CN110330441A - 一种d-亮氨酸的提纯方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及氨基酸提纯技术领域，具体公开一种D‑亮氨酸的提纯方法，所述D‑亮氨酸的提纯方法包括以下步骤：a、过滤去除D‑亮氨酸发酵液中的菌体，得到滤液；b、调节滤液的pH值至5.5‑6.5，进行浓缩，加入无机盐至浓缩液中的离子强度达到0.2‑0.3mol/L，进行降温，得到D‑亮氨酸粗粉；c、将D‑亮氨酸粗粉溶于pH值为9.5‑10.5的水溶液中，再加酸调节pH值至5.5‑6.5，加入无机盐至混合溶液中的离子强度达到0.05‑0.1mol/L，进行降温结晶，过滤、干燥得到D‑亮氨酸晶体。本发明D‑亮氨酸的提纯方法简单、速度快、效果好，无有机废水排放，成本低、设备要求简单，得到的D‑亮氨酸晶体符合食品级要求。

Description

一种D-亮氨酸的提纯方法

技术领域

本发明涉及氨基酸提纯技术领域，尤其涉及一种D-亮氨酸的提纯方法。

背景技术

氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，能够在植物或动物组织中合成，也可由蛋白质水解得到，其在组织的代谢、生长、维护和修复过程中起重要作用。作为重要营养素，氨基酸可从食物中获取，无须通过其他辅助手段补充，但是，在特殊情况下，为了恢复体内代谢平衡，增强免疫力等，就需要额外的补充各种氨基酸。

亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸都是支链氨基酸，它们有助于训练后肌肉的恢复，控制血糖，并给身体组织提供能量。其中，D-亮氨酸是最有效的一种支链氨基酸，但是人体自己不能生产，只能通过饮食获得，但普通食品中几乎不含D-亮氨酸，D-亮氨酸多出现在细菌的肽聚糖中。因此，D-亮氨酸多通过发酵法获得，发酵法生产D-亮氨酸多以葡萄糖作为营养物质，在发酵过程中，由于加入的原料糖不能全部被利用，发酵液还夹带多糖、非还原糖等不能被发酵利用的物质，因此发酵结束后，发酵液中除存在D-亮氨酸外，还有蛋白质、色素、胶体物、原料还原糖、多糖、非还原糖等，以及缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等杂氨基酸。

因此，发酵液中D-亮氨酸的分离提纯关键在于杂氨基酸的分离，目前，较为有效的方法为特殊沉淀剂法和离子交换法；沉淀法提纯D-亮氨酸，常用到有机沉淀剂，该提纯方法虽然分离效果好，操作简便，但是有机废液处理困难，排放造成污染，且有机沉淀剂毒性大，易残留，食品级和医药级的D-亮氨酸不能用此法提纯，应用范围极为有限；食品级和医药级的D-亮氨酸提纯可采用离子交换法，但存在以下问题：树脂污染严重，容易引起树脂结构的破坏而失去再生能力，从而增加提纯成本，此外树脂再生需要使用大量的酸，对污水排放造成极大的负担。

发明内容

针对现有发酵液中提纯D-亮氨酸存在有机溶剂用量大、提取物不符合食品级要求、提取成本高、方法复杂以及产生大量有机废水等污染物的问题，本发明提供一种D-亮氨酸的提纯方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种D-亮氨酸的提纯方法，包括以下步骤：

a、过滤去除D-亮氨酸发酵液中的菌体和不溶性杂质，得到滤液；

b、调节滤液的pH值至5.5-6.5，进行浓缩得到浓缩液，加入无机盐至浓缩液中的离子强度达到0.2-0.3mol/L，进行降温结晶，得到D-亮氨酸粗粉；

c、将D-亮氨酸粗粉溶于pH值为9.5-10.5的水溶液中得到混合溶液，再加酸调节混合溶液的pH值至5.5-6.5，加入无机盐至混合溶液中的离子强度达到0.05-0.1mol/L，进行降温结晶，过滤、干燥得到D-亮氨酸晶体。

相对于现有技术，本发明提供的D-亮氨酸的分离方法中，将去除菌体和不溶性杂质的D-亮氨酸发酵液的pH值调节至5.5-6.5，进行浓缩，再通过加入无机盐调整浓缩液中的离子强度达到0.2-0.3mol/L，可大大加快降温过程中D-亮氨酸的结晶速度，提高D-亮氨酸的收率，从而提高D-亮氨酸粗粉中D-亮氨酸的含量；之后将得到的D-亮氨酸粗粉进一步溶解在pH值为9.5-10.5的水溶液中后，可将粗粉中的D-亮氨酸充分溶解，再加入酸反调混合溶液的pH值至5.5-6.5后，加入微量无机盐，使混合溶液中的离子强度达到0.05-0.1mol/L，可使D-亮氨酸在降温过程中有序稳定的析出，得到大小均匀、晶型结构稳定的D-亮氨酸结晶物，其纯度达到99％以上，收率达到70％以上，达到较好的分离纯化效果；

该D-亮氨酸的提纯方法简单、结晶速度快、效率高，且提纯过程中加入的少量的无机盐在D-亮氨酸晶体中无残留，无有害有机废水的排放，提纯成本低、设备要求简单，得到的D-亮氨酸晶体符合食品级要求。

优选的，所述步骤a中采用陶滤的方法去除D-亮氨酸发酵液中的菌体及不溶性杂质。

采用陶滤的方法对发酵液进行初步的除杂过程，可有效吸附发酵液中的菌体残渣以及不溶性杂质，吸附效果好且吸附量大，可经清洗后重复使用多次，降低发酵液的除杂成本。

优选的，所述步骤b中的浓缩温度为60-80℃。

在浓缩温度为60-80℃时，D-亮氨酸的结构稳定，不易被破坏，增加D-亮氨酸在浓缩过程中的稳定性。

优选的，所述步骤b中的浓缩液中D-亮氨酸的浓度为100-120g/L。

一定离子强度下，D-亮氨酸的浓度为100-120g/L时，降温过程中，D-亮氨酸的结晶速度快，结晶充分，进一步提高D-亮氨酸的收率。

优选的，所述步骤b和c中的无机盐为NaCl或KCl。

NaCl或KCl在溶液中产生的离子强度不受pH的影响，不因溶液中pH的变化而变化，且在特定pH条件下，通过控制NaCl和KCl的加入量，可以提高D-亮氨酸的结晶收率和晶体质量。

优选的，所述步骤b中的降温结晶过程中，以8-10℃/h的降温速率降温至≤15℃。

将步骤b中的浓缩液以8-10℃/h的降温速率降温至≤15℃，该降温过程可以迅速降低D-亮氨酸的溶解度，利于结晶物的析出。

优选的，所述pH调节所用的酸为硫酸或盐酸，所用的碱为氢氧化钠或氨水。

优选的，所述步骤c中的混合溶液中D-亮氨酸的浓度为80-250g/L。

优选的，所述步骤c中的降温结晶过程中，以5-6℃/h的降温速率降温至≤15℃。

所述步骤c中降温结晶过程中以5-6℃/h的降温速率降温至≤15℃，在0.05-0.1mol/L的离子强度和pH为5.5-6.5的条件下，该降温速率可以保证D-亮氨酸的稳定析出，得到晶型结构好、大小均匀的D-亮氨酸晶体。

优选的，所述步骤c中干燥前用水对结晶所得固体进行洗涤，水的温度≤6℃，水与固体的质量比为1-2:1。

在水的温度≤6℃时，即可保证D-亮氨酸不被溶解，又可充分去除结晶上吸附的无机盐杂质，保证结晶收率的情况下，提高结晶的纯度。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

取D-亮氨酸发酵液体积135L升温至80℃，搅拌状态下，保温半小时进行灭活处理，处理结束后，取样检测D-亮氨酸含量为22.60g/L，合计D-亮氨酸3.05kg，控制物料温度低于40℃，压力小于0.65MPa，流速200L/h过陶滤，除去菌渣和部分杂质，共收集陶滤液117L，取样检测滤液中D-亮氨酸浓度为22.97g/L，合计D-亮氨酸2.69kg。

将所得陶滤清液调节PH至5.5，60℃下进行浓缩得到浓缩液，使浓缩液中D-亮氨酸的浓度达到100g/L，向浓缩液中加入NaCl，调节浓缩液中的离子强度达到0.2mol/L后，进行梯度降温，降温速率为8℃/h，直到浓缩液温度降至15℃以下，结晶得到D-亮氨酸湿粉3.48kg；

将D-亮氨酸湿粉溶于25L的PH为10的氢氧化钠水溶液中，充分溶解后，补加纯化水至D-亮氨酸浓度为80g/L，此时溶液的体积为30L，向溶液中加入硫酸溶液，反调PH为5.5-6.5后，加入NaCl调节溶液的离子强度达到0.05mol/L，以5℃/h的降温速率进行降温，当温度降至15℃时，搅拌30min进行结晶，过滤分离结晶，用与结晶质量相同的6℃的冷水对结晶进行洗涤，洗涤结束后，在60℃、真空度为-0.095MPa条件下对结晶进行干燥，最终得到2.23kg D-亮氨酸晶体。

整个提纯过程在洁净区生产，所得产品纯度为99.1％，水分含量为0.06wt％，收率为72.5％；其中D-亮氨酸的收率＝(D-亮氨酸晶体质量×D-亮氨酸晶体纯度)/发酵液中D-亮氨酸的质量×100％。

实施例2

取D-亮氨酸发酵液体积135L升温至80℃，搅拌状态下，保温半小时进行灭活处理，处理结束后，取样检测D-亮氨酸含量为41.89g/L，合计D-亮氨酸5.65kg，控制物料温度低于40℃，压力小于0.65MPa，流速220L/h过陶滤，除去菌渣和部分杂质，共收集陶滤液120L，取样检测滤液中D-亮氨酸浓度为40.91g/L，合计D-亮氨酸4.91kg。

将所得陶滤清液调节PH至6，70℃下进行浓缩得到浓缩液，使浓缩液中D-亮氨酸的浓度达到110g/L，向浓缩液中加入NaCl，调节浓缩液中的离子强度达到0.25mol/L后，进行梯度降温，降温速率为9℃/h，直到浓缩液温度降至15℃以下，结晶得到D-亮氨酸湿粉6.72kg；

将D-亮氨酸湿粉溶于25L的PH为9.5的氢氧化钠水溶液中，充分溶解后，补加纯化水至D-亮氨酸浓度为150g/L，此时溶液的体积为30L，向溶液中加入盐酸溶液，反调PH为6后，加入KCl调节溶液的离子强度达到0.08mol/L，以6℃/h的降温速率进行降温，当温度降至15℃时，搅拌30min进行结晶，过滤分离结晶，用与结晶质量相同的5℃的冷水对结晶进行洗涤，洗涤结束后，在80℃、真空度为-0.095MPa条件下对结晶进行干燥，最终得到4.22kgD-亮氨酸晶体。

整个提纯过程在洁净区生产，所得产品纯度为99.3％，水分含量为0.04wt％，收率为74.1％。

实施例3

取D-亮氨酸发酵液体积135L升温至80℃，搅拌状态下，保温半小时进行灭活处理，处理结束后，取样检测D-亮氨酸含量为43.1g/L，合计D-亮氨酸5.81kg，控制物料温度低于40℃，压力小于0.65MPa，流速250L/h过陶滤，除去菌渣和部分杂质，共收集陶滤液121L，取样检测滤液中D-亮氨酸浓度为43.26g/L，合计D-亮氨酸5.23kg。

将所得陶滤清液调节PH至6.5，80℃下进行浓缩得到浓缩液，使浓缩液中D-亮氨酸的浓度达到120g/L，向浓缩液中加入NaCl，调节浓缩液中的离子强度达到0.3mol/L后，进行梯度降温，降温速率为10℃/h，直到浓缩液温度降至15℃以下，结晶得到D-亮氨酸湿粉6.99kg；

将D-亮氨酸湿粉溶于15L的PH为10.5的氢氧化钠水溶液中，充分溶解后，补加纯化水至D-亮氨酸浓度为250g/L，此时溶液的体积为18L，向溶液中加入盐酸溶液，反调PH为6.5后，加入NaCl调节溶液的离子强度达到0.1mol/L，以6℃/h的降温速率进行降温，当温度降至15℃时，搅拌30min进行结晶，过滤分离结晶，用与结晶质量相同的4℃的冷水对结晶进行洗涤，洗涤结束后，在80℃、真空度为-0.095MPa条件下对结晶进行干燥，最终得到4.15kgD-亮氨酸晶体。

整个提纯过程在洁净区生产，所得产品纯度为99％，水分含量为0.1wt％，收率为70.7％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种D-亮氨酸的提纯方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、过滤去除D-亮氨酸发酵液中的菌体和不溶性杂质，得到滤液；

b、调节滤液的pH值至5.5-6.5，进行浓缩得到浓缩液，加入无机盐至浓缩液中的离子强度达到0.2-0.3mol/L，进行降温结晶，得到D-亮氨酸粗粉；

c、将D-亮氨酸粗粉溶于pH值为9.5-10.5的水溶液中得到混合溶液，再加酸调节混合溶液的pH值至5.5-6.5，加入无机盐至混合溶液中的离子强度达到0.05-0.1mol/L，进行降温结晶，过滤、干燥得到D-亮氨酸晶体。

2.如权利要求1所述的D-亮氨酸的提纯方法，其特征在于：所述步骤a中采用陶滤的方法去除D-亮氨酸发酵液中的菌体及不溶性杂质。

3.如权利要求1所述的D-亮氨酸的提纯方法，其特征在于：所述步骤b中的浓缩温度为60-80℃。

4.如权利要求1所述的D-亮氨酸的提纯方法，其特征在于：所述步骤b中的浓缩液中D-亮氨酸的浓度为100-120g/L。

5.如权利要求1所述的D-亮氨酸的提纯方法，其特征在于：所述步骤b和c中的加入的无机盐为NaCl或KCl。

6.如权利要求1所述的D-亮氨酸的提纯方法，其特征在于：所述步骤b中的降温结晶过程中，以8-10℃/h的降温速率降温至≤15℃。

7.如权利要求1所述的D-亮氨酸的提纯方法，其特征在于：所述pH调节所用的酸为硫酸或盐酸，所用的碱为氢氧化钠或氨水。

8.如权利要求1所述的D-亮氨酸的提纯方法，其特征在于：所述步骤c中的混合溶液中D-亮氨酸的浓度为80-250g/L。

9.如权利要求1所述的D-亮氨酸的提纯方法，其特征在于：所述步骤c中的降温结晶过程中，以5-6℃/h的降温速率降温至≤15℃。

10.如权利要求1所述的D-亮氨酸的提纯方法，其特征在于：所述步骤c中干燥前用水对结晶所得固体进行洗涤，水的温度≤6℃，水与固体的质量比为1-2:1。