CN110256588A

CN110256588A - 河蚌抗氧化活性多糖及其制备方法

Info

Publication number: CN110256588A
Application number: CN201910451443.5A
Authority: CN
Inventors: 谢雨欣
Original assignee: Pujiang County Meize Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Pujiang County Meize Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2019-05-28
Publication date: 2019-09-20

Abstract

本发明提供一种河蚌抗氧化活性多糖及其制备方法，属于天然物质的提取技术领域，其分子量范围为23‑62kDa，单糖残基中含有葡萄糖、半乳糖和鼠李糖。其制备方法包括如下步骤：将河蚌下脚料加水后超高压处理，打浆，均质，得到匀浆液；将上述匀浆液中加入酶，酶解，离心，得到酶解液；利用Sevage法脱除上述酶解液中的游离蛋白，上清液浓缩，醇沉，得到河蚌粗多糖；将上述河蚌粗多糖用离子水溶解后，分离，干燥，得到河蚌多糖。本发明河蚌抗氧化活性多糖具有较强的抗氧化效果和抗骨质疏松症的作用，有望成为预防、治疗骨质疏松症的新选择；本发明制备方法能提高河蚌抗氧化活性多糖的得率，酶解效果佳，所制多糖的生物活性高。

Description

河蚌抗氧化活性多糖及其制备方法

技术领域

本发明属于天然物质的提取技术领域，具体涉及一种河蚌抗氧化活性多糖及其制备方法。

背景技术

河蚌，是一种普通的贝壳类水生动物，分布十分广泛，在我国的绝大多数河流湖泊中都有分布，可产珍珠，是高品质珍珠的来源。河蚌浑身是宝，有着食用、饲用、药用、护肤、工艺、生态修复等价值。我国是淡水珍珠养殖大国，淡水珍珠的产量占世界总产量的85％以上。蚌肉和蚌壳是育珠产业的副产品，资源十分可观。蚌壳可作为添加剂添加到饲料中，也可作为人们主食的添加料。蚌肉营养价值很高，除可食用外，多糖及多肽还具有一定的药用价值。然而河蚌的下脚料很少被食用或药用，多用作饲料、肥料或被废弃掉。为充分利用河蚌资源，提高整个珍珠产业的经济效益，解决河蚌副产物对环境的污染问题，亟需对蚌肉深入研究和开发利用。其中贝类多糖是存在于贝类体内的一种生物活性物质，它的主要成分是酸性粘多糖，其结构是由氨基己糖与己糖醛酸两种己糖衍生物所组成的二糖单元聚合而成的直链高分子化合物，由葡萄糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸这4种基本单元组成。多糖具有抗癌、抗病毒、调节细胞的生长与衰老和增强机体免疫功能等生理调节功能。另外，多糖可以改善食品的食用品质、加工特性和外观特性，可用于抑制脂质氧化，稳定酸性饮料，也可作为乳化剂等。国内外众多学者对其展开了研究和探索。

中国授权公告号CN 101503721 B的发明专利提供了一种蚌肉多糖的提取方法，所述方法是以蚌肉斧足部分为原料，经碱提-离心-酶解-离心-超滤-活性炭去色素-醇沉-干燥，得到较高纯度的蚌肉多糖。其有益效果主要体现在：利用本发明方法，加工而成的蚌肉多糖不仅外观漂亮而且纯度高，具有较好的保健功能和一定的药用功能，无毒性，安全性高，而且制备工艺成熟，设备投资少，利于工业化生产，在食品、药品和保健品领域具有广阔前景。中国授权公告号CN 101250570 B的发明专利提供了一种三角帆蚌多糖的制备方法。将三角帆蚌肉搅碎，热水抽提；60～100目过滤，浓缩滤液后加入乙醇沉淀，将沉淀用热水复溶，调节pH至7～10，按复溶物料中的蛋白重量计加入0.3～0.6％的复配蛋白酶，30～60℃酶解4～8h；复配蛋白酶的组成为：碱性蛋白酶(Alcalase)和复合蛋白酶(Protamex)等量混合；酶解后的物料在80～90℃下灭酶，用乙醇二次沉淀，沉淀物真空干燥，粉碎过60目，即得三角帆蚌多糖制品。实验证明：上述方法制备的三角帆蚌精制多糖具有诱导小鼠脾淋巴细胞增殖的能力，可以提高小鼠血清溶血素抗体积数值，能提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数，有多种生物活性，具有作为药用资源及保健食品的应用前景。中国授权公告号CN 101985480 B的发明专利提供了一种河蚌多糖，经紫外分光光度计检测多糖含量，以葡萄糖(C₆H₁₂O₆)计算其多糖含量为55％-90％。经高效液相色谱检测其中的单糖组分有葡萄糖、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖等。上述河蚌多糖通过醇处理，水提取、压滤和干燥等工艺制得。临床验证结果认为本发明河蚌多糖治疗阴虚内热症及阴虚内热症伴癌痛者疗效确切，且服用方便、安全、无毒副作用，可用于制备滋阴清热、消肿止痛和癌症止痛药物。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种具有较强的抗氧化效果，可抑制破骨细胞前体细胞分化成熟为破骨细胞和抑制破骨细胞骨吸收以及破骨细胞的肌动蛋白环的形成，也对破骨细胞成活具有重要作用，具有抗骨质疏松症的作用，有望成为预防、治疗骨质疏松症的新选择的河蚌抗氧化活性多糖。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

河蚌抗氧化活性多糖，其分子量范围为23-62kDa，其单糖残基中含有葡萄糖、半乳糖和鼠李糖。抗氧化活性多糖中葡萄糖的连接方式都是以1→4糖苷键为主，存在1→4、1→6和1→3、1→4分支以及一些末端糖基(1→)，半乳糖和鼠李糖绝大部分或全部都是以1→3糖苷键为主，穿插在葡萄糖主链和支链中，抗氧化活性多糖不具有三股螺旋结构，能够清除H₂O₂、清除O₂·和DPPH·自由基、鳌合Fe²⁺、还原Fe³⁺，具有抗氧化作用；更优选地，河蚌抗氧化活性多糖的浓度为1.8-2.3mg/mL时，抗氧化效果最佳。

优选地，抗氧化活性多糖的分子量范围为30-56kDa。该分子量范围内的多糖的抗氧化效果更佳。

优选地，抗氧化活性多糖的单糖残基中，葡萄糖、半乳糖和鼠李糖的摩尔比为1:(0.15-0.20):(0.22-0.33)。上述河蚌抗氧化活性多糖不仅具有较强的抗氧化效果，而且可抑制破骨细胞前体细胞分化成熟为破骨细胞和抑制破骨细胞骨吸收，还抑制破骨细胞的肌动蛋白环的形成，而肌动蛋白环是成熟破骨细胞具有骨吸收作用的重要标志，也对破骨细胞成活具有重要作用，所以上述河蚌抗氧化活性多糖具有抗骨质疏松症的作用，有望成为预防、治疗骨质疏松症的新选择。

本发明的第二个目的在于提供一种提高河蚌抗氧化活性多糖的得率，酶解效果佳，所制多糖的生物活性高的河蚌抗氧化活性多糖的制备方法。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

河蚌抗氧化活性多糖的制备方法，包括以下步骤：

S1步骤：将河蚌下脚料加水后超高压处理，打浆，均质，得到匀浆液；

S2步骤：将上述匀浆液中加入酶，酶解，离心，得到酶解液；

S3步骤：利用Sevage法脱除上述酶解液中的游离蛋白，上清液浓缩，醇沉，得到河蚌粗多糖；

S4步骤：将上述河蚌粗多糖用离子水溶解后，分离得到分子量为20-65kDa部分，干燥，得到河蚌多糖。

超高压处理一方面能够改变细胞膜通透性，导致细胞内容物流出，不仅抑制河蚌下脚料中微生物的生长，避免微生物的存在对后续多糖的提取造成影响，同时提高匀浆液的保存时长，而且提高河蚌抗氧化活性多糖的得率；另一方面能够使得蛋白质的高级结构受到了破坏而发生变性，进而导致与这些蛋白质相关的生物功能受到破坏，提高小分子蛋白质的溶解性，不仅导致河蚌下脚料中微生物的失活，避免微生物的代谢产物对多糖的提取及活性影响，而且使得河蚌粗多糖中的蛋白质更易于被脱除，同时在酶解过程中能够增加蛋白酶和蛋白质的接触机会，提高酶解效果。酶解法是指采用蛋白酶水解肽键，将生物活性多糖释放出来的一种多糖提取方法，具有作用条件温和、得率高、多糖的生物活性保留性完好等优点，而且还可使后续的浓缩和除蛋白工艺更简易、省时，更适合于王业化生产。

优选地，S1步骤中河蚌下脚料和水的料液比为1:3-5(g/mL)。

优选地，S1步骤中超高压处理压力为220-280MPa，处理时间为18-25min。

优选地，S2步骤中酶选自木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶或它们的混合物。

优选地，S2步骤中酶的添加量为0.25-0.34％，酶解温度为50-60℃、时间为1-2h。

本发明还公开了上述河蚌抗氧化活性多糖的用途，在制备抗氧化药物、食品或化妆品中的用途。

本发明还公开了上述河蚌抗氧化活性多糖的用途，在制备治疗和/或预防骨质疏松症制剂中的用途。骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种老年退化性全身骨科疾病，主要特点为骨密度降低及骨微结构破坏,易导致发生骨折，常见脊柱、髋和桡骨三个部位。新骨形成主要由成骨细胞介导，而骨量减少主要取决于破骨细胞的功能，破骨功能强于成骨功能导致骨质疏松症。因此，正常骨重建过程中，能抑制破骨细胞前体细胞分化、成熟为破骨细胞，必能抑制骨质疏松症的发生。河蚌抗氧化活性多糖可抑制破骨细胞前体细胞分化成熟为破骨细胞，抑制破骨细胞的肌动蛋白环的形成，而肌动蛋白环是成熟破骨细胞具有骨吸收作用的重要标志，进而能抑制破骨细胞骨吸收，同时也对破骨细胞成活具有重要作用，所以上述河蚌抗氧化活性多糖具有抗骨质疏松的生物活性，能够有效地治疗和/或预防骨质疏松症。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明河蚌抗氧化活性多糖不具有较强的抗氧化效果，可抑制破骨细胞前体细胞分化成熟为破骨细胞和抑制破骨细胞骨吸收以及破骨细胞的肌动蛋白环的形成，也对破骨细胞成活具有重要作用，具有抗骨质疏松症的作用，有望成为预防、治疗骨质疏松症的新选择；本发明制备方法能提高河蚌抗氧化活性多糖的得率，酶解效果佳，所制多糖的生物活性高。

本发明采用了上述技术方案提供河蚌抗氧化活性多糖及其制备方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。

附图说明

图1为本发明实施例2中河蚌抗氧化活性多糖分子量结果；

图2为本发明实施例2中河蚌抗氧化活性多糖单糖组成分析结果；

图3为本发明试验例1中450nm处细胞的OD值；

图4为本发明试验例1中各组TRAP染色后破骨细胞数量、相对面积比的比较；

图5为本发明试验例1中各组破骨细胞骨吸收面积比的比较。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施方式或实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明的一个实施例是，河蚌抗氧化活性多糖，其分子量范围为23-62kDa，其单糖残基中含有葡萄糖、半乳糖和鼠李糖。抗氧化活性多糖中葡萄糖的连接方式都是以1→4糖苷键为主，存在1→4、1→6和1→3、1→4分支以及一些末端糖基(1→)，半乳糖和鼠李糖绝大部分或全部都是以1→3糖苷键为主，穿插在葡萄糖主链和支链中，抗氧化活性多糖不具有三股螺旋结构，能够清除H₂O₂、清除O₂·和DPPH·自由基、鳌合Fe²⁺、还原Fe³⁺，具有抗氧化作用；更优选地，河蚌抗氧化活性多糖的浓度为1.8-2.3mg/mL时，抗氧化效果最佳。

其中，抗氧化活性多糖的分子量范围为30-56kDa，例如35-50kDa、50-56kDa、40-45kDa、45-50kDa或48-52kDa。该分子量范围内的多糖的抗氧化效果更佳。

抗氧化活性多糖的单糖残基中，葡萄糖、半乳糖和鼠李糖的摩尔比为1:(0.15-0.20):(0.22-0.33)，例如1:(0.17-0.19):(0.25-0.30)、1:0.16:0.25、1:0.17:0.28、1:0.16:0.28或1:0.18:0.30。上述河蚌抗氧化活性多糖不仅具有较强的抗氧化效果，而且可抑制破骨细胞前体细胞分化成熟为破骨细胞和抑制破骨细胞骨吸收，还抑制破骨细胞的肌动蛋白环的形成，而肌动蛋白环是成熟破骨细胞具有骨吸收作用的重要标志，也对破骨细胞成活具有重要作用，所以上述河蚌抗氧化活性多糖具有抗骨质疏松症的作用，有望成为预防、治疗骨质疏松症的新选择。

本发明的一个实施例是，河蚌抗氧化活性多糖的制备方法，包括以下步骤：

其中，S1步骤中河蚌下脚料和水的料液比为1:3-5(g/mL)，例如1:3.2(g/mL)、1:4(g/mL)、1:4.5(g/mL)或1:4.8(g/mL)。

S1步骤中超高压处理压力为220-280MPa(例如230MPa、245MPa、250MPa、260MPa或270MPa)，处理时间为18-25min(例如20min、22min或24min)。

S2步骤中酶选自木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶或它们的混合物。

S2步骤中酶的添加量为0.25-0.34％(例如0.28％、0.30％、0.31％、0.32％或0.33％)，酶解温度为50-60℃(例如52℃、53.5℃、54℃、55℃、56℃或58℃)、时间为1-2h(例如1.3h、1.5h或1.7h)。

本发明的一个实施例是，河蚌抗氧化活性多糖的用途，在制备抗氧化药物、食品或化妆品中的用途。

本发明的一个实施例是，河蚌抗氧化活性多糖的用途，在制备治疗和/或预防骨质疏松症制剂中的用途。骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种老年退化性全身骨科疾病，主要特点为骨密度降低及骨微结构破坏,易导致发生骨折，常见脊柱、髋和桡骨三个部位。新骨形成主要由成骨细胞介导，而骨量减少主要取决于破骨细胞的功能，破骨功能强于成骨功能导致骨质疏松症。因此，正常骨重建过程中，能抑制破骨细胞前体细胞分化、成熟为破骨细胞，必能抑制骨质疏松症的发生。河蚌抗氧化活性多糖可抑制破骨细胞前体细胞分化成熟为破骨细胞，抑制破骨细胞的肌动蛋白环的形成，而肌动蛋白环是成熟破骨细胞具有骨吸收作用的重要标志，进而能抑制破骨细胞骨吸收，同时也对破骨细胞成活具有重要作用，所以上述河蚌抗氧化活性多糖具有抗骨质疏松的生物活性，能够有效地治疗和/或预防骨质疏松症。

下面，结合具体实施例对本发明实施方式作进一步说明。

实施例1：

河蚌抗氧化活性多糖的制备方法，包括以下步骤：

S1步骤：料液比为1:3(g/mL)将河蚌下脚料加水，在压力为220MPa下超高压处理18min，然后打浆，均质，得到匀浆液；

S2步骤：按添加量为0.25％将上述匀浆液中加入木瓜蛋白酶，在温度为50℃下酶解1h，离心，得到酶解液；

河蚌抗氧化活性多糖的得率通过式(I)：多糖得率(％)＝(多糖(g)/蚌下脚料(g))×100％计算得到，具体为7.83％，多糖中不含蛋白质。

实施例2：

河蚌抗氧化活性多糖的制备方法，包括以下步骤：

S1步骤：料液比为1:4(g/mL)将河蚌下脚料加水，在压力为250MPa下超高压处理20min，然后打浆，均质，得到匀浆液；

S2步骤：按添加量为0.3％将上述匀浆液中加入木瓜蛋白酶，在温度为56℃下酶解1.5h，离心，得到酶解液；

S4步骤：将上述河蚌粗多糖用离子水溶解后，分离得到分子量为25-60kDa部分，干燥，得到河蚌多糖。

1.河蚌抗氧化活性多糖的得率为8.02％，多糖中不含蛋白质。

2.河蚌抗氧化活性多糖的分子量测定

1)分子量测定采用GPC的方法；

2)色谱条件与系统适应性试验：用SRT SEC-100(7.8×300mm，5μm)凝胶柱；0.7％硫酸钠溶液为流动相；柱温35℃，流速0.5mL/min；示差折光检测器，理论板数按葡萄糖峰计算，应不小于5000，不同分子量的Dextran作为对照品，制作标准曲线，由此得到的线性回归方程为：log(M_W)＝-0.3177T_R+9.8088，R²＝0.9945；

3)测定法：取本品10mg，加2mL流动相溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，取20μL注入色谱仪，记录色谱图，采用GPC多糖专用软件处理。

根据多糖分子量标准曲线和多糖样品在色谱图上的保留时间可计算出多糖样品的平均相对分子量。实施例2所得多糖分子量结果如图1所示，保留时间为，结果表明，实施例2所得多糖重均分子量主要分布在30-56kDa左右。

3.河蚌抗氧化活性多糖的单糖组成分析

1)组成分析采用HPLC-PMP柱前衍生化法；

2)试剂与仪器：标准品Fuc(岩藻糖)、Rha(鼠李糖)、Ara(阿拉伯糖)、Xyl(木糖)、Man(甘露糖)、Gal(半乳糖)、Glu(葡萄糖)、GalA(半乳糖醛酸)、GlcA(葡萄糖醛酸)，均购自Sigma公司，纯度为99％，LC-2010高效液相色谱仪为日本岛津公司产品。

3)多糖衍生物的制备：

色谱条件：采用C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A为磷酸盐缓冲液(pH6.8)-乙腈(85:15，v/v)；流动相B为磷酸盐缓冲液(pH 6.8)-乙腈(60:40，v/v)；流速：0.9mL/min；检测波长250nm，进样量10μL；

标准品溶液的制备：取标准品单糖溶液(2mmol/L)各5mL，加0.5mol/LPMP甲醇溶液6mL，加0.3mol/L氢氧化钠溶液5mL，50℃水浴反应0.5h，加0.3mol/L盐酸溶液5mL中和，用等体积三氯甲烷萃取3次，取水层放置过夜，制得标准品PMP衍生物；

供试品溶液的制备：精密称取多糖样品20mg，加入2mol/L TFA于100℃水解8h，干燥后加纯化水10mL溶解，精密量取5mL供试品溶液，衍生化方法同上，制得样品PMP衍生物。分别取标准品和样品PMP衍生物进行单糖组成分析。多糖单糖组成分析结果如图2所示。

通过将抗氧化活性多糖与种单糖标准品的色谱图进行比较和按不同浓度下各单糖的峰面积绘制的标准曲线进行定量分析可知：抗氧化活性多糖的单糖残基中含有葡萄糖、半乳糖和鼠李糖，其摩尔比为1:(0.15-0.20):(0.22-0.33)。

4.河蚌抗氧化活性多糖的化学结构表征

1)化学结构分析采用甲基化的方法进行；

2)试剂与仪器：气质联用仪(GC-MS)为Agilent公司的6890N/5973MSD，DB-One石英毛细管柱(30m×0.25mm)；

3)脱水DMSO的制备：4A分子筛于马弗炉烘3h后放入平底烧瓶中，加入DMSO，放入转子密封搅拌过夜，静置至澄清；

4)NaOH-DMSO混悬液制备：4A分子筛于240℃烘干3h，放凉后加入DMSO密封搅拌过夜。称取1gNaOH，加入1mL水溶解，加入1mL脱水DMSO搅拌，离心。重复此操作10-15次。沉淀加入1mL脱水DMSO，充氮气密封搅拌过夜，备用；

5)甲基化：样品20mg真空干燥24h，加入脱水DMS0 0.5mL，充氮气密封搅拌过夜，加入0.5mLNaOH-DMSO混悬液，充氮气密封搅拌30min，加入0.3mL碘甲烷，充氮气密封搅拌30min，加2mL水终止反应。加3mL氯仿，搅拌离心，弃去水层，氯仿层用水洗脱2次。吹干氯仿层，得全甲基化多糖；

6)水解还原乙酰化：将全甲基化样品加2mol/L三氟乙酸1ml，密封，置121℃水解1.5小时，吹干，残渣加甲醇1ml，吹干，反复三次，残渣加1mol/L氨水0.5ml,加硼氢化钠20mg，室温还原1.5小时，滴加冰醋酸至无气泡产生，吹干，残渣加10％醋酸甲醇溶液1ml，吹干，反复三次，还原后样品置五氧化二磷保干器过夜，分别加0.5ml吡啶，1ml醋酸酐密封，置121℃烘箱中3小时，水解液放冷后吹干，残渣加1ml甲醇吹干，反复三次，残渣加3ml水溶解，加1ml三氯甲烷萃取三次，三氯甲烷层吹干，残渣加少量丙酮溶解，作为供试品溶液，进行GC-MS分析；

7)分析条件：DB-One石英毛细管柱(30m×0.32)，进样口温度250℃，柱温120℃保持5min，5℃/min升到220℃，进样量0.2μL，根据保留时间和质谱碎片峰，确定糖的种类和糖苷键的连接方式。

甲基化分析结果表明：抗氧化活性多糖中葡萄糖的连接方式都是以1→4糖苷键为主，存在1→4、1→6和1→3、1→4分支以及一些末端糖基(1→)，半乳糖和鼠李糖绝大部分或全部都是以1→3糖苷键为主，穿插在葡萄糖主链和支链中。

实施例3：

河蚌抗氧化活性多糖的制备方法，包括以下步骤：

S1步骤：料液比为1:5(g/mL)将河蚌下脚料加水，在压力为280MPa下超高压处理25min，然后打浆，均质，得到匀浆液；

S2步骤：按添加量为0.34％将上述匀浆液中加入木瓜蛋白酶，在温度为60℃下酶解2h，离心，得到酶解液；

S4步骤：将上述河蚌粗多糖用离子水溶解后，分离得到分子量为65kDa部分，干燥，得到河蚌多糖。

河蚌抗氧化活性多糖的得率为7.66％，多糖中不含蛋白质。

实施例4：

河蚌抗氧化活性多糖的制备方法，包括以下步骤：

S2步骤：按添加量为0.3％将上述匀浆液中加入木瓜蛋白酶，在温度为56℃下酶解1.5h，然后添加木瓜蛋白重量0.36％的氨基磺酸和木瓜蛋白重量0.25％的聚环氧琥珀酸，搅拌均匀后离心，再加入，得到酶解液；氨基磺酸和聚环氧琥珀酸的加入配合离心的作用力一方面能够打断相对分子质量较大的链，降解大分子多糖，提高河蚌抗氧化活性多糖的得率，另一方面可提高多糖的抗骨质疏松的生物活性，进一步提高其抗骨质疏松症的效果；

河蚌抗氧化活性多糖的得率为8.22％，多糖中不含蛋白质。

对比例1：

本对比例与实施例2的技术方案的区别在于：本对比例S1步骤中河蚌下脚料未经超高压处理。河蚌抗氧化活性多糖的得率为6.34％，多糖中蛋白质含量为1.03％，河蚌抗氧化活性多糖的得率明显低于实施例2的得率且含有蛋白，这表明，超高压处理能够提高河蚌抗氧化活性多糖的得率，使得河蚌粗多糖中的蛋白质更易于被脱除。

试验例1：

1.河蚌抗氧化活性多糖对破骨细胞的影响

1)主要试剂配制方法

α-MEM培养液配制：4℃冰箱中解冻500ml的胎牛血清，在超净工作台里无菌分装胎牛血清，移液于50ml的离心管中。将500mlα-MEM培养液，用移液枪移除55ml。将50ml胎牛血清、5ml青霉素、链霉素双抗，加入至445mlα-MEM培养液里，吹打混和均匀，保存于4℃冰箱中待用；

PBS溶液的配制：购买的PBS固体+2000ml双蒸水稀释，完全溶化后予分装，消毒后4℃保存备用。

2)小鼠骨髓单核细胞(BMMs)分离培养

取小鼠(C57BL/6)股骨、胫骨，去干净软组织，后将其移入超净台，转至无菌PBS中；用2-3mlα-MEM培养液冲洗骨髓腔，冲出骨髓直至骨髓腔发白；骨髓细胞收集于15ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，使用5ml不完全的α-MEM培养液重悬细胞；加入2ml红细胞裂解液，上下摇晃多次而后室温静置1-2min；随后1000rpm离心5min，弃上清；加入预热的1mlPBS,用吸管吹打混匀，1000rpm离心5min，弃上清，重复三次；弃上清，细胞重悬于完全的α-MEM培养液中并转移至10cm培养皿中，加入10ng/m1 M-CSF，培养过夜；收集悬浮细胞，将细胞转移至六孔板中。培养基中加入30ng/ml M-CSF继续培养细胞3d。

3)CCK-8细胞增殖-毒性检测法检测河蚌抗氧化活性多糖对细胞活性的影响

把贴壁BMMs用吸管吹打法与胰酶消化制成细胞悬液，将其均匀，然后调整细胞数是10×l04个/ml；在96孔板中接种BMMs悬液(1.5×104个/孔)，将细胞在含有30ng/ml M-CSF和50ng/ml RANKL的诱导培养基中在培养箱中培养(在37℃，5％CO2的条件下)；培养过夜后，移除原培养基，加入含有不同河蚌抗氧化活性多糖(0,0.01,0.1,1,5,10,20,30,40μM)的诱导培养基，诱导培养48小时；向每孔加入含10μl CCK-8溶液的α-MEM培养基100μl，每组设4个复孔；将培养板在培养箱内孵育3小时；用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD)。

图3为450nm处细胞的OD值，由图可知：5μM以内河蚌抗氧化活性多糖作用于BMMs，其OD值与对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)；河蚌抗氧化活性多糖浓度大于5μM时，其与BMMs共培养的OD值与对照组比较具有统计学差异(p<0.05)。说明浓度小于5μM的河蚌抗氧化活性多糖对BMMs增殖活性无明显影响，对BMMs无明显毒性；而浓度大于10μM时，河蚌抗氧化活性多糖能明显抑制BMMs增殖。

4)河蚌抗氧化活性多糖对BMMs分化成熟为破骨细胞的影响

将生长良好的BMMs以1×10⁴/孔接种于96孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中培养过夜；在培养箱中培养过夜后，移除原有培养基，先在M-CSF(30ng/ml)和河蚌抗氧化活性多糖(0、0.01、0.1、1μM)的培养基预处理细胞4h，随后加入RANKL(50ng/ml)，每3d换液，培养5d后，光镜下观察破骨细胞大体形态；或加入含有RANKL(50ng/ml)、M-CSF(30ng/ml)的培养基诱导，在d0、d2、d4再加入河蚌抗氧化活性多糖(1μM)，每隔3d换液，总共培养5d，光镜下观察OCs大体形态；弃去上清，用PBS洗涤2遍，使用Sigma公司提供的TRAP染色试剂盒进行染色：用4％多聚甲醛固定细胞10min；移除固定液，用预热的PBS清洗细胞3次，再在以萘酚ASBI磷酸盐作为底物的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染液中37℃孵育lh；移除TRAP染液，PBS清洗细胞2-3次，在倒置显微镜下观察拍照；计数TRAP染色阳性多核破骨细胞(细胞核≥3)，以及测量TRAP染色阳性多核破骨细胞所占面积比，作统计学分析。

图4A和B为各组TRAP染色后破骨细胞数量、相对面积比的比较，由图可知：给药后破骨细胞均减少，且干预组(0.1,1μM河蚌抗氧化活性多糖)与对照组比较，破骨细胞数明显减少；给药后破骨细胞相对面积比均缩小，且干预组(0.1,1μM河蚌抗氧化活性多糖)与对照组比较，破骨细胞相对面积比显著降低，这说明河蚌抗氧化活性多糖能在早期抑制RANKL诱导的破骨细胞的活化，且还能抑制RANKL诱导的破骨细胞分化成熟的作用。

5)骨细胞培养表面板(Osteo Assay Surface，OAS)检测河蚌抗氧化活性多糖对破骨细胞骨吸收能力的影响

将生长状态良好的BMMs以1×105个/孔接种于24孔骨细胞培养表面板，在37℃、5％CO2培养箱中培养过夜；在培养箱中培养过夜后，移除原有培养基，先用含有M-CSF(30ng/ml)和河蚌抗氧化活性多糖(0、0.01、0.1、1μM)的培养基预处理细胞4h，随后加入RANKL(50ng/ml)，每组复孔3个，每3d换液1次，共培养5d；弃去上清液，用超声波清洗机反复冲洗2次，每次7分钟以清洗残留的细胞，最后再用PBS冲洗后自然状态下晾干，将OAS板置于(蔡司)倒置显微镜下选取每组骨吸收陷窝图像并拍摄照片；对拍摄的照片采用Image J图像分析软件进行分析，并计算及比较各组骨吸收陷窝面积比。

图5各组破骨细胞骨吸收面积比的比较，由图可知：给药后骨吸收面积比减少，且干预组(0.1,1μM河蚌抗氧化活性多糖)与对照组比较，骨吸收面积比减少显著降低，这说明河蚌抗氧化活性多糖对RANKL诱导OCs的骨吸收具有明显的抑制作用。

6)河蚌抗氧化活性多糖对破骨细胞肌动蛋白环(F-actin环)形成的影响

将生长状态良好的BMMs以1.0×10⁴个/孔接种于96孔板，在37℃、5％CO2培养箱中培养过夜；在培养箱中培养过夜后，移除原有培养基，先用含有M-CSF(30ng/ml)和河蚌抗氧化活性多糖(0、0.01、0.1、1μM)的培养基预处理细胞4h，随后加入RANKL(50ng/ml)；每组复孔3个，每3d换液，培养5d；用4％多聚甲醛固定10min，然后加入0.1％Triton-X100，透化5min，用PBS洗涤3遍；在室温下、暗室内，绿色荧光标记的鬼笔环肽(3.5μl溶液+500μl PBS，等比例加入)，染色30min；PBS洗涤3次后，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色10min，再用PBS洗涤3次；免疫荧光电镜观察F-actin环形态、大小。结果表明：随着河蚌抗氧化活性多糖浓度增加，OCs的F-actin环的外形、大小显著减小，这说明河蚌抗氧化活性多糖能抑制OCs的F-actin环的形成。

综上所述，河蚌抗氧化活性多糖具有抗骨质疏松的生物活性，能够有效地治疗和/或预防骨质疏松症。

2.河蚌抗氧化活性多糖的骨质疏松药效动物实验

雌性SD大鼠，6周龄，体重200±20g，饲养于SPF级动物房中，适应性喂养一周，随机分为正常对照组、假手术组、去势模型组、给药组1(实施例2制得，100mg/kg)、给药组2(实施例2制得，200mg/kg)、给药组3(实施例2制得，300mg/kg)、给药组4(实施例2制得，500mg/kg)、给药组4(实施例4制得，100mg/kg)、给药组5(实施例4制得，200mg/kg)、西药对照组(雌二醇)、中药对照组(更年安)。于去卵巢手术后2周开始，正常对照组、假手术组、去势模型组按体重1ml/100g灌胃给予溶剂0.5％羧甲基纤维素钠，其余各组按1ml/100g体重灌胃给药；给药时间为2个月(每天给药1次)，每周大鼠称重一次，根据体重变化情况调整给药剂量。

其中，去卵巢手术即去势手术以及假手术的操作与效果例2相同。

末次给药后24小时，10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰卧体位固定，分离得到左侧胫骨备用，扫描前，将10％甲醛液中浸泡的左侧胫骨沿长轴垂直置于样品容器内，四周填塞适量纱条以固定样本。运行Viva CT 40系统软件，对胫骨标本进行X线预扫描并获得X线图像。在X线图像上选取适当部位和长度，启动开始CT扫描程序。扫描完成后，进行2D图像重建。之后根据2D图像，选取区域的位置和体积，运用Viva CT 40系统软件进行分析。设置扫描参数如下：电流111μA，电压70kVp，层厚度10.5μm，扫描时间60min。分析部位：左侧胫骨骺线以下1.05mm厚度，测定左侧胫骨松质骨的微结构参数：骨体积密度(TV)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N*)、骨小梁厚度(Tb.Th*)。实验结果见表5。

表5：河蚌抗氧化活性多糖对大鼠骨密度相关指标的影响表

组别	动物数量(只)	骨体积密度	骨体积分数	骨小梁数目	骨小梁厚度
						正常对照组	15	547.23	0.58	5.12	0.26
假手术组	15	535.34	0.57	5.11	0.25
						去势模型组	15	367.95	0.4	3.17	0.26
给药组1	15	478.23	0.51	4.24	0.28
						给药组2	15	515.34	0.55	4.82	0.32
给药组3	15	520.48	0.55	4.93	0.33
						给药组4	15	512.08	0.56	4.85	0.34
给药组5	15	517.84	0.57	4.9	0.35
						西药对照组	15	482.01	0.48	4.01	0.29
中药对照组	15	510.22	0.52	3.6	0.33

由表5可知：1)与正常组比较，去势模型组松质骨的骨体积密度显著下降，与去势模型组比较，给药组1-5、西药对照组和中药对照组的松质骨骨体积密度均明显增加；2)与正常组比较，去势模型组松质骨的骨体积分数显著下降，与去势模型组比较，给药组1-5、西药对照组和中药对照组的松质骨骨体积分数均明显增加；2)与正常组比较，去势模型组骨小梁数目减少，与去势模型组比较，给药组1-5、西药对照组和中药对照组的去势模型组骨小梁数目减少；4)与正常组比较，去势模型组骨小梁厚度不变，与去势模型组比较，给药组1-5、西药对照组和中药对照组的去势模型组骨小梁厚度增加。此外，给药组对骨质疏松的综合药效优于西药对照组和中药对照组，这说明，本发明河蚌抗氧化活性多糖具有抗骨质疏松的生物活性，能够有效地治疗和/或预防骨质疏松症；同时给药组1的松质骨骨体积密度低于给药组4，这说明给药量为100mg/kg，实施例2的效果差于实施例4，这说明实施例获得的河蚌抗氧化活性多糖能更有效地治疗和/或预防骨质疏松症。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims

1.河蚌抗氧化活性多糖，其特征在于：其分子量范围为23-62kDa，所述抗氧化活性多糖的单糖残基中含有葡萄糖、半乳糖和鼠李糖。

2.根据权利要求1所述的河蚌抗氧化活性多糖，其特征在于：所述抗氧化活性多糖的分子量范围为30-56kDa。

3.根据权利要求1或2所述的河蚌抗氧化活性多糖，其特征在于：所述抗氧化活性多糖的单糖残基中，葡萄糖、半乳糖和鼠李糖的摩尔比为1:(0.15-0.20):(0.22-0.33)。

4.权利要求1或2或3所述的河蚌抗氧化活性多糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S2步骤：将所述匀浆液中加入酶，酶解，离心，得到酶解液；

S3步骤：利用Sevage法脱除所述酶解液中的游离蛋白，上清液浓缩，醇沉，得到河蚌粗多糖；

S4步骤：将所述河蚌粗多糖用离子水溶解后，分离得到分子量为20-65kDa部分，干燥，得到河蚌多糖。

5.根据权利要求4所述的河蚌抗氧化活性多糖的制备方法，其特征在于：所述S1步骤中河蚌下脚料和水的料液比为1:3-5(g/mL)。

6.根据权利要求4所述的河蚌抗氧化活性多糖的制备方法，其特征在于：所述S1步骤中超高压处理压力为220-280MPa，处理时间为18-25min。

7.根据权利要求4所述的河蚌抗氧化活性多糖的制备方法，其特征在于：所述酶选自木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶或它们的混合物。

8.根据权利要求4所述的河蚌抗氧化活性多糖的制备方法，其特征在于：所述酶的添加量为0.25-0.34％，所述酶解温度为50-60℃、时间为1-2h。

9.权利要求1或2或3所述的河蚌抗氧化活性多糖的用途，其特征在于：在制备抗氧化药物、食品或化妆品中的用途。

10.权利要求1或2或3所述的河蚌抗氧化活性多糖的用途，其特征在于：在制备治疗和/或预防骨质疏松症制剂中的用途。