TWI643627B - 冬蟲夏草菌絲體萃取物抗發炎之用途及其製法 - Google Patents

Abstract

本發明利用冬蟲夏草菌(Ophiocordyceps sinensis；無性世代為Hirsutella sinensis)新分離株H101以二階式浮面液態培養-全氟化碳氧載體複合技術(TSF-PT)生產具富含生物活性成分組合之發酵萃取物之抗發炎活性，並揭示其產製方法。

Description

冬蟲夏草菌絲體萃取物抗發炎之用途及其製法

本發明所屬之技術領域為藥用菌類發酵培養，更特定而言，係關於以冬蟲夏草菌新分離株H101菌絲體液態發酵技術生產富含生物活性成分組合製備物萃取物之抗發炎用途及製備方法。

於「中華民國專利資訊檢索系統」以「冬蟲夏草」為關鍵詞查詢，與本發明較近似之專利僅有1筆。該發明專利-I379002「用於培養冬蟲夏草的培養基、冬蟲夏草人工培育方法及冬蟲夏草產物」係澱粉、椰子水、蛋白腖、大骨湯及蔗糖為培養冬蟲夏草的培養基，其培養生長時間長達三個月，其腺苷(adenosine)含量僅136.48ppm，蟲草酸含量亦僅1.47%。在中國大陸雖有較多筆與冬蟲夏草液態培養有關之發明專利，其差異主要在於培養基成分配方，然多數並未分析其生物活性成分，例如多醣體、腺苷或甘露醇等，或其所生成之生物活性成分含量偏低，若為低溫培養時，其培養週期亦較長。且多數技術並無明確實驗證據證實其生物活性，特別是菌絲體萃取物之抗發炎用途。

以下簡要描述相關專利。

中國發明專利CN 103483040 B「冬蟲夏草規模化液體深層發酵用培養基及其發酵生產方法」係以葡萄糖或蔗糖或麥芽糖、酵母膏或牛肉膏或蛋 白腖、硫酸、磷酸二氫鉀及複合維生素為培養基，最終發酵罐體積達到5噸之發酵工藝。

中國發明專利CN 102972747 B「冬蟲夏草的深層發酵工藝」係以含大麥芽、大豆之液體培養基，通氣或厭氧培養後，獲得發酵的冬蟲夏草菌絲體以及冬蟲夏草菌發酵液，從而得到冬蟲夏草保健產品。

中國發明專利CN 1036531B「冬蟲夏草規模化液體深層發酵用培養基及其發酵生產方法」係以麩皮、奶粉、蠶蛹粉汁、酵母粉、維生素、硫酸鎂及磷酸二氫鉀為培養基之冬蟲夏草深層發酵工藝技術。

中國發明專利CN 104350949 B「冬蟲夏草液態發酵工藝」係以含葡萄糖、蛋白腖、硫酸鎂及磷酸二氫鉀為培養基之冬蟲夏草液態發酵工藝。

中國發明專利CN 104522812 B「一種冬蟲夏草活菌飲料及其生產方法」係以含黃豆、奶粉、葡萄糖或蔗糖及生薑之培養基生產冬蟲夏草活菌飲料。

中國發明專利CN 101134940 B「一種中國冬蟲夏草真菌-蝙蝠蛾被毛孢的發酵生產方法」係以一種中國冬蟲夏草真菌-蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutella hepialid)的發酵生產方法。

中國發明專利CN 103483040 B「冬蟲夏草規模化液體深層發酵用培養基及其發酵生產方法」係以玉米粉、葡萄糖粉、蛋白腖、蠶蛹粉、蛋白腖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、酵母浸出汁及牛肉膏之冬蟲夏草規模化液體深層發酵生產方法。

中國發明專利CN 104145719 B「一種冬蟲夏草菌菌絲體發酵生產方法」係以從子實體中分離出優選的中華被毛孢菌種，以玉米渣、黃豆粉、小 麥粒、穀粒、高粱粒、蠶蛹粉或粉碎的全雞蛋、牛肉腖及生長素混合過濾得濾液為培養基，提供一種冬蟲夏草菌菌絲體發酵生產方法。

中國發明專利CN 103392513 B「冬蟲夏草菌絲體發酵物及其應用」係以含蝙蝠蛾幼蟲打漿或乾品蝙蝠蛾幼蟲粉之培養基培養冬蟲夏草菌絲體，製備增強免疫力和抗疲勞產品。

冬蟲夏草主要活性成分包括胞外多醣體、胞內多醣體、腺苷及甘露醇，三萜類、類黃酮及總酚亦為習知具有多種生物活性之化合物。因菌株品系、培養基組成、培養方式及條件與製備方法，其生物活性成分組合物含量與活性具有顯著差異。過去雖已發展出冬蟲夏草菌菌絲體液態培養技術，然其生物活性成分組合物含量並不明確或偏低。冬蟲夏草菌因基因多樣性及菌株差異可顯著影響液態培養菌絲體及其所含生物活性成分，本發明係利用發明人徐泰浩分離自冬蟲夏草野生藥材之新菌株[經財團法人食品工業發展研究所鑑定為「冬蟲夏草菌Ophiocordyceps sinensis之菌絲體(無性世代為Hirsutella sinensis)」，菌株品系代號H101(報告書號碼：2014AG014)，並已專利寄存於該所(寄存證明書編號：FP20130067；BCRC930166)]，利用二階式浮面液態培養結合全氟碳化物氧氣載體之新穎技術，以生產具抗發炎用途之冬蟲夏草新菌株H101之菌絲體發酵萃取物。

本發明專利新穎性在於冬蟲夏草菌株係發明人分離自冬蟲夏草野生藥材之新菌株，經財團法人食品工業發展研究所鑑定為「冬蟲夏草菌Ophiocordyceps sinensis之菌絲體(無性世代為Hirsutella sinensis)」，菌株品系代號H101(報告書號碼：2014AG014)，並已專利寄存於該所(寄存證明書編 號：FP20130067；BCRC930166)。習知同種微生物之菌株差異，可顯著影響其生長與代謝之表現。本發明之新穎性除採用分離自冬蟲夏草野生藥材新菌株外，並以溶劑萃取分離出富含多種生物活性成分新穎組合且具抗發炎用途之冬蟲夏草菌絲體萃取物。

本發明之進步性在於可在較短時間生產具抗發炎活性之冬蟲夏草菌絲體多種生物活性成分新穎組合，可顯著降低汙染之風險及降低生產成本，並提高多種生物活性成分組合物於萃取物之含量。此外，確認萃取物中生物活性成分之新穎組合，可進一步提升冬蟲夏草菌絲體液態發酵製備物之用於抗發炎之附加價值。

本發明之進步性在於具抗發炎活性之冬蟲夏草菌絲體可應用為改善慢性發炎關聯性疾病為功能訴求之日常生活保健食品，其生物活性成分具有進一步開發為預防或治療如阿茲海默病、帕金森氏病、心臟血管疾病、高血壓、肥胖、糖尿病、過敏性、癌症或類風濕性關節炎等之醫藥品或療養品之原料。

「冬蟲夏草」在一般人的認識上是一種由真菌所形成之中藥材，其內部由許多之菌絲體所組成。其實冬蟲夏草也是一種「藏藥」，在西藏被稱為「Yarsa Gumba」。市面上許多冬蟲夏草保健食品，則是以發酵技術大量生產之菌絲體。過去不論文獻或網路資料多把「冬蟲夏草藥材」與「冬蟲夏草菌」混為一談，「冬蟲夏草」與「蟲草」也被視為同一概念，然而形成「冬蟲夏草藥材」之菌株Ophiocordyceps sinensis，事實上並非屬於冬蟲夏草屬(Cordyceps)中之菌類。

2013年1月由行政院衛生署中醫藥委員會出版之「台灣中藥典(第二版)」中對於冬蟲夏草之說明為「冬蟲夏草為麥角菌科(Clavicipitaceae)真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和蟲體之複合體」。冬蟲夏草藥材」與「冬蟲夏草菌」其實並不等同，藥材是在自然界由「冬蟲夏草菌」感染蝙蝠蛾科幼蟲所形成，蟲體中充滿許多由菌絲體所組成之結構體(真菌學上稱為「菌核(sclerotium)」，蟲體內之組織臟器已完全不存在，只是維持幼蟲軀殼之外觀；子座(也被稱為「子實體」)其實也是由菌絲體分化形成。「冬蟲夏草菌」則是一種(或一類)真菌類微生物，其能在無寄主之情況下，以人工方式利用液態或固態培養基讓菌絲體大量生長複製。目前市面上許多以保健食品形式銷售之「冬蟲夏草」，幾乎都是以菌絲體為主。「冬蟲夏草」廣義上可能指「冬蟲夏草藥材」、「冬蟲夏草菌絲體」或是屬於蟲草屬中之不同物種。「冬蟲夏草」可以簡稱為「蟲草」，然而「蟲草」未必是「冬蟲夏草藥材」。

2007年韓國學者Sung等人就蟲草菌類及麥角菌類真菌之種系發生以基因親緣為基礎，重新歸類過去所認知之冬蟲夏草菌C.sinensis，C.sinensis並非屬於蟲草屬中之一員，將其歸於Ophiocordyceps(蛇蟲草菌屬)，Ophiocordyceps屬於Ophiocordycipitaceae(蛇蟲草菌科)中之一員，在拉丁學名命名規範下，冬蟲夏草菌之新學名為Ophiocordyceps sinensis[Sung,G.H.,Hywel-Jones,N.L.,Sung,J.M.,Luangsa-ard,J.J.,Shrestha,B.,& Spatafora,J.W.(2007).Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi.Studies in Mycology,57,5-59.]，目前已普遍在學術界使用。此外，蟲草屬也已不屬於麥角菌科，其分類地位屬於Cordycipitaceae(蟲草菌科)。

在過去冬蟲夏草無性世代的鑑定一直是個爭論的議題，中華被毛孢(Hirsutella sinensis；或稱中國被毛孢)過去被認知為冬蟲夏草的無性世代，並列示於政府公告-「冬蟲夏草菌絲體食品標示相關規定」中。2012年2月9日衛生署以「署授食字第1001303885號」號公告「冬蟲夏草菌絲體食品標示相關規定」中說明「冬蟲夏草菌(Cordyceps sinensis)之無性世代為中華被毛孢」，並規定食品品名標示為「冬蟲夏草菌絲體」時，其使用之菌株須為中華被毛孢(Hirsutella sinensis)或分離自冬蟲夏草之蟲草相關菌株。

2011年6月於澳洲墨爾本舉行之國際植物學會議(International Botanical Congress)修正「國際藻類、真菌及植物命名法規(International Code of Nomenclature for algae,fungi,and plants)」(McNeill1,J.,& Turland,N.J.,2011.Major changes to the Code of Nomenclature-Melbourne,July 2011.Taxon 60,1495-1497.)，確認「一真菌，一學名(one fungus,one name)」規範，並自2013年1月1日施行，一種真菌只能有一種學名，並終止無性世代物種學名之使用[Hawksworth,D.L.,2011.A new dawn for the naming of fungi：impacts of decisions made in Melbourne in July 2011 on the future publication and regulation of fungal names.MycoKeys 1：7-20.]。換言之，中華被毛孢學名(H.sinensis)在科學上是被終止使用之物種學名。

早在1694年汪昂的「本草備要」即載述：「冬蟲夏草，甘平，保肺益腎，止血化痰，止勞咳」，另「本草二經」亦記載：「冬蟲夏草入肺腎二經」。冬蟲夏草具有免疫調節作用，可作為生物調節劑(biological modulators)。過去文獻研究發現以冬蟲夏草習用學名「Cordyceps sinensis」或「Ophiocordyceps sinensis」所發表有關物種生物活性高達33種，包括(1)免疫調節、(2)免疫壓抑、(3)抗補體、(4)抗腫瘤、(5)抗氧化、(6)抗細菌、(7)保肝、 (8)益腎、(9)抗糖尿病、(10)降膽固醇、(12)抗動脈硬化、(13)抗血栓、(14)降血壓與擴張血管、(15)益肺、(16)光害保護、(17)抗憂鬱、(18)抗骨質疏鬆、(19)抗腦缺血、(20)腸胃道傷害預防與治療、(21)增加耐力、(22)抗疲勞、(23)抗氣喘、(24)學習力與記憶力改善、(25)促進類固醇合成、(26)促進紅血球生成、(27)抗心律不整、(28)抗衰老、(29)預防移植排斥、(30)緩和紅斑性狼瘡、(31)促進雄性激素、(32)鎮靜及(33)藥物佐劑，這些生物活性可能源自於冬蟲夏草藥材、子實體、發酵蟲草菌絲體或其他蟲草製備物[Lo,H.C.,Hsieh,C.Y.,Lin,F.Y.,& Hsu,T.H.(2013).A systematic review of the mysterious caterpillar fungus Ophiocordyceps sinensis in DongChongXiaCao and related bioactive ingredients.Journal of Traditional and Complementary Medicine,3(1),16-32]。

野生的冬蟲夏草藥材近來因為氣候環境劇變和嚴重的人為破壞，產量逐年下降，已有瀕臨絕種之危機。目前野生冬蟲夏草已被中國列為「國家二級保護生物」，並頒布法規禁止濫採。由於天然的冬蟲夏草藥材非常的稀有且昂貴，因此開發出培養菌絲體的方式用來取代天然的冬蟲夏草可適當替代市場需求，並減緩天然野生冬蟲夏草資源可能瀕臨絕種之危機。利用人工發酵冬蟲夏草菌來獲得與天然冬蟲夏草化學組成成分以及藥理作用基本相同的菌絲體，成為當下解決蟲草資源短缺的一種最可行的方法[吳玲芳等(2014)."冬蟲夏草液體發酵培養的研究進展.發酵科技通訊43(4)：25-29]。

過去已有許多研究發現，液態培養的冬蟲夏草菌絲體(中華被毛孢)也具有與天然冬蟲夏草相似的生物活性成分或生物活性[陸幼蘭(2003).冬蟲夏草菌絲體的深層培養.廣州食品工業科技19(4)：12-15.；童應凱及任靜(1997). 蟲草菌絲體與天然冬蟲夏草成分的比較.食品研究與開發18(4)：40-42.；吳練中等(1984).冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體化學成分的比較.廣西中醫藥2：45-47；高俊德等(1981).冬蟲夏草菌絲分離培養及其與生藥冬蟲夏草化學成份的對比.中國中藥雜誌1：3-6]。

然不同冬蟲夏草菌株發酵的菌絲體中主要生物活性成分腺苷和粗多糖的含量存在差異[吳迎春等.(2010).不同菌種/菌株發酵蟲草菌絲體的化學成分比較.時珍國醫國藥21(5)：1060-1061.]。人工蟲草菌絲體具有比天然蟲草更好的抗氧化活性，抗氧化活性與蟲草中含有的某些成分的含量有關[李忠紅等(2008).天然蟲草和人工蟲草菌絲體的抗氧化活性比較研究.中國醫藥導報5(16)：13-16.]。定量研究顯示不同產地天然冬蟲夏草與人工培養冬蟲夏草的含量差異較大[官東秀及馮祚臻(2004).天然和人工冬蟲夏草化學成分的定量測定方法.中國藥師7(2)：134-136.]。利用野外採集冬蟲夏草天然資源，可分離出具有高腺苷產量之菌株品系[張華(2004).無性型冬蟲夏草腺苷高產菌株及指紋圖譜的研究，上海師範大學碩士論文]。

自1998年到2011年期間國際醫學期刊資料庫PubMed有關O.sinensis為材料之152篇文獻，41篇缺乏詳細真菌材料資訊、26篇使用天然物、11篇使用人工培養子實體及80篇使用發酵產品；使用發酵產品文獻中，64篇使用不可信或不確定之品系，冬蟲夏草天然物需再鑑定，至少有116篇文獻(超過四分之三)為不可信、不確定或非明確材料，其中相當比例冬蟲夏草菌株之培養溫度為25℃，並不符合冬蟲夏草高海拔之生態環境為低溫[Dong,C.H.,& Yao,Y.J.(2011).On the reliability of fungal materials used in studies on Ophiocordyceps sinensis.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,38(8),1027-1035]。

Zhang等人(2013)年也發現冬蟲夏草菌在國際核苷酸序列資料庫(International Nucleotide Sequence Databases,INSD)一些DNA序列被錯誤註解，導致期刊論文發表推出不正確結論，397筆內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)核苷酸序列中有39筆錯誤，105筆小次單位核醣體核苷酸序列中有27筆錯誤，53筆大次單位核醣體核苷酸序列中有5筆錯誤；在蛋白質編碼序列部分，絲胺酸蛋白酶基因、交配型基因MAT1-2-1、DNA分解酶(DNA lyase)基因、兩種最大次單位RNA聚合酶II及1 α-延長因子基因(elongation factor-1 α gene)正確，然73筆有關β-微管蛋白(β-tubulin)基因中14筆未能確認[Zhang,S.,Zhang,Y.J.,Liu,X.Z.,Zhang,H.,& Liu,D.S.(2013).On the reliability of DNA sequences of Ophiocordyceps sinensis in public databases.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,40(3-4),365-378]。

冬蟲夏草菌基因多樣性與其寄主之地理分布區隔及生活史特性有密切之關連性，採集自中國大陸冬蟲夏草主要18個不同族群(產地)180隻個體中，99.3%具有基因多型性，同一族群間之個體則少有基因之變異[Liang,H.H.,Cheng,Z.,Yang,X.L.,Li,S.,Ding,Z.Q.,Zhou,T.S.,& Chen,J.K.(2008).Genetic diversity and structure of Cordyceps sinensis populations from extensive geographical regions in China as revealed by inter-simple sequence repeat markers.Journal of Microbiology,46(5),549-556.]。由遺傳分化係數與分子變異分析顯示中冬蟲夏草菌與其寄主昆蟲種系分枝(clade)具有顯著之基因多樣性，且菌與寄主之基因流動(gene flow，在族群遺傳學中指從一個種群到另一個種群的基因轉移，轉移的過程可能會經由動物種群的遷徙或是植物花粉的隨風飄散等過程完成)相當低[Quan,Q.M.,Wang,Q.X.,Zhou,X.L.,Li,S.,Yang,X.L.,Zhu,Y.G.,& Cheng,Z. (2014).Comparative phylogenetic relationships and genetic structure of the caterpillar fungus Ophiocordyceps sinensis and its host insects inferred from multiple gene sequences.Journal of Microbiology,52(2),99-105.]。冬蟲夏草分子生物學微觀研究顯示天然冬蟲夏草基因組DNA的多元異質性，含有多種真菌和多種突變基因型冬蟲夏草菌，在僵蟲體和子座中多種菌物的差異存在巨大的、非同步的動態變化；宏觀分子系統學研究顯示出在僵蟲體、子座和子囊果中分子標記多態性的高度差異及其在冬蟲夏草成熟過程中的動態變化[朱佳石及吳建勇(2015).天然冬蟲夏草多菌共存生物體分子異質性的檢驗與討論.中國細胞生物學學報37(2)：284-298]。

全氟碳化物(perfluorocarbon)是烴分子中的所有氫原子被氟原子取代而成的化合物，分脂肪族和芳香族兩類。脂肪族的全氟碳有四氟化碳、四氟乙烯、全氟環丁烷、全氟(甲基環己烷)等；芳香族的全氟碳有六氟化苯、全氟萘烷等。由於氟是電負性最大的元素，全氟碳通常具有化學穩定性、表面活性和優良的耐熱性能。全氟碳具有多種重要的用途，例如四氟乙烯的聚合物聚四氟乙烯可製作人造關節的部件，長期用於人體內；全氟環丁烷可用作食品發泡劑；六氟化苯是重要的合成中間體；全氟萘烷和全氟三丙胺的混合乳劑可作為氟碳代血液。全氟化碳基氧載體(perfluorocarbon-based oxygen carriers,PFCOCs)是利用呼吸氣體在全氟化碳(perfluorocarbons,PFCs)中具高溶解度的乳液，為可行的血液替代品[Castro,C.I.and J.C.Briceno(2010)."Perfluorocarbon-based oxygen carriers：Review of products and trials." Aitificial Organs 34(8)：622-634.]。全氟碳化物亦已被應用於促進融合瘤細胞培養過程中之氧氣轉移[Cho,M.H.and S.S.Wang(1988)."Enhancement of oxygen transfer in Hybridoma cell culture by using a perfluorocarbon as an oxygen carrier." Biotechnology Letters 10(12)：855-860.]。然過去並未被應用於藥用真菌菌絲體液態培養以促進培養液中氧氣之攜帶與傳送。

本發明所揭示為係發明人分離自冬蟲夏草野生藥材之新分離株H101[經財團法人食品工業發展研究所鑑定為「冬蟲夏草菌Ophiocordyceps sinensis之菌絲體(無性世代為Hirsutella sinensis)」(報告書號碼：2014AG014)，並已於民國103年2月5日專利寄存於該所(寄存證明書編號：FP20130067；菌株編號BCRC930166)]，利用二階式浮面液態培養-全氟化碳氧載體複合技術(TSF-PT)可顯著提高菌絲體產量及生物活性成分組合物含量，並揭示此菌絲體萃取物具有抗發炎之用途及其產製方法。

本發明係為冬蟲夏草發酵製備物對保護神經膠細胞能力的新用途，該製備物中之菌絲體95%乙醇萃取物具有抑制神經膠細胞(BV2)產生發炎相關因子一氧化氮(NO)、細胞激素(IL-1β、TNF-α及IL-6)的產生，及抑制發炎訊息傳遞蛋白(COX-2及iNOS)表現，並可提升血红素氧合酶-1(HO-1)基因之抗氧化及抗發炎標記蛋白的表現。

二階式浮面液態培養係以二種培養方式((震盪培養與靜置培養))在不同階段(前期-第1-5天，後期-第6-15天)結合多孔隙泡棉分別進行冬蟲夏草菌新分離株H101菌絲體液態培養。經處理多孔隙泡棉提供更佳菌絲體吸附生長空間，培養液中添加全氟化碳氧載體可促進培養液中氧氣之攜帶與傳送，顯著促進菌絲體及生物活性成分(胞外多醣體、胞內多醣體、腺苷、甘露醇、三萜類、總酚及類黃酮)組合物之含量。

培養基配方組成為1.00-3.00%碳源，碳源為葡萄糖或蔗糖或麥芽糖，0.50-1.50%氮源，氮源為酵母萃出物或蛋白腖，0.03-0.07%硫酸鎂，0.03-0.07% 磷酸二氫鉀、0.005-0.015%綜合維生素及0.005-0.015%全氟三丙胺、六氟苯或全氟萘烷。

將上述物料加熱至100℃，使物料溶解、混勻，置入適當大小之預先以不同濃度(0.05%-1.5%)海藻酸鈉溶液中浸泡30分鐘之聚氨酯泡棉(polyurethane foam，PU)，於121℃下0.15MPa壓力下滅菌30-50分鐘，冷卻降至室溫後即可使用。

培養條件如下：於16-21℃培養溫度區間，將5%-20%濃度種菌菌液接種於培養瓶中，先以50-150rpm震盪轉速震盪培養5天，再以靜置培養方式培養10天。

DG‧‧‧10mM D-半乳糖

FLOS‧‧‧冬蟲夏草發酵液

WEOS‧‧‧冬蟲夏草菌絲體水萃出物

EEOS-50‧‧‧冬蟲夏草菌絲體50%乙醇萃出物

EEOS-95‧‧‧冬蟲夏草菌絲體50%乙醇萃出物

第1圖繪示冬蟲夏草菌新分離株H101菌絲體以二階式浮面液態培養、一階式浮面液態培養及一般液態培養其菌絲體產量與發酵製備物之生物活性成分(胞外多醣體、胞內多醣體、腺苷、甘露醇、三萜類、總酚及類黃酮)比較。

第2圖繪示培養基中添加全氟碳化物氧載體(全氟三丙胺、六氟苯及全氟萘烷)對二階式浮面液態培養冬蟲夏草菌新分離株H101其菌絲體產量與發酵製備物之生物活性成分(胞外多醣體、胞內多醣體、腺苷、甘露醇、三萜類、總酚及類黃酮)影響。

第3圖繪示在BV2細胞添加不同濃度冬蟲夏草菌絲體95%乙醇萃出物對脂多醣誘導細胞激素之抑制率。

第4圖繪示在BV2細胞添加冬蟲夏草菌絲體95%乙醇萃出物對脂多醣誘發誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、第2型環氧合酶2(COX-2)和第1型血色素氧化酵素(Heme oxygenase 1,HO-1)之蛋白質表現量。

本發明將詳細描述特殊的具體實施例，這些具體實施例經由發明解釋提供，並非意欲用以限制本發明。在發明的範圍及精神內，本發明存在傾向於包括這些及其他變更及變動。

1.菌株

分離自冬蟲夏草野生藥材之新分離株H101-「冬蟲夏草菌Ophiocordyceps sinensis之菌絲體(無性世代為Hirsutella sinensis)」。

2.培養基配方

2.1 一般培養基配方

2%葡萄糖，1%酵母萃出物，0.05%硫酸鎂，0.05%磷酸二氫鉀及0.01%綜合維生素。

2.2 含全氟化碳氧載體培養基配方

2%葡萄糖，1%酵母萃出物，0.05%硫酸鎂，0.05%磷酸二氫鉀、0.01%綜合維生素及0.01%全氟萘烷。

3.浮面液態培養

於培養基中置入適當大小之預先以不同濃度(0.05%-1.5%)海藻酸鈉溶液中浸泡30分鐘之聚氨酯泡棉(polyurethane foam，PU)，於121℃下0.15MPa壓力下滅菌30-50分鐘，冷卻降至室溫後即可使用。

4.培養條件

於18℃培養溫度，將10%濃度種菌菌液接種於培養瓶中，先以恆溫震盪培養箱於100rpm震盪轉速震盪培養5天，再以靜置培養方式培養10天。

5.菌絲體萃取物製備

冬蟲夏草新分離株H101之95%乙醇萃取物：取冬蟲夏草菌絲體2g，以1：20(w/v)比例加入95%乙醇，在室溫下萃取菌絲體24h，以3000rpm離心10分鐘，取上清液濃縮為粉末。

6.分析方法

6.1 菌絲體生質(biomass)定量

將20ml醱酵培養液以預秤重之玻璃纖維濾器(Whatman GF/D disc)過濾，所得菌絲體生質以蒸餾水清洗，於微波爐(600W)中烘乾20min，立即秤重。

6.2 多醣體

6.2.1 胞外多醣體多醣體製備

取1mL之發酵液加入4mL的95%乙醇，最終濃度為74%，於4℃靜置12小時後，以離心機3000g離心15分鐘，去掉上清液，用74%酒精5mL清洗沉澱物，再以3000g離心15分鐘，去除上清液，，如此重複三次，最後將此酒精沉澱物置於-18℃下冷凍後，以冷凍乾燥機進行冷凍乾燥。

6.2.2 胞內多醣體多醣體製備

精稱10克菌絲體粉末到入250mL錐形瓶中，以100ml熱水萃取，所得萃取液經濾紙過濾後，低於40℃以下減壓濃縮至乾，再取1mL之萃取液加入4mL的95%乙醇，最終濃度為74%，於4℃靜置12小時後，以離心機3000g離心15分鐘(Hettich D-78532)，去掉上清液，用74%酒精5mL清洗沉澱物，再以3000g離心15分鐘，去除上清液，如此重複三次，最後將此酒精沉澱物置於-18℃下冷凍後，以冷凍乾燥機(LYPH LOCK6，Labconco，台灣)，進行冷凍乾燥。

6.2.3 多醣體分析-酚-硫酸法分析總醣

將冷凍乾燥後的樣品加入1mL蒸餾水，再加入1mL 5%的酚溶液，充分混均後，加入5mL濃硫酸，靜置10分鐘，以試管震盪器振盪此試管，於25℃水浴15分鐘，於分光光度計(Hitachi U-2000)測量490nm的吸光值，對照標準檢量線，代入標準檢量線回歸方程式，計算樣品所含之總糖含量。

6.3 生物活性成分HPLC樣品製備與分析

6.3.1 樣品製備

將15000rpm轉速離心後之定量菌絲體置於含定量蒸餾水之培養瓶中，以高壓滅菌器於121℃高溫高壓萃取1小時，萃取後再以15000rpm轉速離心後，取萃取液進行生物活性成分分析。

6.3.2 分析方法

生物活性成分(包括腺苷、甘露醇、三萜類、總多酚及類黃酮等)，主要以HPLC分析，分析方法主要主要參考下列文獻：

[1] 腺苷(Prado, S., Villamarín, A., & Ibarguren, I. (2013). Simultaneous determination of adenosine and related purines in tissues and hemolymph of mussel by HPLC. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, 36(4), 470-485.)、

[2] 甘露醇(Tang, D. Y., Hu, Q. F., Yang, G. Y., & Yin, J. Y. (2003). HPLC determination of mannitol in Cordyceps sinensis with solid-phase extraction. Lihua Jianyan: Huaxue Fence/Physical Testing and Chemical Analysis Part B:Chemical Analysis, 39(10), 585.)、

[3] 三萜類(Ameen, B. A., Majeed, S. N., & Abdul, D. A. (2013). HPLC analysis of fatty acids and triterpenoids in fruit of hawthorn (Crataegus azarolus) in Iraqi Kurdistan region. Asian Journal of Chemistry, 25(5), 2750-2754.)

[4] 總多酚(Ouyang, X. L., Fang, X. M., Wang, H.S., Wei, L. X., & Pan, Y. M. (2014). Total phenolic, total flavonoid and antioxidant activity of Euonymus fortunei by HPLC-Based analysis. Asian Journal of Chemistry, 26(15), 4648-4650.)

[5] 類黃酮(Parikh, N. H., & Kothari, C. S. (2016). Phytochemical analysis and total phenolic and flavonoid contents determination of methanolic extract of Ocimum basilicum L seed. International Journal of PharmTech Research, 9(4), 215-219.)等。

實施例1

第1圖為冬蟲夏草菌新分離株H101菌絲體以二階式浮面液態培養、一階式浮面液態培養及一般液態培養其菌絲體產量與發酵製備物之生物活性成分(胞外多醣體、胞內多醣體、腺苷、甘露醇、三萜類、總酚及類黃酮)比較。二階式浮面液態培養、一階式浮面液態培養及一般液態培養之培養基中未含全氟化碳氧載體，一階式浮面培養係以震盪培養方式持續培養15天，二階式浮面培養係以震盪培養5天後，再以靜置培養方式培養10天，一般液態培養則於培養基中並未添加聚氨酯泡棉以提供菌絲體吸附。於培養終止後分析菌絲體生質量及生物活性成分(胞外多醣體、胞內多醣體、腺苷、甘露醇、三萜類、總酚及類黃酮)含量。圖中顯示二階式培養所得之菌絲體及生物活性成分含量高於一階式培養所得，一階式培養所得菌絲體及生物活性成分含量也較對照組(一般培養)為高。

實施例2

第2圖為培養基中添加全氟碳化物氧載體(全氟三丙胺、六氟苯及全氟萘烷)對二階式浮面液態培養冬蟲夏草菌新分離株H101其菌絲體產量與發酵製備物之生物活性成分(胞外多醣體、胞內多醣體、腺苷、甘露醇、三萜類、總酚及類黃酮)影響。圖中顯示與對照組比較，添加全氟碳化物氧載體後，其菌 絲體產量與發酵製備物之生物活性成分(胞外多醣體、胞內多醣體、腺苷、甘露醇、三萜類、總酚及類黃酮)皆較高，且全氟萘烷較六氟苯及全氟三丙胺為佳。

實施例3

證實冬蟲夏草菌絲體發酵製備物(Os)以菌絲體95%酒精萃取物有效成分含量較多。

冬蟲夏草培養基、發酵液及其菌絲體水及酒精萃取物的生物活性成分含量結果顯示測量腺苷含量在各萃取物下WEOS(2.83±0.05mg/g)、EEOS-50(3.29±0.29mg/g)、EEOS-95(0.19±0.01mg/g)和FLOS(2.12±0.09mg/g)(表一)，文獻中冬蟲夏草發酵菌絲中腺苷的含量748.43μg/g(俞，2005)。冬蟲夏草寄主疆蟲體中腺苷的含量311μg/g，冬蟲夏草子實體中腺苷的含量1930μg/g(Patrick,2014)，相較下WEOS、EEOS-50及FLOS是有較高腺苷含量。

麥角固醇是真菌生物膜特有的成分，因此食品檢驗中用麥角固醇的含量作為生物量指標。結果顯示各萃取物中只有EEOS-95測得(18.6±0.7mg/g)之麥角固醇含量(表二)。而不同真菌，其麥角固醇的含量不同，一般1.0-6.75mg/g。麥角固醇是Vitamin D2(VD2)的前驅物質，具有重要的藥用價值。冬蟲夏草萃取物以EEOS-95麥角固醇含量較多，與文獻中蟲草菌絲體中麥角固醇的含量的最高值：1.44mg/g，但低於冬蟲夏草和蛹蟲草子實體中麥角固醇的含量10.68和6.92mg/g(俞，2005)。

多醣體是藥食兩用真菌的藥效活性成分之一。冬蟲夏草多醣大多為半乳甘露聚醣。藥理研究顯示，蟲草多醣類物質具有抗腫瘤、抗輻射和提高肌體免疫力等作用。結果顯示粗多醣、總多酚、類黃酮各萃取物含量分別為WEOS(306.3±7.1mg/g、1.71±0.07mg/g、116.8±2.2mg/100g)、EEOS-50(28.5±7.7 mg/g、1.77±0.15mg/g、164.7±1.5mg/100g)、EEOS-95(ND、1.28±0.05mg/g、213.8±6.5mg/100g)、FLOS(107.6±10.2mg/g、1.57±0.09mg/g、134.3±1.0mg/100g)和CM(65.2±13.7mg/g、1.5±0.03mg/g、25.2±2.7mg/100g)(表一)，多醣與文獻中3個產地的冬蟲夏草中多醣含量為22.4mg/g~35.9mg/g，新疆蟲草中含量為33.2mg/g(索等人，2008)。依據前人研究黃酮類化合物具有抗過敏、抗致癌物質、抗發炎的功效(Yamamoto et al.,2001；Cushnie et al.,2005；Sousa et al.,2007)。而多酚則是具有抗氧化、抗癌、減少心血管疾病的風險之功效(Williams et al.,2004；Artwet al.,2005；Frei et al.,2009)。多醣中的β-D-葡聚糖(β-D-glucans)(黃，2000)，具有免疫調節、抗癌、抗發炎之功效(Chihara et al.,1992；Miura et al.,1996；Vetvicka et al.,1996)。冬蟲夏草萃取物功效成分多，因此可推測在清除DPPH自由基能力、體外細胞、體內動物試驗其效果比較好。

GABA具有降血壓、降血糖、抗憂鬱及活化肝腎等生理活性。結果顯示各萃取物WEOS(12.6±0.8mg/g)、EEOS-50(13.2±0.6mg/g)、EEOS-95(18.6±0.7mg/g)、FLOS(3.7±0.3mg/g)和CM(ND)之GABA含量(表一)，GABA在人體中除了具有減緩壓力與幫助睡眠的效果，同時也有降血壓、利尿和安神的作用，已知一些神經性疾病，如癲癇、帕金森症的發生，都與GABA在腦中的濃度有關(Wong et al.,2003)。

實施例2

證實冬蟲夏草菌絲體發酵製備物(Os)之95%酒精萃取物具有抑制LPS誘導神經膠細胞造成之細胞發炎的能力

由於NO在LPS所誘發的炎反應中，扮演重要的角色，本實驗以不同濃度之LPS刺激BV-2細胞，我們探討不同濃度之Os萃取物是否可以降低LPS所誘發NO的生成。表二結果顯示各Os萃取物細胞內濃度在50、100、250、500、1000μL/mL可以降低由LPS所引發的NO生成以發酵液1000μL/mL下有顯著性差異。其他濃度皆對LPS所引發NO產生有抑制作用。其中以EEOS-95抑制NO的效果最佳。NO是一種不穩定活性氧族群，但文獻也指出NO(25~125nM的濃度)在腦部可以透過清除hrdroxyl radicals而具有神經保護性(Mohanakumar et.al.,2002)。Watters等學者(2002)利用LPS及phorbol12-myristate 13-acetate(PMA)分別處理BV2神經膠細胞株及鼠類巨噬細胞株RAW 264.7，也發現LPS會使這二種細胞株誘導iNOS表現及產生NO。給予LPS刺激時，神經膠細胞是NO的 主要來源，這過程需經由iNOS的表現及活化(Fiebich et al.,1998)。LPS活化發炎細胞(如巨噬細胞及神經膠細胞)及誘導該等細胞iNOS表現是透過MAPKs(Mitogen-activated protein kinases)(Bhat et al.,1998；Ryu et al.,2000)。在初級培養神經膠細胞，Bhat等學者(1998)利用ERK抑制劑(extracellular signal-regulated kinase,PD98059)發現對LPS引發初級培養神經膠細胞iNOS表現及NO產生有抑制作用。

發炎前趨物質的釋放，主要來自於神經膠細胞被活化；相關之細胞激素包括：IL-1β、IL-6、TNF-α等；在中樞神經系統，這些細胞激素可造成神經細胞毒性產生或引起細胞損傷之作用(Dickson et al.,1993)。另外，神經膠細胞被活化亦會釋放化學趨素例如：IL-8、MIP等(Wang et al,2000)。以LPS作為BV-2細胞活化之刺激劑，已知會引發許多相關的發炎因子，包括iNOS、NO、TNF-α、chemokines及ROS等。BV-2細胞在50、250、500μg/mL EEOS-95處理24h後，添加LPS(1μg/ml)刺激IL-1β、TNF-α、IL-6表現，培養24小時後，利用ELISA Kit測試細胞培養液中IL-1β、TNF-α、IL-6的表現量。結果顯示，不同濃度EEOS-95可以顯著性降低由LPS所引發的IL-1β、TNF-及IL-6表現量(表三)，在500μg/ml濃度下之抑制能力分別為71.2、52.4、43.5%(圖三)，IL-1β及IL-6優於1mM之褪黑激素。在BV2細胞添加冬蟲夏草菌絲體95%乙醇萃出物對脂多醣誘發誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、第2型環氧合酶2(COX-2)和第1型血色素氧化酵素(Heme oxygenase 1,HO-1)之蛋白質表現量如圖四所示，冬蟲夏草菌絲體95%乙醇萃出物可影響抗發炎有關之酵素表現。

參考文獻

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【生物材料寄存】

本發明專利之冬蟲夏草菌株係發明人分離自冬蟲夏草野生藥材之新菌株，經財團法人食品工業發展研究所鑑定為「冬蟲夏草菌Ophiocordyceps sinensis之菌絲體(無性世代為Hirsutella sinensis)」，菌株品系代號H101(報告書號碼：2014AG014)，並已於民國103年2月5日專利寄存於該所(寄存證明書編號：FP20130067；菌株編號BCRC930166)。

Claims (5)

1. 一種生產具抗發炎之冬蟲夏草菌(Ophiocordyceps sinensis)新分離株H101(BCRC930166)[寄存於食品工業發展研究所生物資源保存中心]菌絲體製備物及富含生物活性成分組合之培養基組合物，該培養基組合物組成為2%葡萄糖，1%酵母萃出物，0.05%硫酸鎂，0.05%磷酸二氫鉀、0.01%綜合維生素及0.01%全氟萘烷。
2. 一種冬蟲夏草發酵物，係經如申請專利範圍第1項培養基組合物進行液態培養冬蟲夏草菌新分離株H101(BCRC930166)後，分離自菌絲體或發酵培養液之產物者。
3. 一種具抗發炎之冬蟲夏草菌新分離株H101(BCRC930166)[寄存於食品工業發展研究所生物資源保存中心]菌絲體及發酵製備物生產方法，包含：i.配製液態培養基，包含如申請專利範圍第1項所述之培養基組合物；ii.接種10-20%冬蟲夏草菌新分離株H101於該液態培養基中；iii.於溫度15-20℃及攪拌速率100-150rpm條件下進行液態培養；iv先以震盪培養方式培養5天，再以靜置培養方式培養10天及v.分離經液態培養後之產物者。
4. 一種冬蟲夏草菌新分離株H101(BCRC930166)衍生之抗發炎發酵製備物，其包含如申請專利範圍第2項所述之菌絲體或發酵培養液之產物及稀釋劑、賦型劑或載體。
5. 一種冬蟲夏草菌新分離株H101(BCRC930166)所產生之發酵組合物，其包含如申請專利範圍第3項所述之生產方法所得之分離物及稀釋劑、賦型劑或載體。