CN101475620B - 高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法。包括从虫草子实体、菌丝体和虫草固体发酵培养基中提取、分离、精制和干燥虫草素四个步骤，其中提取步骤采用柱层析循环提取法；分离步骤采用大孔吸附树脂吸附法；精制步骤采用聚酰胺树脂吸附和沉淀与结晶的方法；干燥步骤采用真空干燥法。本发明由于采用了以上新的方法和工艺；提取过程中不需加热，提取液不需要离心或过滤分离，也不需要浓缩而直接上大孔吸附树脂吸附.使用简单的提取分离设备和最少量的提取溶剂，可使提取率达到95％以上；生产的虫草素产品纯度达到98％以上。是一种提取率高、设备投资低、高效节能的高纯度虫草素的提取与生产方法。

Description

高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法

技术领域

本发明是一种高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法，属于天然功能物质虫草素的提取分离与高纯度产品生产方法的创新技术。

背景技术

到目前为止报道天然功能物质虫草素的提取方法主要为溶剂浸泡提取法，超声波法、索氏法和回流法等，以超声波辅助的酸性水提取法效果最佳。虫草素的分离纯化方法有离子交换树脂法，活性炭吸附、氧化铝柱层析、硅胶柱层析和超临界萃取等方法。其中以732阳离子交换树脂法效果较好，可获得一定纯度的虫草素产品。到高纯度虫草素制备只有用制备型液相色谱法的报道。

这些工艺存在的缺点是：

1)提取过程复杂，提取效率低，溶剂用量大，浓缩等过程耗能大。

2)离子交换树脂法吸附量小，虫草素与杂质的分离效果不理想.

3)用制备型液相色谱法纯化精制的设备投资高，生产成本高，每次可制备的量很少。

发明内容

本发明的目的在于考虑上述问题而提供一种提取效率高、设备投资低、高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法。

本发明的技术方案是：本发明高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法，包括从虫草子实体、菌丝体和和虫草固体培养基中进行提取、分离、精制和干燥虫草素四个步骤，其特征在于提取步骤采用柱层析循环提取法，分离步骤采用大孔吸附树脂吸附法，精制步骤采用聚酰胺树脂吸附和沉淀与结晶的方法，干燥采用真空干燥法。

上述提取步骤采用的柱层析循环提取法包括如下步骤：

1)将干燥的待提取的虫草固体培养基、虫草子实体或菌丝体材料粉碎至40目以上；

2)按待提取材料干重与提取溶剂之比或料液比为1∶3～1∶8的比例，将材料用提取溶剂或水在室温下浸泡至完全吸涨；

3)将充分吸涨的虫草固体培养基、虫草子实体或菌丝体材料与浸泡溶剂一起转入层析柱或类似容器中，柱高为柱直径的5～10倍或以上；室温下，用柱层析洗脱的方法将虫草素从层析柱内的材料中洗脱出来；

4)用材料干重3～5倍体积的水在前后不同批次材料中循环提取2～3次，即用纯净溶剂或水提取第三次，然后用它提取第二次，最后用它浸泡材料；收集每条层析柱中最初的3～5倍体积的流出液作为提取液，第二个3～5倍体积的流出液用于下一批材料的浸泡，第三个3-5倍体积的流出液用于下一批材料的洗脱液。

上述步骤2)如为湿材料则根据其含水量调整至上述料液比。

上述步骤3)柱高应为柱直径的5～10倍或以上，洗脱流速为每小时1-4BV。

上述分离步骤采用的大孔吸附树脂法包括如下步骤：

1)样品与加样，用氢氧化钠将提取液的pH调至碱性，将提取液直接流过制备好的大孔吸附树脂柱，加样量因提取液中虫草素与杂质含量而异，加样液的体积为大孔树脂柱体积的1～4倍量为宜，流速控制在每小时1～4BV；

2)用2～4BV的碱性纯净水洗柱，可将绝大部分杂质洗出，不损失虫草素；

3)用1～2BV的20％～60％的低级醇的水溶液洗脱虫草素，收集洗脱液，如果严格按照柱层析的加样，水洗杂质和虫草素洗脱过程要求，并同时检测流出液中的虫草素，使虫草素洗脱液体积减少到约1/3～1BV；

4)将洗脱液减压浓缩至约1/5-1/20体积，即为虫草素分离液。

上述大孔吸附树脂法的步骤1)及步骤2)的碱性为pH 9.0。

上述大孔吸附树脂法步骤3)用1～2BV的40％的乙醇或甲醇的酸性或pH3.0的水溶液洗脱虫草素。

上述精制步骤采用醇聚酰胺树脂吸附和沉淀与结晶的方法；

1)在虫草素分离液中加入2～5倍体积的95％～100％的醇类，充分混合后，在室温15℃～35℃下放置2～12小时或以上，减压过滤或离心除去沉淀；

2)滤液或离心上清液减压浓缩至水相，置于0～10℃下结晶过夜，离心得虫草素粗制品；

3)虫草素粗制品用水或醇加热溶解，4℃结晶，离心分离沉淀，反复结晶一至多次，至溶液无色、结晶为纯白色为止。

4)虫草素结晶中尚有微量的色素，需要除去时，用蒸馏水将结晶完全溶解，溶液流过聚酰胺树脂柱，并用2～3BV的蒸馏水洗柱，收集过柱液和洗柱液，减压浓缩至可结晶的体积，0～10℃结晶，结晶真空干燥，得纯度为98％或以上的虫草素精品。

上述醇聚酰胺树脂吸附和沉淀与结晶方法的步骤1)采用95％的食用级乙醇。

上述醇聚酰胺树脂吸附和沉淀与结晶方法的步骤1)的室温是15℃～35℃。

本发明的高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法，其与现有技术相比，具有如下优点：

1)设备投资少。本工艺不需要复杂的提取、分离和纯化设备，不需要渣液分离设备.整个提取、分离和纯化过程可在简单的容器和层析柱内完成.使用本工艺的提取分离和纯化装置只需要现有生产设备投资的1/3～1/2。

2)提取分离全过程在室温下进行，不需加热，提取溶剂用量和最终提取液体积只有材料于重的约4倍，提取液不需要浓缩，可直接进入树脂分离步骤.可节约大量能源、人工和减少因高温提取所引起的有效成分变化和损失。

3)提取过程采用高效的柱层析洗脱方法。并通过溶剂循环法，用少量体积的提取液可使提取率达到95％～100％.

4)分离步骤采用高吸附与分离能力的大孔吸附树脂吸附分离法.对虫草素的吸附量大，吸附稳定，对大多数杂质的吸附力小.分离效果好.

5)纯化与精制步骤采用了聚酰胺树脂吸附和沉淀与结晶法.不需要特殊设备，每次可处理大量样品.可根据产品纯度要求，灵活调整重结晶次数.

6)提取和分离步骤可通过多条层析柱组合成一条连续自动的生产线，不间断地获得提取物和分离纯化产品.

附图说明：

图1是本发明从虫草和虫草培养基中提取分离和生产高纯度虫草素的工艺流程图；

图2是本发明干燥的虫草子实体和虫草固体培养基的吸水饱和曲线图；

图3是本发明材料粉碎度对提取效率的影响的示意图；

图4是本发明不同浸泡时间对干燥的虫草固体培养基(A)和虫草子实体(B)虫草素提取率的影响的示意图；

图5是本发明柱层析提取温度和流速对虫草子实体中虫草素提取的影响的示意图；

图6是本发明柱高与柱直径之比对虫草素柱层析提取率的影响的示意图；

图7是本发明柱层析提取与浸泡提取的提取效率比较的示意图；

图8是本发明柱层析循环提取与非循环提取虫草素的效果比较的示意图；

图9是本发明用高效液相色谱检测虫草素标准品(A)和本法生产的虫草素产品(B)的示意图。

具体实施方式：

实施例：

本发明的流程图如图1所示，发明高效节能的虫草素提取与生产方法，包括有提取、分离、精制和干燥四个步骤，其中提取步骤采用柱层析提取法，分离步骤采用大孔树脂吸附法，精制步骤采用聚酰胺树脂吸附和沉淀结晶法。

上述高效节能的虫草素提取与生产方法的过程包括如下步骤：

1)将干燥的待提取的虫草固体培养基或虫草子实体材料粉碎至约20目.材料不宜过细，否则溶剂流动困难；

2)按待提取材料干重与提取溶剂之比或料液比为1∶4(虫草固体培养基)或1∶6(虫草子实体)的比例，室温下浸泡材料，至材料完全吸涨，如干燥的虫草固体培养基浸泡6小时，干燥的虫草子实体浸泡1小时，湿材料根据其含水量调整至上述料液比；

3)将充分吸涨的虫草固体培养基或虫草子实体材料与浸泡溶剂一起转入层析柱或类似容器中，室温下，用柱层析洗脱的方法将虫草素从层析柱内的材料中洗脱出来。为达到高效率提取的目的，洗脱过程必须严格按照柱层析中物质洗脱的方法；层析柱中材料的高度应为柱直径的5～10倍或以上，洗脱流速为约2BV/小时，柱内液面必须始终高于材料；

4)柱内流出的洗脱液以材料干重的4倍体积为单位分开收集，第一个4倍体积的洗脱液含有高浓度的虫草素，作为虫草素提取液直接用于树脂吸附分离；第二个4倍体积的洗脱液含有较低的虫草素，用于下一批材料的浸泡；第三个4倍体积的洗脱液中虫草素含量很低，用于下一批材料的提取液；这样，每份纯净水在前后不同批次的材料中由含量低到高的次序循环提取3次.每份材料实际上经过材料干重12倍提取的提取液提取，而最终收集的提取液体积只有材料干中的4倍体积；大规模连续生产时，用3或4条层析柱组合成一条连续自动的生产线，可以不间断地收取提取液进入下一道大孔树脂分离工序；

5)大孔树脂柱的制备，DM130大孔树脂分别用0.1M盐酸，0.1MNaOH和95％食用酒精分别浸泡12小时，纯净水充分洗涤，装柱后再水洗2～3BV；

6)样品与加样，用盐酸将提取液的pH调至约9.0，然后将提取液以2BV/小时的流速加入制备好的大孔吸附树脂柱；加样量因提取液中虫草素与杂质含量而异，加样液的体积以不超过大孔树脂柱体积的4倍量(1BV)为佳；加样时尽量不要冲动树脂柱的上部；

7)待样品完全流入柱内后，用2～4BV的pH 9.0的碱性纯净水洗柱，可将绝大部分杂质洗出，不损失虫草素，水洗体积通常不超过4BV，否则有虫草素损失；

8)用1～2BV的40％的pH3.0酸性乙醇洗脱虫草素，收集40％乙醇洗脱液，如果层析技术好，装柱、加样、水洗杂质和虫草素洗脱等过程控制得好，虫草素可在相对较窄的色谱带集中流出，如结合洗脱液中虫草素的检测，可使虫草素洗脱液体积减少到1/3～1BV，虫草素与一条深黑色的色素带几乎同时移动，可作为层析洗脱时的目测指标；

9)将40％乙醇洗脱液减压浓缩至约1/10体积，即为虫草素分离液；

10)在虫草素分离液中加入4倍体积的95％的食用级乙醇，充分混合后，在15℃～35℃的室温放置约12小时或以上，减压过滤或离心除去沉淀；

11)滤液或离心上清液减压浓缩至水相，置于4℃冰箱内结晶过夜，离心得虫草素粗制品；

12)虫草素粗制品用水或醇加热溶解，4℃结晶，离心分离沉淀，反复结晶一至多次，至溶液无色、结晶为纯白色为止。

13)所得白色结晶尚含有微量色素.用蒸馏水将结晶完全溶解，溶液流过聚酰胺树脂柱，并用2～3BV的蒸馏水洗柱，收集过柱液和洗柱液，减压浓缩至可结晶的体积，0～10℃结晶，结晶真空干燥，可得纯度为98％或以上的虫草素精品。

Claims (7)

1.一种高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法，包括从虫草子实体、菌丝体和虫草固体培养基中进行提取、分离、精制和干燥虫草素四个步骤，其特征在于提取步骤采用柱层析循环提取法，分离步骤采用大孔吸附树脂吸附法，精制步骤采用聚酰胺树脂吸附和沉淀与结晶的方法，干燥采用真空干燥法，

上述提取步骤采用的柱层析循环提取法包括如下步骤：

1)将干燥的待提取的虫草固体培养基、虫草子实体或菌丝体材料粉碎至40目以上；

2)按待提取材料干重与水之比或料液比为1∶3～1∶8的比例，将材料用水在室温下浸泡至完全吸涨；

3)将充分吸涨的虫草固体培养基、虫草子实体或菌丝体材料与浸泡溶剂一起转入层析柱或类似容器中，柱高为柱直径的5～10倍；室温下，用柱层析洗脱的方法将虫草素从层析柱内的材料中洗脱出来；

4)用材料干重3～5倍体积的水在前后不同批次材料中循环提取3次，即用水提取第三批次，然后用它提取第二批次，最后用它浸泡材料；收集每条层析柱中最初的3～5倍体积的流出液作为提取液，第二个3～5倍体积的流出液用于下一批材料的浸泡，第三个3-5倍体积的流出液用于下一批材料的洗脱液；

上述分离步骤采用的大孔吸附树脂法包括如下步骤：

1)样品与加样，用氢氧化钠将提取液的pH调至碱性，将提取液直接流过制备好的大孔吸附树脂柱，加样量因提取液中虫草素与杂质含量而异，加样液的体积为大孔树脂柱体积的1～4倍量，流速控制在每小时1～4BV；

2)用2～4BV的碱性纯净水洗柱，将绝大部分杂质洗出，不损失虫草素； 

3)用1～2BV的40％的乙醇或甲醇的酸性水溶液洗脱虫草素，收集洗脱液，如果严格按照柱层析的加样，水洗杂质和虫草素洗脱过程要求，并同时检测流出液中的虫草素，使虫草素洗脱液体积减少到1/3～1BV；

4)将洗脱液减压浓缩至1/5～1/20体积，即为虫草素分离液。

2.根据权利要求1所述的高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法，其特征在于上述提取步骤中的步骤2)如为湿材料则根据其含水量调整至上述料液比。

3.根据权利要求1所述的高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法，其特征在于上述提取步骤中的步骤3)柱高应为柱直径的5～10倍，洗脱流速为每小时1-4BV。

4.根据权利要求1所述的高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法，其特征在于上述分离步骤中的步骤1)及步骤2)的碱性为pH 9.0。

5.根据权利要求1所述的高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法，其特征在于上述精制步骤采用醇聚酰胺树脂吸附和沉淀与结晶的方法；

1)在虫草素分离液中加入2～5倍体积的95％～100％的醇类，充分混合后，在室温放置2～12小时，减压过滤或离心除去沉淀；

2)滤液或离心上清液减压浓缩至水相，置于0～10℃下结晶过夜，离心得虫草素粗制品；

3)虫草素粗制品用水或醇加热溶解，4℃结晶，离心分离沉淀，反复结晶一至多次，至溶液无色、结晶为纯白色为止；

4)虫草素结晶中尚有微量的色素.需要除去时，用蒸馏水将结晶完全溶解，溶液流过聚酰胺树脂柱，并用2～3BV的蒸馏水洗柱，收集过柱液和洗柱液，减压浓缩至可结晶的体积，0～10℃结晶，结晶真空干燥，得纯度为98％或以上的虫草素精品。 

6.根据权利要求5所述的高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法，其特征在于上述精制步骤采用醇聚酰胺树脂吸附和沉淀与结晶的方法中的步骤1)采用95％的食用级乙醇。

7.根据权利要求5所述的高效节能的高纯度虫草素提取与生产方法，其特征在于上述精制步骤采用醇聚酰胺树脂吸附和沉淀与结晶的方法中的步骤1)的室温是15℃～35℃。 

Images