CN110229859A

CN110229859A - 一种低值鱼内脏蛋白源抗氧化钙离子螯合肽的高效制备工艺

Info

Publication number: CN110229859A
Application number: CN201910526877.7A
Authority: CN
Inventors: 张怡; 王健一; 郑宝东; 李致瑜; 曾绍校; 郭泽镔; 曾红亮
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2019-06-18
Filing date: 2019-06-18
Publication date: 2019-09-13

Abstract

本发明公开了一种低值鱼内脏蛋白源抗氧化钙离子螯合肽的高效制备工艺，涉及微波预处理；超声波辅助酶解；超滤处理；CaCl₂螯合；以及凝胶柱处理；本发明通过Ca²⁺与抗氧化肽相结合，提高了抗氧化肽的结构稳定性，形成抗氧化钙离子螯合肽，具有较强的抗氧化活性以及在加工和贮藏过程中的抗氧化稳定性，并以金线鱼内脏为原料，来源广，成本低，解决了鱼糜加工过程中产生副产物的问题，对进一步提高金线鱼的经济价值值具有的理论意义；此外，本发明通过微波处理金线鱼内脏蛋白，降低蛋白中的有序结构并提高其的溶解性，在此基础上，将超声波处理和蛋白酶酶解结合，提高水解度和得率；同时通过多次分离纯化、获得可靠的金线鱼内脏抗氧化钙离子螯合肽。

Description

一种低值鱼内脏蛋白源抗氧化钙离子螯合肽的高效制备工艺

技术领域

本发明属于水产加工技术领域，具体涉及一种低值鱼内脏蛋白源抗氧化钙离子螯合肽的高效制备工艺。

背景技术

金线鱼(Nemipterus virgatus)属鲈形目、金线鱼科、金线鱼属，广泛分布于、菲律宾、印尼、越南、泰国、澳洲等海域，其中我国以东海南部和北部湾海区产量最高，已成为当地乃至我国重要的海洋经济鱼类之一。由于金线鱼鱼肉具有肉厚刺少，肉质细腻的特点，常做为鱼糜加工过程中的主要原料。然而，金线鱼下脚料如鱼头、鱼鳞、鱼皮和内脏等被认为是渔业工程的副产物，而被大量丢弃，不仅造成了极大的浪费，也对环境产生很大的负担。研究表明，渔副产物约占鱼干重的35％左右，且含有大量优质蛋白源，是制备生物活性肽的良好原料。通过外源性蛋白酶酶解金线鱼下脚料，释放出具有潜在生物活性的肽段，可为金线鱼相关产业的深加工提供一定的理论基础。

抗氧化肽通常是由2-20个氨基酸组成的寡肽，具有清除自由基、螯合活泼金属离子和以及修复体内受损大分子的功效，并且可作为一种食品添加剂应用在食品工业中，具有抑制贮藏过程中食品脂质劣变、蛋白质氧化以及非酶促褐变等不利化学反应，从而提高食品的货架期。与商业抗氧化剂，如BHA、BHT和没食子酸丙酯等相比，抗氧化肽不仅具有较高的清除自由基活性，并且无副作用，可防止由传统抗氧化剂引发的肝功能损伤。此外，抗氧化肽还具有和制备成本低等特点，有利于工业化生产。现已从大豆、鹰嘴豆、小麦、大黄鱼等动植物蛋白中制备出高活性的抗氧化肽。然而，通过酶解法制备生物活性肽存在着效率低、酶解产物不稳定等缺点，由于外源性蛋白酶活性位点主要位于蛋白质的疏水中心，因此，在天然状态下，酶不易与活性位点相互作用，尤其是动植物边脚料中大量杂蛋白通过疏水作用聚合形成多聚体，导致酶解效率低下。目前国内外普遍采用超声波、酸解等物理或化学方法对原蛋白进行预处理，促进蛋白有序结构的展开，使蛋白多聚体解离为离散状的蛋白单体，从而提高溶液中酶与活性位点的接触率。例如。专利201010188418.1公开了一种制备燕麦降血压肽的超声辅助酶解方法，通过250-1250W/100mL的超声场对燕麦蛋白预处理，5-10min后关闭超声并转入碱性蛋白酶酶解，以提高降血压肽的得率和活性。然而，超声过后蛋白易迅速复性，重新形成球状蛋白结构。另外，超声作用可一定程度上促进蛋白凝胶化，不利于后续酶解步骤。微波的离子化效应可诱导蛋白质迅速解折叠，使α-螺旋与β-折叠转变为β-转角与无规则结构，蛋白质三级结构充分展开，有利于蛋白酶的酶解，但是有关利用微波场预处理原蛋白制备抗氧化肽还未见相关报道。

酶解法是制备生物活性肽的常用技术。然而，在酶解过程中常常存在底物抑制现象，导致酶活性随着酶解过程的深入而迅速下降，从而影响活性肽段的进一步释放。并且由于酶-肽复合物的形成，酶三维结构发生改变，使催化特异性发生改变，令催化产物发生变化。因此，通过超声波技术使酶-肽复合物迅速解离，降低由底物引起的非限制性抑制作用，因此，蛋白酶再酶解过程中能保持相对较高的活性。例如。专利201710412246.3公开了一种竹节虾抗氧化肽及其制备方法，通过通过超声波辅助酶解可大幅提高抗氧化肽的得率和清除自由基活性。然而，碱性蛋白酶结构域敏感度较高，外加超声场容易诱导蛋白酶变性。因此需要对超声场的强度、作用时间等条件进行严格控制。

生物活性肽普遍存在着较强的构效关系，因此，食品加工过程中的热、酸和金属离子添加易引发生物活性肽天然构象的丧失，从而破坏其的生物功能性。通过引入Ca²⁺、Mg²⁺等金属离子可稳定寡肽的平面结构，二价金属离子通过静电作用力与生物活性肽形成复合物，增强分子内分子力的强度，赋予生物活性肽更稳定的构象抵御外界环境的影响。此外，金属离子螯合肽作为食品添加剂还可促进肠道对必需金属离子的吸收。金属离子螯合肽作为一种新型的生物活性肽具有制备工艺简单，功能稳定性好，营养价值高等特点，可很好保留原有的物化和功能特性。但是相关的文献还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种低值鱼内脏蛋白源抗氧化钙离子螯合肽的高效制备工艺的方法和工艺。本发明的工艺提供了一种简便快捷、得率高、活性保留完整的金线鱼内脏抗氧化钙离子螯合肽的制备方法。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种低值鱼内脏蛋白源抗氧化钙离子螯合肽的高效制备工艺，包括选料、匀浆、微波预处理、超声波辅助酶解、膜分离、CaCl₂螯合和HPLC分离。

一种低值鱼内脏蛋白源抗氧化钙离子螯合肽的高效制备工艺，具体步骤如下：

(1)选料：选择金线鱼内脏作为抗氧化钙离子螯合肽的制备原料；

(2)匀浆：将金线鱼内脏与蒸馏水按W/V为1:10混合，置入打浆机匀浆；

(3)微波预处理：将匀浆液置于微波场中，调节微波频率为2450MHz；

(4)超声波辅助酶解：通过碱性蛋白酶酶解微波处理后蛋白匀浆液，控制酶解pH＝9，酶解温度50℃，并设置外加超声波场频率为28kHz，酶解后将酶解液90℃水浴15min灭酶处理；

(5)膜分离：将酶解后得到的抗氧化肽粗溶液离心后除去沉淀，依次采用截留分子量分别为10kDa、5kDa和3kDa的超滤膜对抗氧化肽进行超滤，设置操作压力1MPa、错流流速3m/s，得到分子量为500-3000Da的抗氧化肽溶液；

(6)CaCl₂螯合：将上述得到的肽段冻干后，采用0.06mol/L CaCl₂复溶，漩涡震荡10min后静置反应3h；

(7)HPLC分离：利用HPLC将步骤(6)抗氧化钙离子螯合肽分离，采用水：乙腈体积1：3等浓度洗脱法分离复合肽，收集功能性最强的抗氧化钙离子螯合肽组分。

进一步的，步骤(3)中所述微波场预处理金线鱼内脏蛋白的条件参数为：控制微波功率为40-600W、处理时间为80-120s、真空度0.2-0.4MPa。

进一步的，步骤(4)中酶解的条件为：超声功率为100-200W、碱性蛋白酶与蛋白匀浆液的质量比为1:25-100、酶解时间120-240min。

进一步的，步骤(6)中CaCl₂的复溶条件为：pH＝7.5-8.5、温度30-40℃。

有益效果：

本发明采用微波场处理金线鱼内脏蛋白，通过超声波辅助碱性蛋白酶酶解制备抗氧化肽，并采用超滤膜对抗氧化肽进行初步分级，将分级后的抗氧化肽通过CaCl₂复合形成抗氧化钙离子螯合肽，并通过HPLC分离得到活性较强的组分，大大提高了制备高活性抗氧化肽的得率和活性，可为抗氧化肽的制备提供一种新的途径。

附图说明

图1为金线鱼内脏抗氧化钙离子螯合肽清除自由基的活性；

图2为金线鱼内脏抗氧化钙离子螯合肽在不同温度下抗氧化稳定性。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

将金线鱼内脏以与蒸馏水按W/V为1:10混合、匀浆，将匀浆后的肌球蛋白溶液放入微波场处理室内，调节微波频率为2450MHz，设置室内真空度为0.2MPa、微波功率为400W、处理时间为80s的条件对金线鱼内脏蛋白水溶液进行微波预处理；将处理后的蛋白溶液放于超声波处理器内，控制超声频率为28kHz，超声功率为100W，并按碱性蛋白酶与蛋白匀浆液质量比1:25加入碱性蛋白酶(无锡杰能科生物工程有限公司，100000u/g)，酶解pH＝9，酶解温度50℃，120min后停止酶解，酶解液90℃水浴15min灭酶；酶解液通过离心除去沉淀后放于干净水槽内，连接超滤膜，设置流动场操作压力1MPa、错流流速3m/s，采用截留分子量分别为10kDa、5kDa和3kDa的超滤膜对抗氧化肽在外加超声波场条件下进行超滤，得到分子量为500-3000的抗氧化肽溶液，冻干后，采用0.06mol/L CaCl₂复溶，漩涡震荡10min后，在pH＝7.5、温度30℃条件下静置反应3h；利用HPLC将上述得到的抗氧化钙离子螯合肽进行分离，采用水：乙腈体积1：3等浓度洗脱法分离复合肽，收集抗氧化活性最强的组分。

实施例2：

将金线鱼内脏以与蒸馏水W/V为1:10混合、匀浆，将匀浆后的肌球蛋白溶液放入微波场处理室内，调节微波频率为2450MHz，设置室内真空度为0.3MPa、微波功率为500W、处理时间为95s的条件对金线鱼内脏蛋白水溶液进行微波预处理；将处理后的蛋白溶液放于超声波处理器内，控制超声频率为28kHz，超声功率为150W，并并按碱性蛋白酶与蛋白匀浆液质量比1:50加入碱性蛋白酶(无锡杰能科生物工程有限公司，100000u/g)，酶解pH＝9，酶解温度50℃，180min后停止酶解，酶解液90℃水浴15min灭酶；酶解液通过离心除去沉淀后放于干净水槽内，连接超滤膜，设置流动场操作压力1MPa、错流流速3m/s，采用截留分子量分别为10kDa、5kDa和3kDa的超滤膜对抗氧化肽在外加超声波场条件下进行超滤，得到分子量为500-3000的抗氧化肽溶液，冻干后，采用0.06mol/L CaCl₂复溶，漩涡震荡10min后，在pH＝8、温度35℃条件下静置反应3h；利用HPLC将上述得到的抗氧化钙离子螯合肽进行分离，采用水：乙腈体积1：3等浓度洗脱法分离复合肽，收集抗氧化活性最强的组分。

实施例3：

将金线鱼内脏以与蒸馏水W/V为1:10混合、匀浆，将匀浆后的肌球蛋白溶液放入微波场处理室内，调节微波频率为2450MHz，设置室内真空度为0.4MPa、微波功率为600W、处理时间为120s的条件对金线鱼内脏蛋白水溶液进行微波预处理。将处理后的蛋白溶液放于超声波处理器内，控制超声频率为28kHz，超声功率为200W，并按碱性蛋白酶与蛋白匀浆液质量比1:100加入碱性蛋白酶(无锡杰能科生物工程有限公司，100000u/g)，酶解pH＝9，酶解温度50℃，120min后停止酶解，酶解液90℃水浴15min灭酶。酶解液通过离心除去沉淀后放于干净水槽内，连接超滤膜，设置流动场操作压力1MPa、错流流速3m/s，采用截留分子量分别为10kDa、5kDa和3kDa的超滤膜对抗氧化肽在外加超声波场条件下进行超滤，得到分子量为500-3000的抗氧化肽溶液，冻干后，采用0.06mol/L CaCl2复溶，漩涡震荡10min后，在pH＝8.5、温度40℃条件下静置反应3h；利用HPLC将上述得到的抗氧化钙离子螯合肽进行分离，采用水：乙腈体积1：3等浓度洗脱法分离复合肽，收集抗氧化活性最强的组分。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种低值鱼内脏蛋白源抗氧化钙离子螯合肽的高效制备工艺，其特征在于：包括选料、匀浆、微波预处理、超声波辅助酶解、膜分离、CaCl₂螯合和HPLC分离。

2.根据权利要求1所述的低值鱼内脏蛋白源抗氧化肽高效制备的方法，其特征在于：具体步骤如下：

3.根据权利要求2所述的一种低值鱼内脏蛋白源抗氧化钙离子螯合肽的高效制备工艺，其特征在于：步骤(3)中所述微波场预处理金线鱼内脏蛋白的条件参数为：控制微波功率为400-600W、处理时间为80-120s、真空度0.2-0.4MPa。

4.根据权利要求2所述的一种低值鱼内脏蛋白源抗氧化钙离子螯合肽的高效制备工艺，其特征在于：步骤(4)中酶解的条件为：超声功率为100-200W、碱性蛋白酶与蛋白匀浆液的质量比为1:25-100、酶解时间120-240min。

5.根据权利要求2所述的一种低值鱼内脏蛋白源抗氧化钙离子螯合肽的高效制备工艺，其特征在于：步骤(6)中CaCl₂的复溶条件为：pH＝7.5-8.5、温度30-40℃。