CN105949088B - 从虾中提取天然牛磺酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从虾中提取天然牛磺酸的方法，属于天然产物提取技术领域。本发明从虾中提取天然牛磺酸的方法包含下列步骤：S1利用虾制备含牛磺酸的清液；S2将所述清液除蛋白；S3将所述步骤S2的产品进行分离纯化。本发明的有益效果为：原料为海产品加工下脚料，成本价格低廉，不存在环境污染的问题。且工艺操作简单，产量大，纯度高。采用从含牛磺酸量最高的海产品中提取，取用大连地区最普遍的虾头及虾的下脚料作为原料。温和方式提取，继而经过一列的操作后，无有机溶剂残留，做到天然提取。
Description
技术领域
本发明属于化学提取技术领域，特别是一种从虾中提取天然牛磺酸的方法。
背景技术
牛磺酸是一种含硫的β氨基酸,具有广泛的生物学功能，主要有促进大脑发育，增强视力，调节神经传导，促进吸收、消化脂肪，参与胆固醇的代谢，维护心脑血管，内分泌机能，抗氧化等的作用。因而具有提高记忆力，增强视力，减脂，降低胆固醇，保护心脑血管，抗衰老，提高免疫力等都具有一定功效。随着对牛磺酸的作用机理的深入研究，其应用也将越来越广泛。牛磺酸作为人和动物的一种重要营养物质，从天然产物中提取一直备受重视。
普通食物中牛磺酸含量极低或还有待发现，但海产品却含有很高的含量。我国海洋生物资源丰富，例如牡蛎、扇贝、章鱼等海产品中含量丰富，但产品本身价格比较昂贵，如果从他们中提取牛磺酸则成本较高。本课题通过前期调查研究，发现贻贝、海虹和虾头及虾的下脚料中同样含有丰富的牛磺酸。这些产品在大连地区广泛存在，且价格低廉。从海产品中提取牛磺酸的工艺简单而无污染，并且用水产品的下脚料提取牛磺酸又具有环保的意义，前景非常好。
自1950年初以来，在世界上开始人工合成牛磺酸。目前，国内外市场上使用的牛磺酸有化学合成的牛磺酸和天然牛磺酸，但其中多为化学合成法生产。虽然合成法牛磺酸价格低廉，但存在原料毒性大，工艺操作复杂，环境污染等问题。随着人民生活水平的提高和绿色化学的进展，人们越来越提倡使用天然提取的牛磺酸。因此，从天然产物中提取牛磺酸成为市场迫切需求，具有很大的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，将牛磺酸通过除蛋白、脱色、分离纯化等方法从虾中提取。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：从虾中提取天然牛磺酸的方法，包含下列步骤：S1利用虾制备含牛磺酸的清液；S2将所述清液除蛋白；S3将所述步骤S2的产品进行分离纯化。
优选地，所述步骤S1包含下列步骤：S1.1将虾清洗去壳取出虾肉；S1.2将虾肉放入到组织捣碎机中匀浆；S1.3将匀浆后虾肉称重并用3倍质量的水稀释；S1.4调节pH值；S1.5采用超声破碎和木瓜蛋白酶提取；S1.6将水提取产物进行过滤，取滤液。
优选地，所述步骤S2包含下列步骤：S2.1除酸性蛋白；S2.2除碱性蛋白。
优选地，所述步骤S2.1除酸性蛋白采用盐酸将所属步骤S1产物的pH调至3-4，然后在4500r/min下离心20分钟，并收集上清液。
优选地，所述步骤S2.2除碱性蛋白采用氢氧化钠将所述步骤S2.1的产物的pH调至9-10，在4500r/min下离心20分钟，收集上清液。
优选地，所述步骤S3的具体步骤为：S3.1调节所述步骤S2产物的pH到4-5；S3.2将所述步骤S3.1的产物注入强酸性阳离子树脂交换柱，并采用蒸馏水进行洗脱；S3.3收集吸光度最高峰值0.55左右的部分流出液。
优选地，所述步骤S2与所述步骤S3之间存在对所述步骤S2产物进行脱色的步骤。
优选地，所述脱色步骤具体包含：向所述步骤S2的产物中加入活性炭进行脱色。
优选地，向每100mL所述步骤S2的产物中加入2～3g活性炭。
本发明的优点和积极效果是：原料无毒性益获取，不存在环境污染的问题。且工艺操作简单，产量大。采用从含牛磺酸量最高的海产品中提取，取用大连地区最普遍的虾头及虾的下脚料作为原料。温和方式提取，继而经过一列的操作后，无有机溶剂残留，做到天然提取。
附图说明
图1为牛磺酸的标准曲线图；
图2为牛磺酸标准品红外光谱图；
图3为实验提取牛磺酸的红外光谱图；
图4为牛磺酸标准品核磁共振氢谱图；
图5为牛磺酸样品品核磁共振氢谱图。
具体实施方式
下面结合附图、通过具体实施例对本发明作进一步详述。以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和器材，均可从商业途径获得。
实验试剂
实验仪器
标准曲线回归方程的确定
分别取10mmol/L牛磺酸标准液0mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL，定容至10ml，各取一毫升，加入1ml显色剂、8ml 1mol/L醋酸钠，在400nm下测量OD值，得到标准曲线(如图1)。
显色剂由10ml 1mol/L醋酸钠、0.4ml乙酰丙酮、1ml甲醛用去离子水定容至25ml配制，需临用现配。颜色反应背后的原因是，在含有醋酸钠的溶液中,牛磺酸与乙酰丙酮和甲醛在高温条件下可以产生N-取代基2,6-二甲基3,5-二乙酰基1,4二氢吡啶。这种配合物能够呈现出明显的黄色,并且牛磺酸含量越高，则颜色越明显,最大吸收波长为390～400nm。
本发明所使用的牛磺酸显色原理为：在醋酸钠存在下,牛磺酸与乙酰丙酮和甲醛经加热反应生成N-取代基2,6-二甲基3,5-二乙酰基1,4二氢吡啶配合物。该配合物显黄色,其吸光度与牛磺酸含量在一定范围内成正比,最大吸收波长为390～400nm。
实施例1
步骤1：含牛磺酸清液的制备
将虾头及虾的下脚料粉碎，加入纯水，搅拌10min，搅拌器转速30r/min，将经过匀浆的虾肉用等量体积的水稀释后调节pH值至中性。
步骤2：超声破碎
为方便牛磺酸更好的融入匀浆液中，根据实验组的不同，使用超声波破碎仪分别进行5min、10min、15min、20min、25min的破碎，利用水循环抽滤机对匀浆液进行过滤，取滤液。
步骤3：酶法粗提牛磺酸
取破碎好的匀浆液30ml，向其中加入0.5g中性木瓜蛋白酶，混匀后调节pH至指定值放入指定温度恒温水域锅中，静置20min，中间搅动几次。将提取完成的匀浆液，放入100摄氏度的水浴锅中加热15min，使木瓜蛋白酶在高温作用下失去活性。
单因素实验过程中，取三个变量，除上述提到的超声波破碎时间，还有酶提取的温度和pH，每个变量各设五个水平。经查询，实验所使用的木瓜蛋白酶的使用pH为6～7，使用温度为55～65℃，将其pH范围扩至5.5～7.5，并以每相差0.5为一个档进行单因素实验；将其温度范围扩至45～65℃，并以每5℃为一个档。
正交实验过程当中，依据钟形曲线，从五个条件设置中选出四个条件，进行三因素四水平的正交实验。
步骤4：除蛋白
取灭酶后的虾肉匀浆液(提取液)，使用循环水真空抽滤装置反复抽滤2～3次至提取液呈微微发白的清澈溶液。
用5％HCl(质量比，下文所提到的所有百分比均为质量比)调节提取液pH至4～5，常温、4500r/min离心15min。留上清液。
上一步中获得的上清液用浓度为5％NaOH调节pH至9～10，并继续在常温条件下、以4500r/min的速度离心15min。留上清液。
步骤5：脱色
向收集的上清液中加入适量的活性炭进行脱色，优选方案为每100mL加入2～3g，将过滤后的溶液pH用5％HCl调节至4.5，待用。
步骤6：分离纯化
吸取8.0mL收集的溶液注入7cm×60cm强酸性阳离子树脂交换柱，并采用蒸馏水进行洗脱，洗脱速度在2mL/min,收集吸光度最高峰值左右的部分流出液。
步骤7：提取量的测定
采用甲醛-乙酰丙酮法测定牛磺酸的提取量。取1mL流出液或其稀释液，加1mol/L醋酸钠溶液8mL，加入1mL甲醛-乙酰丙酮作为显色剂，配制10mL溶液，在100℃水浴中保温15分钟，冷却至室温，在400nm波长处测定吸光度，通过牛磺酸标准溶液吸收曲线(如图1所示)，确定牛磺酸的提取量。
步骤8：检测结晶
采用紫外分光光度法检测含有牛磺酸的组分，将其放到4℃冰箱中放置2h，得到牛磺酸粗品结晶。将粗品重新溶解于水，过滤后，再加入无水乙醇，放置于4℃重结晶，将固液进行分离，如此结晶，再反复重结晶，即可得到纯的牛磺酸晶体。
单因素实验
单因素实验的基本思路是，固定其余两个变量，改变其中一个变量，获得一组数据。将获得的最适宜条件，作为下一个单因素实验的固定量。以此类推，分别完成超声波破碎时间、酶提取温度、pH的三组单因素实验。
单因素组别设置见表1.
表1.单因素条件
每个变量按照上述条件各进行五次实验，根据结果，获得对虾中提取牛磺酸影响最显著的变量，并在变量中依据钟形曲线选定四个值，进行下一步的正交实验。
表2.温度对吸光值的影响
表3.pH对吸光值的影响
表4.超声波破碎时间对吸光值的影响
利用单因素方差分析，可以得知，温度和pH值都对牛磺酸的提取量在95％的水平上有显著影响。
正交实验
根据单因素实验确定了大概的条件范围，为减少实验次数，采用正交实验来进行组合实验，以期获得虾中提取牛磺酸的最佳提取条件，并获得最大的牛磺酸提取量。具体正交实验的组别和所获得的吸光度值见表5。
表5.正交实验条件设置及其结果
表6.主体间效应的检验
因变量：吸光度
a.R2＝0.279(调整R2＝-0.802)
根据吸光值可得，虾中提取牛磺酸的最佳条件为pH＝5.5，酶解温度65℃，超声破碎时间25min。由回归方程计算可得制得的牛磺酸提取液中牛磺酸的浓度为0.3125mg/ml。
通过一系列单因素和多因素实验，最后获得了虾中得到牛磺酸的最佳实验设置为pH＝5.5，酶解温度65℃，超声破碎时间25min。根据此条件，取市售牛磺酸200g，按照上述步骤操作去处杂蛋白等，将提取液浓缩至30ml，纯化，再将收集的流出液浓缩至15ml。加入三倍体积无水乙醇，置于4℃冰箱中使其结晶。得到牛磺酸结晶1.06g，得率为0.53％。
红外检测
在牛磺酸的红外检测实验中，采用了溴化钾压片法，具体实验的实施是参照国家标准GB/T 6040-2002《红外光谱分析方法通则》进行的。如图2、3，比对样品和牛磺酸标准品的红外吸收峰图片，可获知经无水乙醇处理析出的白色针状晶体就是高纯度天然牛磺酸。
核磁检测
如图4、5,所示，核磁共振谱图中出现三个信号，说明有三种不同种类的H，非别是δ4.646、δ3.296和δ3.132[27]经比对，这些数据与标准品相类似，说明从虾匀浆液中获取的白色针状晶体为高纯度天然牛磺酸晶体。
Claims (1)
1.从虾中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，包含下列步骤：
S1 利用虾制备含牛磺酸的清液；
S1.1将虾清洗去壳取出虾肉；
S1.2将虾肉放入到组织捣碎机中匀浆；
S1.3将匀浆后虾肉量体积并用等倍体积的水稀释；
S1.4调节pH值中性；
S1.5采用超声破碎和木瓜蛋白酶提取：使用超声波破碎仪进行25min的破碎对匀浆液进行过滤，取滤液；取破碎好的匀浆液30ml，向其中加入0.5g中性木瓜蛋白酶，混匀后调节pH=5.5，放入65℃的恒温水浴 锅中，静置20min，中间搅动几次；
S1.6将水提取产物进行过滤，取滤液，放入100摄氏度的水浴锅中加热15min，使木瓜蛋白酶在高温作用下失去活性；
S2 将所述清液除蛋白；
S2.1除酸性蛋白：采用盐酸将所属步骤S1产物的pH调至3-4，然后在4500r/min下离心20分钟，并收集上清液。
S2.2 除碱性蛋白：采用氢氧化钠将所述步骤S2.1的产物的pH调至9-10，在4500r/min下离心 20分钟，收集上清液；
每100mL收集的上清液中加入2～3g的活性炭进行脱色，将过滤后的溶液pH用5% HCl调节至4.5；
S3 将所述步骤S2的产品进行分离纯化；
吸取收集的溶液注入强酸性阳离子树脂交换柱，并采用蒸馏水进行洗脱，洗脱速度在2mL/min,收集吸吸光度最高峰值0.55左右的部分流出液；
S4 检测结晶；
采用紫外分光光度法检测含有牛磺酸的组分，将其放到4℃冰箱中放置2h，得到牛磺酸粗品结晶，将粗品重新溶解于水，过滤后，再加入无水乙醇，放置于4℃重结晶，将固液进行分离，如此结晶，再反复重结晶，即可得到纯的牛磺酸晶体。
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