CN107417809B - 硫酸软骨素用于扩增cik细胞、制备cik细胞扩增试剂和包被培养器皿的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了硫酸软骨素用于扩增CIK细胞、制备CIK细胞扩增试剂和包被培养器皿的用途，该高分子量硫酸软骨素由动物胸软骨来源的硫酸软骨素经酸降解制备而得，高分子量指分子量范围为14.2‑15.6kD。本发明提供的高分子量硫酸软骨素可以显著提高CIK细胞的扩增活力和杀瘤活性，可以用于制备商品化的CIK细胞培养基和培养器皿。

Description

硫酸软骨素用于扩增CIK细胞、制备CIK细胞扩增试剂和包被 培养器皿的用途
技术领域
本发明属于细胞免疫领域，涉及CIK细胞，具体涉及硫酸软骨素用于扩增CIK细胞、制备CIK细胞扩增试剂和包被培养器皿的用途。
背景技术
硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)广泛存在于各种动物组织中，尤其在软骨和结缔组织中含量丰富。由于不同生物或者相同生物的不同组织所含CS的种类和量均不同，使其结构与活性复杂多样。作为一类重要的生物大分子，CS具有广泛的生物活性，作为安全有效的保健食品和药品在世界各国得到了广泛应用。大量研究表明，CS具有降血脂、抗动脉粥样硬化和抗病毒性肝炎等活性，临床中已用于防治关节炎、肾炎、神经痛、偏头痛等。
CS属于糖胺聚糖类(Glycosaminoglycans，GAGs)物质，以蛋白聚糖的形式广泛分布于动物的软骨、皮肤、玻璃体及血管等组织中，在软骨组织中尤其丰富，是软骨的重要组成成分。CS是一类含有聚阴离子的线性多糖，由D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)构成的二糖单位以[4)-β-GlcA-(13)-β-GalNAc-(1]的序列重复连接组成骨架结构，并在后续的生物合成过程中在不同的位置引入硫酸基。不同来源及提取方法得到的CS其硫酸化的位点和程度、相对分子质量(Mr)均存在差异，而这是影响CS生物活性的关键因素。
生物治疗是继手术、化疗及放疗3种传统模式之后的第4大肿瘤治疗模式，前3种模式或毒副作用较大，或不能清除体内残存肿瘤细胞，大部分肿瘤患者终因复发或难治而导致死亡。细胞免疫治疗技术在肿瘤的生物治疗中占有重要地位,显示出良好的应用前景，并逐渐成为肿瘤治疗的重要手段之一。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killercell，CIK)是近年来发现的一种非常有前景的过继免疫细胞，具有增殖迅速、杀瘤活性广谱且高效、毒副作用微小等优点，已经成为肿瘤生物免疫治疗的主力军。CIK细胞的主要效应细胞为CD3+CD56+表型T淋巴细胞，兼有NK细胞和T细胞的特征。在功能上，CIK一方面拥有T淋巴细胞强大抗肿瘤活性，另一方面拥有NK细胞非MHC限制性的杀伤肿瘤的特点，其增殖迅速、对正常造血影响轻微。CIK细胞的扩增活力和杀瘤活性直接关系到治疗成本和效果。
目前尚未见硫酸软骨素在CIK细胞培养扩增方面的应用。
发明内容
本发明旨在提供硫酸软骨素用于扩增CIK细胞、制备CIK细胞扩增试剂和包被培养器皿的用途，以提高CIK细胞的扩增活力和杀瘤活性，降低细胞治疗成本并提升治疗效果。
本发明通过如下技术方案得以实现：
一种高分子量硫酸软骨素，由动物胸软骨来源的硫酸软骨素经酸降解制备而得，所述高分子量指分子量范围为14.2-15.6kD。
优选地，所述酸为苹果酸。
优选地，所述酸降解的方法包括如下步骤：配制质量体积浓度为2-4％的硫酸软骨素溶液，加入苹果酸至浓度为0.1-0.3mol/L，于60-80℃搅拌降解8-12h，用足量的碱性物质终止反应，并调节pH至6.5，加入乙醇沉淀，分离干燥即得所述的高分子量硫酸软骨素。
优选地，所述碱性物质为碳酸钙。
优选地，所述动物胸软骨指鸡胸软骨。
优选地，鸡胸软骨来源的硫酸软骨素的制备方法包括如下步骤：将鸡胸软骨用木瓜蛋白酶于50-60℃提取5.5-6.5h得到酶提液，经三氯乙酸去除蛋白质后抽滤离心，离心条件为4000-5000rpm离心8-12min，上清液浓缩后用乙醇沉淀，离心收集沉淀，离心条件为4000-5000rpm离心8-12min；沉淀透析脱盐后，再用阳离子交换树脂、葡聚糖凝胶柱层析纯化即得鸡胸软骨来源的硫酸软骨素。
上述硫酸软骨素在CIK细胞培养方面的应用。
一种用于CIK细胞培养的培养基，含有有效浓度的上述硫酸软骨素。
优选地，上述培养基内还含有叶绿素。
一种用于CIK细胞培养的培养器皿，培养器皿内壁包被有有效厚度的包被层，包被层的材料为上述硫酸软骨素。
优选地，上述培养器皿内部用氩气填充密封。
本发明优点：
本发明提供的高分子量硫酸软骨素可以显著提高CIK细胞的扩增活力和杀瘤活性，可以用于制备CIK细胞培养基和培养器皿。
附图说明
图1为高分子量硫酸软骨素与硫酸软骨素原料的红外光谱图对比。
具体实施方式
为了更好地解释本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。
实施例1：高分子量硫酸软骨素的制备和表征
1、鸡胸软骨来源的硫酸软骨素的制备：
将新鲜的鸡胸软骨去筋膜后，55℃烘干粉碎过40目筛得软骨粉，将软骨粉溶于质量体积百分含量为8％的木瓜蛋白酶溶液中(5g软骨粉对应1L溶液)，用木瓜蛋白酶于55℃提取6h得到酶提液，加入三氯乙酸至体积浓度为10％，反应1.5小时经三氯乙酸去除蛋白质后抽滤离心，离心条件为4000-5000rpm离心8-12min，上清液浓缩后用乙醇沉淀(95％乙醇体积为上清液体积的5倍)，离心收集沉淀，离心条件为4000-5000rpm离心8-12min。沉淀用去离子水复溶透析脱盐后，再用732#阳离子交换树脂、SEPHACRYL S-300 HR葡聚糖凝胶柱层析纯化、冷冻干燥即得鸡胸软骨来源的硫酸软骨素(下文称硫酸软骨素原料)。
2、高分子量硫酸软骨素的制备
制备实例1：将上述硫酸软骨素原料用去离子水溶解配制成质量体积浓度为3％的硫酸软骨素溶液，加入苹果酸至浓度为0.2mol/L，于70℃搅拌降解10h，用足量的碳酸钙粉末终止反应，并调节pH至6.5，加入乙醇沉淀(95％乙醇体积为降解溶液体积的8倍)，离心后55℃烘干即得所述的高分子量硫酸软骨素。
制备实例2：将上述硫酸软骨素原料用去离子水溶解配制成质量体积浓度为2％的硫酸软骨素溶液，加入苹果酸至浓度为0.1mol/L，于60℃搅拌降解12h，用足量的碳酸钙粉末终止反应，并调节pH至6.5，加入乙醇沉淀(95％乙醇体积为降解溶液体积的8倍)，离心后55℃烘干即得所述的高分子量硫酸软骨素。
制备实例3：将上述硫酸软骨素原料用去离子水溶解配制成质量体积浓度为4％的硫酸软骨素溶液，加入苹果酸至浓度为0.3mol/L，于80℃搅拌降解8h，用足量的碳酸钙粉末终止反应，并调节pH至6.5，加入乙醇沉淀(95％乙醇体积为降解溶液体积的8倍)，离心后55℃烘干即得所述的高分子量硫酸软骨素。
3、分析与测试
硫酸软骨素分子量采用《中国药典》(2010版)中高效液相色谱法测定，结果如下表：
红外吸收光谱测试：KBr压片，4000～400cm-1波数范围扫描。结果如图1所示，图1上面的红外图谱为硫酸软骨素原料的红外图谱，图1下为制备实例1制备的高分子量硫酸软骨素，制备实例2和3与制备实例1图谱基本一致。从红外图谱可以看出，上述酸水解方法非常温和，未造成硫酸软骨素化学基团的破坏，仅仅是使其断裂分子量减少。
实施例2：高分子量硫酸软骨素对CIK细胞扩增活力和杀瘤活性的影响
一、实验材料
10％胎牛血清和RPMI-1640培养液购于Gibco公司，淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司(TBD)，IL-2购自北京双鹭药业股份有限公司，抗人CD3单抗购自Gibco公司，IFN-γ购自美国PEPROTEC公司，IL-1α购自美国PEPROTEC公司，CCK-8试剂购自上海碧云天生物技术有限公司。
BALB/C裸鼠，均选用雌性裸鼠，鼠龄6-7周，体重18-23g，在SPF条件下的裸鼠室内饲养，由南京大学实验动物中心提供。胃癌MGC-803细胞购自上海歌凡生物细胞库。
二、实验方法
1、CIK细胞的分离和培养
(1)单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，RPMI-1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％CO2孵箱中孵育2h。
(2)CIK细胞的培养：收集单核细胞中的悬浮细胞，调整细胞密度至2.5×106/ml，均分为三组进行培养，分组及培养方法如下：
常规组：0天时，在完全培养基(RPMI-1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，放入5％CO2、37℃培养箱中孵育24h后，添加IL-2(500U/mL)、IL-1α(l00U/mL)和抗人CD3单抗(20μg/mL)。每2-3d进行换液，并补充等量的细胞因子，在培养过程中，添加新鲜培养基前用台盼蓝染色检测细胞的活率，统计细胞的绝对数目；连续培养12天，收集细胞；
对比组：0天时，在完全培养基(RPMI-1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)和硫酸软骨素原料(20μg/mL)，放入5％CO2、37℃培养箱中孵育24h后，按照常规组后续方法培养，统计细胞的绝对数目，收集细胞；
诱导组：0天时，在完全培养基(RPMI-1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)和上述制备实例1制备的高分子量硫酸软骨素(20μg/mL)，放入5％CO2、37℃培养箱中孵育24h后，按照常规组后续方法培养，统计细胞的绝对数目，收集细胞。
2、CIK细胞的体外肿瘤杀伤活性
使用CCK-8法检测体外各组CIK细胞对胃癌MGC-803细胞的杀瘤活性，以对数生长期的MGC-803细胞作为靶细胞，待贴壁培养24h后，分别以培养12天的各组CIK细胞作为效应细胞，分别置于37℃、5％CO2、饱和湿度下的细胞培养箱中，待贴壁24h后，按效靶比为10:1加入效应细胞，设效应细胞对照与靶细胞对照，每组3个复孔，效应细胞与靶细胞共培养24h后，每孔按10％的体积加入CCK-8溶液，置于培养箱中继续孵育培养4h后，酶联免疫捡测仪选择波长为450nm测定各孔光吸光值，并按照下式计算杀伤活性(杀伤率)：
杀伤率＝[1-(实验组OD值-效应细胞组OD值)/靶细胞组OD值]×l00％。
3、CIK细胞的体内肿瘤杀伤活性
将BALB/C裸鼠右腋皮下接种0.2mL 1×106/mL MGC-803胃癌细胞后，再随机分成4组：对照组、常规组、对比组和诱导组，每组20只。10d后常规组、对比组和诱导组的每只裸鼠在接种肿瘤细胞部位处注射0.2mL 1×107/mL的CIK细胞(分别对应按照上述常规组、诱导A-D组诱导培养12天)，对照组裸鼠注射0.2mL生理盐水，连续注射5d。15d后每组剥离肿瘤块并称重，按照如下公式计算抑瘤率(％)：
抑瘤率＝(对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量×100％
4、统计学分析
使用SPSS20.0统计学软件进行t检验，P<0.05认为差异显著。
三、实验结果
1、各组CIK细胞的增殖与活率
接种时各组都为2.5×106个细胞，培养至第12天时，常规组的细胞绝对数目为(425.52±42.26)×106个，增殖倍数约为170倍左右；对比组的细胞绝对数目为(456.26±31.34)×106个，增殖倍数约为183倍左右，与常规组相比无显著性差异(P＞0.05)；诱导组的细胞绝对数目分别为(764.86±50.08)×106个，增殖倍数约为306倍左右，与常规组和对比组相比具有显著性差异(P＜0.05)。每次补液前台盼蓝染色检测细胞活率，保证活率约95％。
2、体外各组CIK细胞对胃癌MGC-803细胞的杀瘤活性
分别取培养至第12天时各组CIK细胞对MGC-803细胞进行杀伤实验，在效靶比为10:1时，各组CIK细胞均表现出明显的杀瘤活性，其中诱导组制备的CIK细胞比常规组和对比组制备的CIK细胞具有更强的杀瘤活性，且差异显著(P＜0.05)。
各组CIK细胞对MGC-803细胞的杀伤率如下表所示。
常规组 对比组 诱导组
体外杀伤率(％) 35.94±3.13 38.73±2.94 63.55±3.87
3、体内各组CIK细胞对胃癌移植瘤的杀瘤活性
全部实验裸鼠在接种第7天时在接种部位均有肿瘤形成，直径为0.8-1cm。CIK细胞干预15天后，常规组、对比组、诱导组所有裸鼠的肿块均有所缩小，而对照组所有裸鼠的肿块均增大。解剖时发现，与对照组相比，常规组、对比组、诱导组的肿瘤块较小且局限，而对照组的肿瘤块大且有肿瘤局部浸润现象。常规组、对比组、诱导组抑瘤率见下表。
常规组 对比组 诱导组
体内抑瘤率(％) 45.12±5.67 49.04±6.03 71.38±5.96
从上表可以看出，诱导组比常规组和对比组具有更优的体内抑瘤率，差异显著(P＜0.05)。
制备实例2和3制备的高分子量硫酸软骨素与制备实例1具有基本一致的增殖活力和对肿瘤的体内外杀伤活性。
实施例3：高分子量硫酸软骨素的应用(制备商品化培养基和包被培养瓶)
培养基：在现有的RPMI-1640培养液中添加实施例1制备的高分子量硫酸软骨素，质量体积浓度为20μg/mL。在一个优选实施例中，同时在培养液中添加4-6μg/mL的叶绿素，可以显著提高上述高分子量硫酸软骨素在RPMI-1640培养液中的光照稳定性，且叶绿素的添加不影响CIK细胞的培养和增殖活力、杀伤活性。若不添加叶绿素，4500±500Lx强度的光照(温度25±5℃)连续光照30天，有超过60％的高分子量硫酸软骨素进一步降解至3kD以下；若添加5μg/mL的叶绿素，这一比率在5％以内。
包被细胞培养瓶：采用常规的低温固化工艺在现有的细胞培养瓶(或其他可能用于CIK细胞培养的容器，如培养皿)内表面包被0.2-0.3mm厚度的包被层，包被层材料即为上述高分子量硫酸软骨素。在一个优选实施例中，将包被有该包被层的细胞培养瓶中填充满氩气密封储存。若不填充满氩气，4500±500Lx强度的光照(温度25±5℃)连续光照30天，包被层出现明显的裂隙，显微镜下表面出现皱缩凹孔；若用氩气保护则不会出现这种情况。该方法可以提高包被培养瓶的光照稳定性，延长保质期和货架期。
上述实施例仅用于进一步解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，任何简单替换或修改均不脱离本发明，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。

Claims (3)

1.一种高分子量硫酸软骨素在CIK细胞培养方面的应用，该高分子量硫酸软骨素由动物胸软骨来源的硫酸软骨素经酸降解制备而得，所述高分子量指分子量范围为14.2-15.6kD，所述酸降解的方法包括如下步骤：配制质量体积浓度为2-4%的硫酸软骨素水溶液，加入苹果酸至浓度为0.1-0.3 mol/L，于60-80℃搅拌降解8-12h，用足量的碱性物质终止反应，并调节pH至6.5，加入8倍体积的95%乙醇沉淀，分离干燥即得所述的高分子量硫酸软骨素。
2.根据权利要求1所述的应用，所述碱性物质为碳酸钙。
3.根据权利要求1所述的应用，所述动物胸软骨指鸡胸软骨。
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