒸汽。以MVR技术为基础的蒸发结晶系统,应用于肌苷滤液的蒸发结晶过程,具有较好的节能效果;本发明通过连续蒸发结晶,高温连续分离技术,蒸发结晶后分离就得到粗品,大大简化了流程,缩短了粗品分离周期;且通过提高结晶液的浓度,提高分离的温度,保证了粗品的质量和收率;革除低温结晶过程,使生产能耗有效降低;实现了生产周期大幅度缩短,生产效率大幅度提高,提高产品质量和产量的目的。
所以本发明的有益效果如下:
本发明利用浓缩结晶工序短,减少设备投资,节省运行能耗,提高了肌苷粗品的质量,降低了精制的难度,并且简化了工艺,提高了收率,降低了成本,适合应用于工业化生产。
具体实施方式
本发明的主旨是通过从发酵液提纯肌苷,该方法具有纯化工序短、操作简单、生产周期短、粗品质量好的特点,克服了现有技术存在的菌体蛋白难以利用、收率不高、粗品含杂质多、分离困难、能耗高的缺点,使肌苷的收率和质量得到显著提高。下面结合实施例对本发明的内容作进一步详述,实施例中所提及的内容并非对本发明的限定,其中方法各个原材料、压力、温度的选择可因地制宜而对结果并无实质性影响。首先,简述本发明方法的基本方案:一种从发酵液中提取肌苷的方法,其步骤为:A、将肌苷发酵液调节pH值为12~13,加热分离除去菌体,得到滤液,加热温度为65~90℃;B、将步骤A的滤液连续加入到机械蒸汽再压缩蒸发结晶系统中,蒸发结晶,连续排出蒸发结晶液到分离机中,连续卸料,得到肌苷粗品滤饼;C、将步骤B的肌苷粗品精制,得到肌苷产品;所述步骤C中的精制包括溶解、脱色、过滤、结晶和分离过程。
实施例1
发酵液75立方,肌苷含量62.5g/L,在搅拌条件下,调pH值至12.1,蒸汽将发酵液加热至82℃,进行陶瓷膜微滤系统过滤,压力0.2~0.5MPa,得到滤清液,加入洗水,一边过滤一边洗涤菌体,过滤完毕,菌体抽去制作菌体蛋白饲料,合并洗水和滤清液去机械蒸汽再压缩蒸发结晶系统,机械压缩二次蒸汽,加热物料,蒸发水分,得到稳定结晶颗粒,一边滤液进料一边蒸发结晶液出料进入连续分离机,控制蒸发结晶液出料肌苷35~38%含量,温度75℃,分离得到肌苷粗品。粗品母液和精品母液浓缩回收肌苷作为粗品混合精制。肌苷粗品溶解于水中,浓度27.5%,调节pH值至7.0,加热至85℃,溶解清澈,加入活性炭量为肌苷的0.8%,降温至6℃分离,干燥,得到肌苷产品4.10吨,总收率达87.5%。经检测,肌苷粗品含量72.3%,色谱纯度99.50%;肌苷成品含量99.47%,色谱纯度99.75%;透光率99.1%,灼烧残渣0.15%。
实施例2
发酵液78立方,肌苷含量58.8g/L,在搅拌条件下,调pH值至12.5,蒸汽将发酵液加热至88℃,进行陶瓷膜微滤系统过滤,压力0.2~0.5MPa,得到滤清液,加入洗水,一边过滤一边洗涤菌体,过滤完毕,菌体抽去制作菌体蛋白饲料,合并洗水和滤清液去机械蒸汽再压缩蒸发结晶系统,机械压缩二次蒸汽,加热物料,蒸发水分,得到稳定结晶颗粒,一边滤液进料一边蒸发结晶液出料进入连续分离机,控制蒸发结晶液出料肌苷31~35%含量,温度80℃,分离得到肌苷粗品。粗品母液和精品母液浓缩回收肌苷作为粗品混合精制。肌苷粗品溶解于水中,浓度28.5%,调节pH值至7.1,加热至88℃,溶解清澈,加入活性炭量为肌苷的0.9%,降温至8℃分离,干燥,得到肌苷产品4.03吨,总收率达87.8%。经检测,肌苷粗品含量73.8%,色谱纯度99.56%;肌苷成品含量99.59%,色谱纯度99.67%;透光率99.5%,灼烧残渣0.13%。
实施例3
发酵液76立方,肌苷含量59.3g/L,在搅拌条件下,调pH值至12.2,蒸汽将发酵液加热至85℃,进行陶瓷膜微滤系统过滤,压力0.2~0.5MPa,得到滤清液,加入洗水,一边过滤一边洗涤菌体,过滤完毕,菌体抽去制作菌体蛋白饲料,合并洗水和滤清液去机械蒸汽再压缩蒸发结晶系统,机械压缩二次蒸汽,加热物料,蒸发水分,得到稳定结晶颗粒,一边滤液进料一边蒸发结晶液出料进入连续分离机,控制蒸发结晶液出料肌苷33~35%含量,温度82℃,分离得到肌苷粗品。粗品母液和精品母液浓缩回收肌苷作为粗品混合精制。肌苷粗品溶解于水中,浓度28.0%,调节pH值至6.8,加热至90℃,溶解清澈,加入活性炭量为肌苷的0.6%,降温至7℃分离,干燥,得到肌苷产品3.93吨,总收率达87.2%。经检测,肌苷粗品含量73.5%,色谱纯度99.55%;肌苷成品含量99.58%,色谱纯度99.77%;透光率99.4%,灼烧残渣0.10%。
实施例4
发酵液80立方,肌苷含量65.9g/L,在搅拌条件下,调pH值至12.6,蒸汽将发酵液加热至83℃,进行陶瓷膜微滤系统过滤,压力0.2~0.5MPa,得到滤清液,加入洗水,一边过滤一边洗涤菌体,过滤完毕,菌体抽去制作菌体蛋白饲料,合并洗水和滤清液去机械蒸汽再压缩蒸发结晶系统,机械压缩二次蒸汽,加热物料,蒸发水分,得到稳定结晶颗粒,一边滤液进料一边蒸发结晶液出料进入连续分离机,控制蒸发结晶液出料肌苷34~37%含量,温度85℃,分离得到肌苷粗品。粗品母液和精品母液浓缩回收肌苷作为粗品混合精制。肌苷粗品溶解于水中,浓度28.8%,调节pH值至6.9,加热至92℃,溶解清澈,加入活性炭量为肌苷的0.7%,降温至6℃分离,干燥,得到肌苷产品4.64吨,总收率达88.0%。经检测,肌苷粗品含量72.7%,色谱纯度99.65%;肌苷成品含量99.48%,色谱纯度99.63%;透光率99.5%,灼烧残渣0.11%。
上述实施例1-4的测试方法如下:
含量
按《中华人民共和国药典》四部通则0512《高效液相色谱法》测定。具体如下:
色谱条件与系统适用性
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水(7:93)为流动相;检测波长为248nm。取肌苷对照品约10mg,加1mo1/L盐酸溶液1mL,80℃水浴加热10分钟,放冷,加1mo1/L氢氧化钠溶液1mL,加水至50mL,取20uL注入液相色谱仪,调整色谱系统,肌苷峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求,理论板数按肌苷峰计算不低于2000。
取本品适量,精密称定(精确至0.01mg),加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含20μg的溶液,摇匀,作为供试品溶液,精密量取20μL注入液相色谱仪,记录色谱图;另精密称取肌苷对照品适量,同法测定,按外标法以峰面积计算,即得。
色谱纯度
按《中华人民共和国药典》四部通则0512(高效液相色谱法》测定。具体如下:
取本品,精确至0.01g,加水溶解并稀释制成每1mL中含0.5mg的溶液,作为供试品溶液;按照含量测定的色谱条件,精密量取供试品溶液20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图至主峰保留时间的2倍。按面积百分比法计算主峰的峰面积的百分比,以主峰的面积百分比作为供试品的色谱纯度。
透光率
准确称取约0.5g样品,精确至0.0001g,加水50mL使溶解,按《中华人民共和国药典》四部通则0401《紫外-可见分光光度法》,在430nm的波长处测定透光率。
灼烧残渣
准确称取约(1.0~2.0)g样品,精确至0.0001g,按《中华人民共和国药典》四部通则0841《炽灼残渣检査法》在(700~800)℃下灼烧1.5小时。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种从发酵液中提取肌苷的方法,其步骤为:
A、将肌苷发酵液调节pH值为12~13,加热分离除去菌体,得到滤液,加热温度为80~90℃;
B、将步骤A的滤液连续加入到机械蒸汽再压缩蒸发结晶系统中,蒸发结晶,连续排出蒸发结晶液到分离机中,连续卸料,得到肌苷粗品滤饼;
C、将步骤B的肌苷粗品精制,得到肌苷产品;
所述步骤A中的分离是指采用微滤膜设备进行固液分离;所述的步骤B中排出蒸发结晶液的温度为70~90℃;所述的步骤B中排出蒸发结晶液的肌苷含量为30~60%;所述步骤C中的精制包括溶解、脱色、过滤、结晶和分离过程。
2.根据权利要求1所述的从发酵液中提取肌苷的方法,其特征在于:所述步骤A中发酵液调节pH值为12.5。
3.根据权利要求1所述的从发酵液中提取肌苷的方法,其特征在于:所述步骤B中的机械蒸汽再压缩蒸发结晶系统是单效、双效、多效蒸发结晶系统中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的从发酵液中提取肌苷的方法,其特征在于:所述步骤B中的分离机是活塞推料离心机或者螺旋卸料过滤离心机。
5.根据权利要求1所述的从发酵液中提取肌苷的方法,其特征在于:所述的步骤B中连续排出蒸发结晶液到分离机中的同时,流加洗水,洗涤粗品滤饼。
6.根据权利要求1所述的从发酵液中提取肌苷的方法,其特征在于:所述的步骤C中肌苷粗品滤饼溶解浓度为25~40%,pH值6.5~7.5,溶解温度为65~98℃。
7.根据权利要求1所述的从发酵液中提取肌苷的方法,其特征在于:所述的步骤C中脱色过程是指加入活性炭量为肌苷的0.5~3.5%,分离结晶的温度为5~25℃。
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不同PH值的发酵液超滤对粗苷中肌苷含量及收率的影响;沈爱芳;当代化工研究(第2期);第4-5页 * |
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