CN106834404B - 一种酶解多肽及用于制备治疗肺腺癌药物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶解多肽及用于制备治疗肺腺癌药物的用途，以知了猴为原料，由如下方法制备：将知了猴洗净后绞成肉糜，置于超纯水中，加入Protamex复合蛋白酶酶解，酶解条件为：pH值，6.8‑7.2；酶解温度，43‑47℃；酶解时间，7‑9小时；酶解结束后，加热使复合蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，8000‑10000rpm离心20‑30分钟，取上清，冷冻干燥得冻干粉；将冻干粉用超纯水溶解，用不同截留分子量的超滤膜对所得到的酶解多肽进行分离，将超滤所得组分冻干即得不同分子量大小的酶解多肽。本发明酶解多肽可以抑制肺腺癌A549细胞增殖，促进其凋亡，对肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长具有显著的抑制作用，且肺腺癌A549细胞对酶解多肽不易产生耐药性，毒理研究证明酶解多肽无明显毒副作用。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及多肽药物的制备，具体涉及一种酶解多肽及用于制备治疗肺腺癌药物的用途。
背景技术
肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，死亡率居恶性肿瘤之首。我国肺癌发病率呈现逐年上升趋势，年平均增长近2％。肺癌根据病理学特点的不同分为多种组织类型，肺癌组织类型不同，其治疗措施也不同。根据2004版WHO分类，常见肺癌组织病理学分型分为非小细胞癌(NSCLC)和小细胞癌(SCLC)。非小细胞癌又分为鳞状细胞癌(SCC)、腺癌(AC)和大细胞癌(LCC)。不同肺癌临床治疗方案不同，预后效果也不同。因此，为了提高治疗效果，肺癌的治疗策略已经从传统的以分期为基础的治疗模式转变为以组织学类型和基因突变为指导的个体化、精准的多学科治疗模式。个体化治疗提高了肺癌的治疗和预后效果。
腺癌作为最常见的肺癌组织学类型，在全球及我国发病率均呈上升趋势。流行病学研究结果显示，非小细胞肺癌的发病有明显的性别差异，尤其是腺癌。腺癌占原发肺癌的50％，是非吸烟患者的主要组织学类型。目前在肺癌研究最深入、临床应用最多的是针对表皮生长因子受体EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制剂，而易瑞沙、吉非替尼和厄洛替尼是其主要代表。
生物活性肽(Biologically active peptides,BAP)是一种具有特殊生理功能的小分子活性物质，如抗肿瘤、抗菌、抗高血压、抗病毒以及提高免疫力等，这些物质广泛存在于动物、植物以及微生物中。生物活性肽主要有4种来源，分别为蛋白酶解多肽、微生物发酵代谢多肽、天然活性多肽以及化学合成多肽。
由于近几年来恶性肿瘤发病率的不断提高，而传统的化疗药物不仅毒副作用大而且治疗效果并不理想，因此，生物活性肽凭借其活性高、副作用小、针对性强的优势得到了国内外科研工作者的研究和关注。目前已经从多种生物中提取得到了抗肿瘤活性肽，其中动物来源的活性肽展现了广阔的前景。Hsu等分别用木瓜蛋白酶和蛋白酶XXⅢ酶解金枪鱼肉，分离纯化后得到了两种抗肿瘤活性较好的多肽(Antiproliferative activity offish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines.ProcessBiochemistry,2006,41:1217-1222)。这两条多肽对乳腺癌细胞MCF-7的IC50值达到了8.1和8.8μM。Leng等人通过SephadexG-25、FPLC并结合MALDI-TOF成功的从壳蛤中分离出了对胃癌细胞BGC-823有明显抑制作用的分子量为3147u活性肽，当肽的浓度为4.0μg/mL时其对癌细胞的抑制率达到了60％(Inhibitory effects of anticancer peptide fromMercenaria on the BGC-823 cells and several enzymes.FEBS Letters,2005,579:1187-1190)。另外还分别从贻贝、泥蚶、海鞘、牡蛎等动物体内得到了抗肿瘤肽，这些都为以后动物体内抗肿瘤肽的提取奠定了基础。
知了猴又称知了龟、爬蚱等，是金蝉的成熟若虫，蛋白含量非常高，具有较高的食用和药用价值。然而，目前对于知了猴多肽的提取、分离纯化及抗肿瘤方面的研究鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶解多肽及用于制备治疗肺腺癌药物的用途。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种酶解多肽，以知了猴为原料，由如下方法制备：
将知了猴洗净后绞成肉糜，置于超纯水中，加入Protamex复合蛋白酶酶解，酶解条件为：pH值，6.8-7.2；酶解温度，43-47℃；酶解时间，7-9小时；
酶解结束后，加热使复合蛋白酶灭活，冷却至常温；
冷却后，8000-10000rpm离心20-30分钟，取上清，冷冻干燥得冻干粉；
将冻干粉用超纯水溶解，用不同截留分子量的超滤膜对所得到的酶解多肽进行分离，将超滤所得组分冻干即得不同分子量大小的酶解多肽。
优选地，所述不同截留分子量的超滤膜包括截留分子量分别为10000u、5000u、3000u以及1000u的超滤膜。
优选地，酶解多肽的分子量范围为3000-5000u。
优选地，酶解多肽的分子量范围为1000-3000u。
优选地，加热使复合蛋白酶灭活的方法为：在80-90℃条件下水浴8-12分钟。
优选地，加热使复合蛋白酶灭活的方法为：在85℃条件下水浴10分钟。
优选地，酶解条件为：pH值，7.0；酶解温度，45℃；酶解时间，8小时。
优选地，离心条件为：9000rpm离心25分钟。
优选地，所述Protamex复合蛋白酶的添加量为底物肉糜重量的0.4-0.5％。
上述酶解多肽用于制备治疗肺腺癌的药物的用途。
本发明的有益效果：
本发明提供的酶解多肽可以抑制肺腺癌A549细胞增殖，促进其凋亡，对肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长具有显著的抑制作用，且肺腺癌A549细胞对酶解多肽不易产生耐药性，毒理实验研究证明酶解多肽无明显毒副作用。
附图说明
图1为酶解多肽3、酶解多肽4和顺铂对A549细胞的IC50(μg/mL)；
图2为酶解多肽3、酶解多肽4和顺铂对A549细胞裸鼠移植瘤抑瘤率(％)；
图3为各给药组与空白对照组移植瘤大小比较；
图4为大剂量药物反复冲击15次后A549耐药细胞株的IC50(μg/mL)。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图详细介绍本发明的技术方案和技术效果。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知。
实施例1酶解多肽的制备
一、实验材料
1、仪器试剂
超滤杯和超滤膜购于上海摩速科学器材有限公司；
Protamex复合蛋白酶为诺维信复合蛋白酶。
2、实验样品
收集刚出土上树的新鲜知了猴，保存在水中，于-20℃冻存。使用前于室温条件自然化冻。
二、实验方法
1、酶解方法
将知了猴洗净后绞成肉糜，取10g肉糜置于50mL超纯水中，加入Protamex复合蛋白酶进行酶解，Protamex复合蛋白酶的添加量为底物肉糜重量的0.45％，酶解条件为：pH值，7.0；酶解温度，45℃；酶解时间，8小时；
酶解结束后，在85℃条件下水浴10分钟使复合蛋白酶灭活，冷却至常温；
冷却后，9000rpm离心25分钟，取上清，冷冻干燥得冻干粉。
2、纯化方法
将冻干粉用超纯水溶解(1g冻干粉加10mL超纯水)，然后依次用截留分子量为10000u、5000u、3000u以及1000u的超滤膜对所得到的酶解多肽进行分离，将超滤所得组分冷冻干燥(含水量≤5％)即得不同分子量大小的酶解多肽。
超滤过程中控制CO2的压力使其小于0.25MPa。
三、实验结果
得到五个不同分子量范围的酶解多肽，分子量范围分别为：
酶解多肽1，分子量为10000u以上；
酶解多肽2，分子量介于10000u和5000u之间；
酶解多肽3，分子量介于5000u和3000u之间；
酶解多肽4，分子量介于3000u和1000u之间；
酶解多肽5，分子量为1000u以下。
实施例2酶解多肽对肺腺癌A549细胞增殖与凋亡的影响
1、细胞培养：人肺癌细胞株A549用含10％小牛血清的RPMI-1640培养基，于37℃、5％CO2条件下常规培养，传代。
2、MTT法测定酶解多肽抑制肿瘤细胞生长实验
取对数生长期的A549细胞，用胰酶消化后稀释成2×104/mL，按每孔100μL接种于96孔培养板中；以空白培养液为对照，顺铂为阳性药。静置培养24h后，移弃各孔中的旧培养液。向实验组各孔中分别加入100μL含不同浓度酶解多肽3或酶解多肽4的培养液，每组6孔。酶解多肽作用48h后，直接向各组每孔中分别加入20μLMTT(浓度为5mg/mL)，继续培养4h后小心弃去上清。然后，每孔加入100μLDMSO，振荡15min，570nm测定光吸收值。根据公式：细胞抑制率＝1-[(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)]×100％计算酶解多肽3、酶解多肽4和阳性药对A549细胞抑制率，实验重复3次。所有数据均用Origin 9.0软件处理，除了IC50采用软件中非线性拟合得出外，其余结果全部用平均值±标准偏差表示。
不同浓度酶解多肽3和酶解多肽4对A549细胞抑制率见表1和表2。
酶解多肽3、酶解多肽4和顺铂对A549细胞抑制率的IC50值见表3和图1。
表1不同浓度酶解多肽3对A549细胞抑制率(n＝3)
| 浓度(μg/mL) | 32 | 16 | 8 | 4 | 2 |
| 抑制率(％) | 95.36±2.67 | 72.14±1.33 | 54.32±1.26 | 46.55±0.96 | 40.82±0.44 |
表2不同浓度酶解多肽4对A549细胞抑制率(n＝3)
| 浓度(μg/mL) | 160 | 120 | 80 | 40 | 20 |
| 抑制率(％) | 85.86±3.76 | 64.83±1.62 | 43.86±1.02 | 24.43±1.05 | 15.58±0.57 |
表3酶解多肽3、酶解多肽4和顺铂对A549细胞抑制率的IC50值
| 酶解多肽3 | 酶解多肽4 | 顺铂 | |
| IC50值(μg/mL) | 6.05 | 94.22 | 1.94 |
该实施例证明，酶解多肽3和酶解多肽4对A549细胞具有显著的抑制作用，其中，酶解多肽3对A549细胞的抑制作用显著，接近于阳性药顺铂的抑制效果。
实施例3酶解多肽对肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长抑制作用
肺腺癌裸鼠模型的建立及分组：取对数生长期肺腺癌A549细胞用0.25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，台盼蓝拒染法记数活细胞数占95％以上，将细胞密度调至1×107/ml，每只裸鼠取0.2ml细胞悬液接种于右大腿背侧皮下，术前测量体重。接种后每日观察，待出现肉眼可见移植瘤后，用游标卡尺测量移植瘤，待移植瘤体积达100mm3左右将裸鼠按瘤体积和荷瘤鼠体重均衡原则随机分为空白对照组、酶解多肽3给药组(4mg/kg)、酶解多肽4给药组(20mg/kg)和顺铂组(2mg/kg)，空白对照组给予等体积生理盐水，经皮下注射给药，隔天一次，连续十次。药物处理结束后一天，颈椎脱臼法处死裸鼠，照相，观察记录各组裸鼠包块形态大小，将肿块剥出、称重，冷藏于-80℃备用。
通过肿瘤抑制率观察各药物对肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长抑制作用，抑瘤率＝(1-给药组瘤重/空白对照组瘤重)×100％。结果如表4和图2和图3。
表4各药物对肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长抑制作用
| 酶解多肽3 | 酶解多肽4 | 顺铂 | |
| 抑瘤率(％) | 55.4±3.8 | 28.6±2.9 | 44.6±4.2 |
结果表明，酶解多肽3和酶解多肽4均可以显著抑制肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤的生长，但酶解多肽3的抑瘤效果显著更优，接近于阳性药顺铂的抑制效果。
实施例4肺腺癌A549细胞对酶解多肽的耐药性研究
1、耐药细胞株A549/DDP细胞的建立
当A549细胞处于对数生长期且已铺满瓶底80％以上时，弃去原来培养液，加入含顺铂培养液(终浓度30μg/mL)，培养1h后弃去含顺铂培养基，更换为新鲜配制的含10％小牛血清的RPMI-1640培养基，置于CO2培养箱中继续培养。观察细胞生长状态，拍照。待细胞长满瓶时，用0.25％胰酶消化传代。再长满瓶底时再用同样浓度同样方法冲击，再培养并观察细胞生长状态，拍照，再传代。如此，体外连续培养、冲击、传代，并进行抗药性检测。
2、耐药细胞株A549/酶解多肽3细胞的建立
当A549细胞处于对数生长期且已铺满瓶底80％以上时，弃去原培养液，加入含酶解多肽3培养液(终浓度30μg/mL)，培养1h后弃去含酶解多肽3培养基，换为新鲜配制的含10％小牛血清的RPMI-1640培养基，置CO2培养箱继续培养。观察细胞生长状态，拍照。待细胞长满瓶时，用0.25％胰酶消化传代。再长满瓶底时用同样浓度同样方法冲击，再培养并观察细胞生长状态，拍照，再传代。如此，体外连续培养、冲击、传代，并进行抗药性检测。
3、耐药细胞株A549/酶解多肽4细胞的建立
当A549细胞处于对数生长期且已铺满瓶底80％以上时，弃去原培养液，加入含酶解多肽4培养液(终浓度30μg/mL)，培养1h后弃去含酶解多肽4培养基，换为新鲜配制的含10％小牛血清的RPMI-1640培养基，置CO2培养箱继续培养。观察细胞生长状态，拍照。待细胞长满瓶时，用0.25％胰酶消化传代。再长满瓶底时用同样浓度同样方法冲击，再培养并观察细胞生长状态，拍照，再传代。如此，体外连续培养、冲击、传代，并进行抗药性检测。
4、MTT法检测各耐药细胞株抗药性
取对数生长期的A549细胞，用胰酶消化后稀释成2×104/mL，按每孔100μL接种于96孔培养板中；以空白培养液为对照。静置培养24h后，移弃各孔中的旧培养液。向实验组各孔中分别加入100μL含不同浓度酶解多肽3、酶解多肽4和顺铂的培养液，每组6孔。酶解多肽作用48h后，直接向各组每孔中分别加入20μL MTT(浓度为5mg/mL)，继续培养4h后小心弃去上清。然后，每孔加入100μL DMSO，振荡15min，570nm测定光吸收值。根据公式：细胞抑制率＝1-[(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)]×100％计算酶解多肽3、酶解多肽4和顺铂对A549细胞抑制率，实验重复3次。所有数据均用Origin 9.0软件处理，IC50采用软件中非线性拟合计算。结果如表5和图4：
表5大剂量药物反复冲击15次后耐药细胞株的IC50
| 酶解多肽3 | 酶解多肽4 | 顺铂 | |
| IC50值(μg/mL) | 8.45 | 98.53 | 27.85 |
通过表3和表5比较可知，肺腺癌A549细胞容易对顺铂产生耐药性，而对酶解多肽3和酶解多肽4不易产生耐药性。
实施例5酶解多肽的安全性评价
取昆明种小鼠，体重25-31g，随机分组，采用尾静脉注射和不注射酶解多肽进行毒性对比实验研究。结果表明，酶解多肽3和酶解多肽4在高达600mg/kg的剂量下连续注射45天，无任何毒副作用，心、肝、肾、肺解剖观察均无异常，并且体重均有增加。实验结果见表6。
表6酶解多肽毒性实验
上述实施例证明，本发明提供的酶解多肽可以抑制肺腺癌A549细胞增殖，促进其凋亡，对肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长具有显著的抑制作用，且肺腺癌A549细胞对酶解多肽不易产生耐药性，毒理实验研究证明酶解多肽无明显毒副作用。
Claims (2)
1.一种酶解多肽，以知了猴为原料，其特征在于，由如下方法制备：
将知了猴洗净后绞成肉糜，取10g肉糜置于50mL超纯水中，加入Protamex复合蛋白酶进行酶解，Protamex复合蛋白酶的添加量为底物肉糜重量的0.45%，酶解条件为：pH值，7.0；酶解温度，45℃；酶解时间，8小时；
酶解结束后，在85℃条件下水浴10分钟使复合蛋白酶灭活，冷却至常温；
冷却后，9000rpm离心25分钟，取上清，冷冻干燥得冻干粉；
将冻干粉用超纯水溶解，1g冻干粉对应添加10mL超纯水，然后依次用截留分子量为10000u、5000u、3000u、1000u的超滤膜对所得到的酶解多肽进行分离，收集分子量介于5000u~3000u或介于3000u~1000u之间的组分，冷冻干燥。
2.权利要求1所述的酶解多肽用于制备治疗肺腺癌的药物的用途。
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Effective date of registration: 20180712 Address after: 211198 18 Jiangning Science Park, Nanjing, Jiangsu. Applicant after: Nanjing cover Seef Pharmaceutical Technology Co. Ltd. Address before: 210008 room 322, F7 9, Weir Road, Xianlin University Town, Qixia District, Nanjing, Jiangsu. Applicant before: Nanjing jiushoutang Medical Technology Co Ltd |
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Effective date of registration: 20190107 Address after: 230000 4th Floor, Building C6, Science and Technology Industrial Park, 168 Xiangzhang Avenue, Hefei High-tech Zone, Anhui Province Applicant after: Emmer Biotechnology (Hefei) Co., Ltd. Address before: 211198 18 Jiangning Science Park, Nanjing, Jiangsu. Applicant before: Nanjing cover Seef Pharmaceutical Technology Co. Ltd. |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Effective date of registration: 20220525 Address after: Unit B04, building 17, No. 122, Yong'an Road, Hushuguan Town, high tech Zone, Suzhou, Jiangsu 215151 Patentee after: Suzhou modiff Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 230000 4th Floor, Building C6, Science and Technology Industrial Park, 168 Xiangzhang Avenue, Hefei High-tech Zone, Anhui Province Patentee before: Emmer Biotechnology (Hefei) Co.,Ltd. |
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