CN104497164A - 高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌多糖工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供了高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌多糖工艺，该工艺设置以下3个变量：电场强度、脉冲数和酶解时间；利用design expert软件根据Box-Behnken设计方法对提取工艺优化，得到最佳优化提取工艺条件为电场强度30.96kv/cm，脉冲数9.22个，酶解时间1.67h，在此条件下河蚌多糖得率的预测值为6.08％。本发明的目的旨在提供一种以河蚌内脏组织为原料，利用高压脉冲电场新技术与木瓜蛋白酶解结合高效提取河蚌多糖的方法。该提取方法工艺简单、提取率高、条件温和、杂质少、成本低，且野生河蚌资源丰富，价格仅为打捞成本0.5元/斤，以废弃物扔掉的内脏组织为原料制取的河蚌多糖附加值高，可应用于食品、保健品、美容、医药和临床治疗等领域，具有广阔的应用前景。

Description

高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌多糖工艺

技术领域：本发明涉及河蚌多糖的高压脉冲电场(PEF)辅助酶解提取技术，特别是涉及利用响应曲面优化河蚌多糖提取条件的方法。

背景技术：自二十世纪六十年代以来，人们对多糖物质所具有的抗肿瘤、抗辐射损伤、提高人体免疫等功能给予了高度重视，我国在这方面也做了许多研究工作，特别是从中药中提取多糖，并对这些多糖在抑制肿瘤及其它一些生理活性等方面进行了大量研究。实验证明，生物多糖除具有抗肿瘤、抗辐射、增加免疫功能外，还具有抗病毒、抗感染、抗衰老、降血脂、降血压、降血糖等多种生理、药理活性，并且无副作用。粘多糖是一种重要的生物多糖，由于含有糖醛酸和硫酸基，所以又称酸性粘多糖。由于它具有一些特殊功效，近二十多年来倍受人们关注，相继从多种动物组织中提取并获得应用。进入21世纪，人们又热衷于从贝类，如牡蛎、扇贝等软体组织提取粘多糖。自上世纪九十年代，我国、日本等国家开展了从河蚌、田螺等淡水贝类中提取粘多糖的研究。研究表明，河蚌多糖与其它动物粘多糖一样属于酸性粘多糖，河蚌多糖不仅有植物多糖的临床治疗效果，还有动物粘多糖在抗肿瘤、抗辐射、抗凝血、增强免疫功能等功效。此外，河蚌多糖在治疗晕眩、盗汗、慢性肝炎、烧烫伤以及降血脂等心脑血管疾病方面有其特殊的功效。目前关于贝类养殖技术方面的研究及报道很多，但有关贝类多糖的提取方法和工艺方面的研究及报道甚少。贝类多糖的提取可采用水提法、碱提法、超临界流体萃取法、酶提法等。传统水提法产率较低，提取时间长，耗能大，提取成本高；碱提法有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，缩短提取时间，但提取液中含有其它杂质，使粘度过大，过滤困难，且浸提液有较浓的碱味，溶液颜色呈黄色；超临界流体萃取法提取多糖原料利用率高，产品得率高等优点，但设备复杂，运行成本高。

发明内容：基于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的旨在提供一种以河蚌内脏为原料，利用高压脉冲电场新技术与酶相结合提取河蚌多糖的方法。该方法工艺简单，可提高河蚌多糖的得率，具有提取条件温和、杂质易于去除等优点，可实现河蚌多糖的低成本高效提取。

其工艺流程及其控制条件如下：

A.原料及处理：将鲜活河蚌用水清洗干净，沥干后用刀将其剖开，取其全部内脏组织冷冻备用。

B.打浆：将河蚌内脏组织从冰柜中取出，在室温下自然解冻，用打浆机打浆。

C.匀浆：将打浆后的浆液用胶体磨匀浆，得到均匀的浆液。

D.高压脉冲电场处理：按料液比6g/mL将河蚌匀浆液与水混合均匀，经高压脉冲电场处理，电场强度25～35kv/cm，脉冲数6～10个。

E.酶解提取：将经高压脉冲电场处理后的浆液调pH为7.5，加入质量分数为0.4％、比活力为8×10⁵U/g的木瓜蛋白酶，搅拌后置于恒温水浴振荡器中，作用温度55℃、酶解时间1～2h，然后置于90℃水浴中灭酶10min。

F.分离：将灭酶后的河蚌酶解液冷却后离心(4000r/min、10min)取上清液，即为河蚌多糖母液。

G.浓缩：将得到的河蚌多糖母液置于旋转蒸发器中，在50℃条件下减压浓缩至原体积的1/10左右。

H.醇沉：向浓缩液中边搅拌边加入3倍体积无水乙醇沉淀约12h，离心(4000r/min、15min)取沉淀物，得到河蚌多糖水溶性粗提物。

I.Sevag法脱蛋白：将粗提物加适量水溶解，再加入1/5溶液体积的三氯甲烷-正丁醇(V:V＝5:1)混合液，摇床剧烈振荡(约25min)，分液漏斗静止(约25min)使其分层，去除下层乳白色有机溶剂-蛋白相。将上层液用相同方法反复脱蛋白若干次(约需5次以上)，直至分液漏斗内两液面间无蛋白层为止。

J.二次浓缩：将上层液置旋转蒸发器中50℃减压浓缩至原体积的1/3～1/2。

K.二次醇沉：向浓缩液中加9倍体积无水乙醇沉淀12h，离心(4000r/min、15min)取沉淀物。

L.干燥：将沉淀物置于50℃干燥箱中干燥，得河蚌多糖。

本发明具有以下优点和效果：

1.本发明可用采珠后的河蚌内脏，甚至于用剔除蚌肉后的下脚料为原料提取多糖，对综合利用河蚌资源、提高产品附加值和养蚌的经济效益并扩大淡水养殖资源的开发具有重要意义；

2.本发明确立了高压脉冲电场与酶解相结合的方法使河蚌内脏组织能更多地分解出多糖，提高多糖得率；

3.本发明提取到的河蚌多糖，作为新食品资源应用于食品、饮料中，制成的多糖溶液可用于美容及外用保健，纯化精制制成药品用于临床治疗及医疗保健。

附图说明：

图1是电场强度对多糖得率的影响规律图。

图2是脉冲数对多糖得率的影响规律图。

图3是酶解时间对多糖得率的影响规律图。

具体实施方式

实施例1、高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌多糖工艺响应面优化试验

1、试样制备与试验过程

(1)将鲜活河蚌用水清洗干净，沥干后用刀将其剖开，去除外壳，取其内脏组织，用打浆机打浆，然后用胶体磨研磨，得到河蚌内脏组织试样。

(2)称取5g河蚌试样，按料液比6g/mL将河蚌试样与水混合均匀，用泵将样液打入高压脉冲电场提取装置中，在一定的电场强度和脉冲数下进行高压脉冲电场提取处理。

(3)调pH为7.5，加入质量分数为0.4％、比活力为8×10⁵U/g的木瓜蛋白酶，搅拌均匀后置于恒温水浴振荡器中酶解，作用温度55℃，酶解时间1.0～2.0h，然后迅速于90℃水浴中灭酶10min。

(4)离心(4000r/min、10min)取上清液，用去离子水将上清液定容到一定刻度，用蒽酮-硫酸比色法测定多糖得率。

(5)多糖得率计算：多糖得率(％)＝[测多糖质量/样品质量]×100％

2、试验设计与统计分析

(1)单因素实验

以电场强度、脉冲数和酶解时间为主要影响因素，多糖得率为指标进行单因素实验，每个指标值测三次，取其平均值。

(2)响应面法优化试验设计

根据单因素试验结果，选取对多糖提取效果影响较显著的电场强度、脉冲数、酶解时间这三个因素，利用design expert软件根据Box-Behnken设计原则进行试验设计，选电场强度、脉冲数和酶解时间进行试验因素与水平设计，试验设计方案见表1。

表1 Box-Behnken设计响应面分析因素及水平表

以电场强度(X₁)、脉冲数(X₂)和酶解时间(X₃)为自变量，以多糖得率为响应值(Y)，试验方案及结果见表2。其中，试验点1-12为析因点，13-17是零点。

表2 响应面优化试验设计方案及结果

(3)模型的建立和统计分析

对试验数据进行多元回归分析，得到响应变量(电场强度、脉冲数和酶解时间)与响应值(多糖得率)之间的多元二次回归方程：

Y＝-30.2578+1.67015X₁+1.062125X₂+6.667X₃-0.00775X₁X₂-0.038X₁X₃-0.12X₂X₃-0.02479X₁ ²-0.03369X₂ ²-1.309X₃ ²

各因子与响应值之间线性关系显著性，由F值检验来判定，P值越小，则说明变量的显著性越高。由表3方差分析结果可知，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著(R²＝0.9822)，模型的显著水平小于0.01，所以该回归方差模型是极显著的。

表3 响应面二次回归模型方差回归分析

注：＊＊表示极显著，＊表示显著；R²＝0.9822，Adjusted R²＝0.9594

(4)试验结果分析与优化

根据模型分析得知，河蚌多糖提取优化工艺参数：电场强度30.96kv/cm，脉冲数9.22个，酶解时间1.67h，在此条件下，河蚌多糖得率预测值为6.08％。实验1、高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌多糖过程试验

(1)鲜活河蚌用水清洗干净，沥干后用刀将其剖开，去除外壳取其内脏组织，用打浆机打浆，然后用胶体磨研磨，得质地均匀的河蚌内脏组织样品。

(2)称取5g河蚌内脏处理样品，按料液比6g/mL将河蚌样品与水混合均匀，用泵将样液打入高压脉冲电场提取装置中，在电场强度30kv/cm、脉冲数10个条件下通过脉冲电场处理。

(3)将脉冲电场处理的试样调pH至7.5，加入质量分数为0.4％、比活力为8×10⁵U/g的木瓜蛋白酶，搅拌均匀后置于恒温水浴振荡器中酶解，作用温度55℃，酶解时间100min(1.67h)，然后迅速移至90℃水浴中灭酶10min。

(4)离心(4000r/min、10min)取上清液，用去离子水将上清液定容到一定刻度，蒽酮-硫酸比色法测多糖含量，测得河蚌多糖得率为6.01％。

实验2、电场强度对河蚌多糖得率的影响

在脉冲数10个、酶解时间2.0h的条件下，将电场强度设定为5-35kv/cm共7个变化值；其余同实验1，结果如图1所示。

电场强度小于30kv/cm，河蚌多糖得率随电场强度的增大而逐渐增加，河蚌多糖得率的最大值为5.94％。这是由于随着电场强度增加，极性溶剂在电场中运动速度加快，使更多的溶剂进入到细胞内，细胞内的物质能够更容易地渗透出来；另一方面，细胞内、外的电场强度差异使细胞电极化而破坏了细胞膜，使细胞内的物质更容易地被提取。电场强度大于30kv/cm，河蚌多糖得率呈下降趋势，因为电场强度过大，破坏了多糖的稳定性，多糖开始分解，使河蚌多糖得率降低。因此，选择30kv/cm为适宜的电场强度。

实验3、脉冲数对河蚌多糖得率的影响

在电场强度30kv/cm、酶解时间2.0h的条件下，将脉冲数设定为2-14个共7个变化值；其余同实验1，结果如图2所示。

当脉冲数小于8个时，河蚌多糖得率随着脉冲数的增加而逐渐增大，河蚌多糖得率的最大值为5.86％。这是由于随着脉冲数的增加，脉冲电场对料液的作用时间和作用频率都增加，电场对细胞破坏的程度和数量都会相应增加。但当脉冲数大于8个时，多糖得率呈下降趋势，是因为电场作用时间过长，电场频率过大，电场有较强的电解作用，造成多糖糖苷键断裂，多糖降解，降低多糖提取率。因此，河蚌多糖提取的最适脉冲数为8个。

实验4、酶解时间对河蚌多糖得率的影响

在电场强度30kv/cm、脉冲数8个的条件下，将酶解时间设定为0.5-2.5h,共5个变化值；其余同实验1，结果如图3所示。

酶解时间从0.5h增加到1.0h，河蚌多糖得率略有增加，但增加不明显。这因为作用时间较短，木瓜蛋白酶与料液接触不充分，木瓜蛋白酶还未完全发挥作用；酶解时间从1.0h增加到1.5h，多糖得率显著增加，于1.5h时达到最大；再延长反应时间，多糖得率反而降低，原因是由于反应到1.5h时，木瓜蛋白酶作用已较充分，使多糖最大限度地溶出，随着时间的延长，某些多糖又附着在大分子蛋白上，沉降到底部，导致多糖含量降低；另外，酶解时间过长也会使酶液腐败，当反应一段时间后，随底物减少，酶活力下降，水解程度也趋于平缓。因此，选1.5h为最佳酶解时间。

Claims (4)

1.一种高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌多糖工艺，其特征在于：以河蚌内脏组织为原料，利用高压脉冲电场新技术辅助酶解提取河蚌多糖并借助响应面优化提取工艺的新方法，其工艺流程和操作步骤如下：

高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌多糖工艺流程：原料及处理→打浆→匀浆→高压脉冲电场处理→酶解提取→分离→浓缩→醇沉→Sevag法脱蛋白→二次浓缩→二次醇沉→干燥→河蚌多糖；

高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌多糖操作步骤与要点如下：

(1)原料及处理：将鲜活河蚌用水清洗干净，沥干后用刀将其剖开，取其全部内脏组织冷冻备用；

(2)打浆：将冷冻河蚌内脏组织从冰柜中取出，室温下自然解冻，用打浆机打浆备用；

(3)匀浆：将打浆后的浆液用胶体磨匀浆，得到均匀的浆液；

(4)高压脉冲电场处理：按料液比6g/mL将河蚌匀浆液与水混合均匀，经高压脉冲电场处理，电场强度25～35kv/cm，脉冲数6～10个；

(5)酶解提取：将经高压脉冲电场处理后的浆液调pH为7.5，加入质量分数为0.4％、比活力为8×10⁵U/g的木瓜蛋白酶，搅拌后置于恒温水浴振荡器中，恒温水解作用温度55℃、酶解时间1～2h，然后于90℃水浴中灭酶10min；

(6)分离：将灭酶后的河蚌酶解液冷却后离心(4000r/min、10min)取上清液，得到河蚌多糖母液；

(7)浓缩：将得到的河蚌多糖母液置于旋转蒸发器中，在50℃条件下减压浓缩至原体积的1/10左右；

(8)醇沉：向浓缩液中边搅拌边加入3倍体积无水乙醇沉淀约12h，离心(4000r/min、15min)取沉淀物，得到河蚌多糖水溶性粗提物；

(9)Sevag法脱蛋白：将粗提物加适量水溶解，再加入1/5溶液体积的三氯甲烷-正丁醇(V:V＝5:1)混合液，摇床剧烈振荡(约25min)，分液漏斗静止(约25min)使其分层，去除下层乳白色有机溶剂-蛋白相，将上层液用相同方法反复脱蛋白若干次(约需5次以上)，直至分液漏斗内两液面间无蛋白层为止；

(10)二次浓缩：将上层液置于旋转蒸发器中50℃减压浓缩至原体积的1/3～1/2；

(11)二次醇沉：向浓缩液中加9倍体积无水乙醇沉淀静置12h，离心(4000r/min、15min)取沉淀物；

(12)干燥：将沉淀物置于50℃烘箱中烘干，得河蚌多糖。

2.如权利要求1所述的高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌多糖工艺，其特征在于，所述河蚌多糖提取中酶解工艺涉及的料液比为6g/mL的河蚌匀浆液与水的混合液，于温度55℃、pH7.5条件下提取1～2h。

3.如权利要求1所述的高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌多糖工艺，其特征在于，所述的酶制剂选为木瓜蛋白酶，酶比活力为8×10⁵U/g，酶用量为河蚌匀浆液质量的0.4％；蛋白酶可使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，降低它们对原料的结合力，有利于多糖的浸出。

4.如权利要求1所述的高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌多糖工艺，其特征在于，所述的河蚌匀浆液经高压脉冲电场辅助酶解设置3个变量：电场强度、脉冲数和酶解时间，利用design expert软件根据Box-Behnken设计方法对其提取工艺优化。