CN108977492B - 一种酶解肽及在抗前列腺癌方面的应用 - Google Patents

一种酶解肽及在抗前列腺癌方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶解肽及在抗前列腺癌方面的应用。前列腺癌是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率随年龄而增长。近年来，我国的前列腺癌发病率有所增加，迫切需要开发相应的抗癌药物。本发明提供的分子量范围为1000u～3000u或5000u～7000u的檀香种子复合蛋白酶酶解肽具有优异的抗前列腺癌活性，分子量范围为1000～3000、3000～5000或7000～10000的檀香种子木瓜蛋白酶酶解肽具有优异的抗前列腺癌活性。

Description

一种酶解肽及在抗前列腺癌方面的应用
技术领域
本发明属于化学医药领域，涉及一种酶解肽及在抗前列腺癌方面的应用。
背景技术
前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，占全球癌症发病第5位。据WHO全球肿瘤流行病统计数据(GLOBOCAN 2008)显示，2008年前列腺癌居全球男性恶性肿瘤发病率第2位(仅次于肺癌)，占男性全部癌症发病例数的14％。前列腺癌的发病率在世界范围内的分布具有显著性差异，发病最高地区约为发病最低地区的25倍。在发展中国家，前列腺癌的年龄标化发病率为12.0/10万，0～74岁男性发病累积率为1.4％，居男性恶性肿瘤发病第6位；而在发达国家，男性前列腺癌的年龄标化发病率在62.0/10万以上，0～74岁男性发病累积率为7.8％，居男性恶性肿瘤发病第1位。
在美国，前列腺癌发病率居所有男性恶性肿瘤的第1位，约占所有男性恶性肿瘤发病的29％。2004年至2008年间，在美国根据年龄调整的男性前列腺癌发病率为152.9/10万。1995年至2001年间美国男性前列腺癌发病率年均增长2％，而此后发病率呈逐年下降趋势，2001年至2008年美国前列腺癌发病率每年降低1.9％。中国是前列腺癌发病及死亡较低的国家之一，但我国前列腺癌的发病率在近年来呈现持续快速增长趋势。以近10年的年均增加比例(12.07％)推算，估计2012年中国男性前列腺癌发病率将达到17.35/10万，超过膀胱癌，成为中国男性泌尿生殖系统发病率最高的肿瘤。前列腺癌正成为严重影响我国男性健康的泌尿系恶性肿瘤，应引起充分重视。我国前列腺癌发病率的快速增高可能与以下因素有关：(1)随着我国人民生活水平及医疗水平的提高，导致人口老龄化加剧，使更多的患者能够被检查出前列腺癌；(2)生活方式及饮食结构逐渐西方化，导致前列腺癌的发病率发生实质性的增高；(3)随着我国前列腺癌诊治水平的提高，特别是前列腺特异性抗原筛查的广泛应用，许多以前不能被发现的前列腺癌已能够被早期诊断。
由此可见，迫切需要开发相应的抗前列腺癌药物。
发明内容
本发明旨在提供一种酶解肽及在抗前列腺癌方面的应用。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种酶解肽，通过如下步骤制成：
S1、檀香种子蛋白的提取
将去皮的檀香种子粉碎，称取适量粉末，加入双蒸水，用NaOH溶液调节pH 8.5，置于40℃水浴中搅拌4h，用纱布过滤，滤去不溶杂质得到澄清溶液；用HCl溶液调整pH值至等点电处，室温静置，离心，弃上清得到乳白色蛋白质沉淀，用蒸馏水轻轻漂洗沉淀，备用；
S2、檀香种子蛋白的酶解
将乳白色蛋白质沉淀置于蒸馏水中悬浮直至溶解，加入Protamex复合蛋白酶进行酶解，Protamex复合蛋白酶的添加量为450U/g底物，酶解条件为：pH值，7.0；酶解温度，45℃；酶解时间，6小时；酶解结束后，加热使复合蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，离心，取上清，冷冻干燥得冻干粉；
S3、酶解肽的分离纯化
将冻干粉用蒸馏水溶解，然后依次用截留分子量为7000u、5000u的超滤膜对所得到的酶解肽进行分离，将超滤所得5000u～7000u组分冷冻干燥即得。
优选地，步骤S1中粉碎成50～60目粉末。
优选地，步骤S1每40g粉末加入600ml双蒸水。
优选地，步骤S1等电点为4.2。
优选地，步骤S1离心条件为4000r/min×15min。
优选地，步骤S2按0.05mg/mL的浓度将乳白色蛋白质沉淀置于蒸馏水中悬浮直至溶解。
优选地，步骤S2在85℃条件下水浴10分钟使蛋白酶灭活。
优选地，步骤S2离心条件为9000r/min×25min。
优选地，步骤S3中1g冻干粉加25mL蒸馏水。
上述酶解肽用于制备抗前列腺癌药物的用途。
一种酶解肽，通过如下步骤制成：
S1、檀香种子蛋白的提取
将去皮的檀香种子粉碎，称取适量粉末，加入双蒸水，用NaOH溶液调节pH 8.5，置于40℃水浴中搅拌4h，用纱布过滤，滤去不溶杂质得到澄清溶液；用HCl溶液调整pH值至等点电处，室温静置，离心，弃上清得到乳白色蛋白质沉淀，用蒸馏水轻轻漂洗沉淀，备用；
S2、檀香种子蛋白的酶解
将乳白色蛋白质沉淀置于蒸馏水中悬浮直至溶解，加入Protamex复合蛋白酶进行酶解，Protamex复合蛋白酶的添加量为450U/g底物，酶解条件为：pH值，7.0；酶解温度，45℃；酶解时间，6小时；酶解结束后，加热使复合蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，离心，取上清，冷冻干燥得冻干粉；
S3、酶解肽的分离纯化
将冻干粉用蒸馏水溶解，然后依次用截留分子量为3000u、1000u的超滤膜对所得到的酶解肽进行分离，将超滤所得1000u～3000u组分冷冻干燥即得。
优选地，步骤S1中粉碎成50～60目粉末。
优选地，步骤S1每40g粉末加入600ml双蒸水。
优选地，步骤S1等电点为4.2。
优选地，步骤S1离心条件为4000r/min×15min。
优选地，步骤S2按0.05mg/mL的浓度将乳白色蛋白质沉淀置于蒸馏水中悬浮直至溶解。
优选地，步骤S2在85℃条件下水浴10分钟使蛋白酶灭活。
优选地，步骤S2离心条件为9000r/min×25min。
优选地，步骤S3中1g冻干粉加25mL蒸馏水。
上述酶解肽用于制备抗前列腺癌药物的用途。
一种酶解肽，通过如下步骤制成：
S1、檀香种子蛋白的提取
将去皮的檀香种子粉碎，称取适量粉末，加入双蒸水，用NaOH溶液调节pH 8.5，置于40℃水浴中搅拌4h，用纱布过滤，滤去不溶杂质得到澄清溶液；用HCl溶液调整pH值至等点电处，室温静置，离心，弃上清得到乳白色蛋白质沉淀，用蒸馏水轻轻漂洗沉淀，备用；
S2、檀香种子蛋白的酶解
将乳白色蛋白质沉淀置于蒸馏水中悬浮直至溶解，加入木瓜蛋白酶进行酶解，木瓜蛋白酶的添加量为420U/g底物，酶解条件为：pH值，7.0；酶解温度，42℃；酶解时间，8小时；酶解结束后，加热使蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，离心，取上清，冷冻干燥得冻干粉；
S3、酶解肽的分离纯化
将冻干粉用蒸馏水溶解，然后依次用截留分子量为10000u、7000u的超滤膜对所得到的酶解肽进行分离，将超滤所得7000u～10000u组分冷冻干燥即得。
优选地，步骤S1中粉碎成50～60目粉末。
优选地，步骤S1每40g粉末加入600ml双蒸水。
优选地，步骤S1等电点为4.2。
优选地，步骤S1离心条件为4000r/min×15min。
优选地，步骤S2按0.05mg/mL的浓度将乳白色蛋白质沉淀置于蒸馏水中悬浮直至溶解。
优选地，步骤S2在85℃条件下水浴10分钟使蛋白酶灭活。
优选地，步骤S2离心条件为9000r/min×25min。
优选地，步骤S3中1g冻干粉加25mL蒸馏水。
上述酶解肽用于制备抗前列腺癌药物的用途。
一种酶解肽，通过如下步骤制成：
S1、檀香种子蛋白的提取
将去皮的檀香种子粉碎，称取适量粉末，加入双蒸水，用NaOH溶液调节pH 8.5，置于40℃水浴中搅拌4h，用纱布过滤，滤去不溶杂质得到澄清溶液；用HCl溶液调整pH值至等点电处，室温静置，离心，弃上清得到乳白色蛋白质沉淀，用蒸馏水轻轻漂洗沉淀，备用；
S2、檀香种子蛋白的酶解
将乳白色蛋白质沉淀置于蒸馏水中悬浮直至溶解，加入木瓜蛋白酶进行酶解，木瓜蛋白酶的添加量为420U/g底物，酶解条件为：pH值，7.0；酶解温度，42℃；酶解时间，8小时；酶解结束后，加热使蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，离心，取上清，冷冻干燥得冻干粉；
S3、酶解肽的分离纯化
将冻干粉用蒸馏水溶解，然后依次用截留分子量为5000u、3000u的超滤膜对所得到的酶解肽进行分离，将超滤所得3000u～5000u组分冷冻干燥即得。
优选地，步骤S1中粉碎成50～60目粉末。
优选地，步骤S1每40g粉末加入600ml双蒸水。
优选地，步骤S1等电点为4.2。
优选地，步骤S1离心条件为4000r/min×15min。
优选地，步骤S2按0.05mg/mL的浓度将乳白色蛋白质沉淀置于蒸馏水中悬浮直至溶解。
优选地，步骤S2在85℃条件下水浴10分钟使蛋白酶灭活。
优选地，步骤S2离心条件为9000r/min×25min。
优选地，步骤S3中1g冻干粉加25mL蒸馏水。
上述酶解肽用于制备抗前列腺癌药物的用途。
一种酶解肽，通过如下步骤制成：
S1、檀香种子蛋白的提取
将去皮的檀香种子粉碎，称取适量粉末，加入双蒸水，用NaOH溶液调节pH 8.5，置于40℃水浴中搅拌4h，用纱布过滤，滤去不溶杂质得到澄清溶液；用HCl溶液调整pH值至等点电处，室温静置，离心，弃上清得到乳白色蛋白质沉淀，用蒸馏水轻轻漂洗沉淀，备用；
S2、檀香种子蛋白的酶解
将乳白色蛋白质沉淀置于蒸馏水中悬浮直至溶解，加入木瓜蛋白酶进行酶解，木瓜蛋白酶的添加量为420U/g底物，酶解条件为：pH值，7.0；酶解温度，42℃；酶解时间，8小时；酶解结束后，加热使蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，离心，取上清，冷冻干燥得冻干粉；
S3、酶解肽的分离纯化
将冻干粉用蒸馏水溶解，然后依次用截留分子量为3000u、1000u的超滤膜对所得到的酶解肽进行分离，将超滤所得1000u～3000u组分冷冻干燥即得。
优选地，步骤S1中粉碎成50～60目粉末。
优选地，步骤S1每40g粉末加入600ml双蒸水。
优选地，步骤S1等电点为4.2。
优选地，步骤S1离心条件为4000r/min×15min。
优选地，步骤S2按0.05mg/mL的浓度将乳白色蛋白质沉淀置于蒸馏水中悬浮直至溶解。
优选地，步骤S2在85℃条件下水浴10分钟使蛋白酶灭活。
优选地，步骤S2离心条件为9000r/min×25min。
优选地，步骤S3中1g冻干粉加25mL蒸馏水。
上述酶解肽用于制备抗前列腺癌药物的用途。
有益效果：
本发明提供的分子量范围为1000u～3000u或5000u～7000u的檀香种子复合蛋白酶酶解肽具有优异的抗前列腺癌活性，本发明提供的分子量范围为1000～3000、3000～5000或7000～10000的檀香种子木瓜蛋白酶酶解肽具有优异的抗前列腺癌活性。
附图说明
图1为各酶解肽抗前列腺癌活性的IC50值。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：Protamex复合蛋白酶酶解肽
一、实验材料
檀香(Santalum album L.)种子采自5年生檀香林内，采集后用人工的方法去掉其种皮，然后在常温、通风、无日光直晒的环境下阴干。
Protamex复合蛋白酶(食用级)购自丹麦诺维信(NOVO)公司。
二、实验方法和结果
1、檀香种子蛋白的提取
将去皮的檀香种子粉碎成50～60目粉末，称取40g，加入600ml双蒸水，用1mol/LNaOH溶液调节其pH 8.5，置于40℃水浴中搅拌4h，用纱布过滤，滤去不溶杂质得到澄清溶液；用1mol/LHCl调整pH值至等点电处(pI＝4.2)，室温静置30min，离心(4000r/min×15min)，弃上清得到乳白色蛋白质沉淀，用蒸馏水轻轻漂洗蛋白质沉淀三次，备用。
2、檀香种子蛋白的酶解
按照0.05mg/mL的浓度将乳白色蛋白质沉淀置于蒸馏水中悬浮直至溶解，加入Protamex复合蛋白酶进行酶解，Protamex复合蛋白酶的添加量为450U/g底物，酶解条件为：pH值，7.0；酶解温度，45℃；酶解时间，6小时；酶解结束后，在85℃条件下水浴10分钟使复合蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，9000rpm离心25分钟，取上清，冷冻干燥得冻干粉。
3、酶解肽的分离纯化
将冻干粉用蒸馏水溶解，1g冻干粉加25mL蒸馏水，然后依次用截留分子量为10000u、7000u、5000u、3000u以及1000u的超滤膜对所得到的酶解肽进行分离，将超滤所得组分冷冻干燥(含水量≤5％)即得不同分子量大小的酶解肽，具体为：
檀香种子复合蛋白酶1000u～3000u酶解肽；
檀香种子复合蛋白酶3000u～5000u酶解肽；
檀香种子复合蛋白酶5000u～7000u酶解肽；
檀香种子复合蛋白酶7000u～10000u酶解肽。
实施例2：木瓜蛋白酶酶解肽
一、实验材料
檀香(Santalum album L.)种子采自5年生檀香林内，采集后用人工的方法去掉其种皮，然后在常温、通风、无日光直晒的环境下阴干。
木瓜蛋白酶(50×104U/g)购自美国Sigma公司。
二、实验方法和结果
1、檀香种子蛋白的提取
将去皮的檀香种子粉碎成50～60目粉末，称取40g，加入600ml双蒸水，用1mol/LNaOH溶液调节其pH 8.5，置于40℃水浴中搅拌4h，用纱布过滤，滤去不溶杂质得到澄清溶液；用1mol/LHCl调整pH值至等点电处(pI＝4.2)，室温静置30min，离心(4000r/min×15min)，弃上清得到乳白色蛋白质沉淀，用蒸馏水轻轻漂洗蛋白质沉淀三次，备用。
2、檀香种子蛋白的酶解
按照0.05mg/mL的浓度将乳白色蛋白质沉淀置于蒸馏水中悬浮直至溶解，加入木瓜蛋白酶进行酶解，木瓜蛋白酶的添加量为420U/g底物，酶解条件为：pH值，7.0；酶解温度，42℃；酶解时间，8小时；酶解结束后，在85℃条件下水浴10分钟使木瓜蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，9000rpm离心25分钟，取上清，冷冻干燥得冻干粉。
3、酶解肽的分离纯化
将冻干粉用蒸馏水溶解，1g冻干粉加25mL蒸馏水，然后依次用截留分子量为10000u、7000u、5000u、3000u以及1000u的超滤膜对所得到的酶解肽进行分离，将超滤所得组分冷冻干燥(含水量≤5％)即得不同分子量大小的酶解肽，具体为：
檀香种子木瓜蛋白酶1000u～3000u酶解肽；
檀香种子木瓜蛋白酶3000u～5000u酶解肽；
檀香种子木瓜蛋白酶5000u～7000u酶解肽；
檀香种子木瓜蛋白酶7000u～10000u酶解肽。
实施例3：抗前列腺癌作用
一、实验材料
前列腺癌PC-3细胞购自ATCC。MTT实验所需试剂购自南京建成生物。
檀香种子复合蛋白酶1000u～3000u酶解肽、檀香种子复合蛋白酶3000u～5000u酶解肽、檀香种子复合蛋白酶5000u～7000u酶解肽、檀香种子复合蛋白酶7000u～10000u酶解肽按照实施例1方法制备，4℃保存备用。
檀香种子木瓜蛋白酶1000u～3000u酶解肽、檀香种子木瓜蛋白酶3000u～5000u酶解肽、檀香种子木瓜蛋白酶5000u～7000u酶解肽、檀香种子木瓜蛋白酶7000u～10000u酶解肽按照实施例2方法制备，4℃保存备用。
二、实验方法
MTT法检测药物对前列腺癌PC-3细胞增殖的抑制作用：
将处于对数期的PC-3细胞培养于96孔板中，接种密度为104个/孔，待细胞完全贴壁生长后，加入不同终浓度的酶解肽，同时设置对照组，各组设6个复孔，培养24h。弃旧培养液，每孔加入5mg/mL的MTT溶液5μL，继续37℃孵育4h，弃上清，每孔加入100μLDMSO，充分振荡，于570nm测定吸光度值，按照如下公式计算抑制率：
抑制率(％)＝[1－(药物组吸光度值/对照组吸光度值)]×100％。
采用LOGIT法计算IC50。
三、实验结果
实验结果如表1和图1所示。檀香种子采用不同酶制备得到的不同分子量范围的酶解肽具有不同的抗前列腺癌活性，其中：檀香种子复合蛋白酶3000u～5000u酶解肽、檀香种子复合蛋白酶7000u～10000u酶解肽、檀香种子木瓜蛋白酶5000u～7000u酶解肽抗前列腺癌作用不明显，其他5种酶解肽均具有较强的抗前列腺癌活性。
表1各酶解肽抗前列腺癌活性的IC50值
酶解肽 IC50值(μg/mL)
复合蛋白酶1000u～3000u酶解肽(复合1000～3000) 9.52
复合蛋白酶3000u～5000u酶解肽(复合3000～5000) ＞100
复合蛋白酶5000u～7000u酶解肽(复合5000～7000) 8.78
复合蛋白酶7000u～10000u酶解肽(复合7000～10000) ＞100
木瓜蛋白酶1000u～3000u酶解肽(木瓜1000～3000) 11.45
木瓜蛋白酶3000u～5000u酶解肽(木瓜3000～5000) 8.63
木瓜蛋白酶5000u～7000u酶解肽(木瓜5000～7000) ＞100
木瓜蛋白酶7000u～10000u酶解肽(木瓜7000～10000) 10.17
综上可见，本发明提供的分子量范围为1000u～3000u或5000u～7000u的檀香种子复合蛋白酶酶解肽具有优异的抗前列腺癌活性，本发明提供的分子量范围为1000～3000、3000～5000或7000～10000的檀香种子木瓜蛋白酶酶解肽具有优异的抗前列腺癌活性。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (1)

1.一种酶解肽用于制备抗前列腺癌药物的用途，该酶解肽通过如下步骤制成：
S1、檀香种子蛋白的提取
将去皮的檀香种子粉碎，称取适量粉末，加入双蒸水，用NaOH溶液调节pH 8.5，置于40℃水浴中搅拌4h，用纱布过滤，滤去不溶杂质得到澄清溶液；用HCl溶液调整pH值至等点电处，室温静置，离心，弃上清得到乳白色蛋白质沉淀，用蒸馏水轻轻漂洗沉淀，备用；
S2、檀香种子蛋白的酶解
将乳白色蛋白质沉淀置于蒸馏水中悬浮直至溶解，加入木瓜蛋白酶进行酶解，木瓜蛋白酶的添加量为420U/g底物，酶解条件为：pH值，7.0；酶解温度，42℃；酶解时间，8小时；酶解结束后，加热使蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，离心，取上清，冷冻干燥得冻干粉；
S3、酶解肽的分离纯化
将冻干粉用蒸馏水溶解，然后依次用截留分子量为10000u、7000u的超滤膜对所得到的酶解肽进行分离，将超滤所得7000u~10000u组分冷冻干燥即得；
其中：步骤S1中，粉碎成50~60目粉末，每40g粉末加入600ml双蒸水，等电点为4.2，离心条件为4000r/min×15min；步骤S2中，按照0.05mg/mL的浓度将乳白色蛋白质沉淀置于蒸馏水中悬浮直至溶解，在85℃条件下水浴10分钟使蛋白酶灭活，离心条件为9000r/min×25min；步骤S3中，1g冻干粉加25mL蒸馏水。
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