TWI768224B - 冬蟲夏草ｃｓ-１００菌株用於促進神經細胞生長之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係揭露一種新穎冬蟲夏草CS-100菌株，寄存編號BCRC930196，寄存日：2018年9月21日，寄存於台灣財團法人食品工業發展研究所。該冬蟲夏草CS-100菌株係能夠用於有效且特異性地抑制神經細胞內QN1蛋白堆積，並且能夠促進神經突觸再生，以達到治療或改善與QN1蛋白異常相關疾病及神經退化性疾病之功效。

Description

冬蟲夏草CS-100菌株用於促進神經細胞生長之用途
本發明係有關於一種新穎冬蟲夏草菌株及其用途，特別係指冬蟲夏草CS-100菌株用於促進神經細胞生長之用途。
按，根據流行病學之統計研究，神經退化性疾病於未來將會取代癌症而成為死亡之主要原因之一。大多數神經退化性疾病發生初期未有明顯症狀，並且緩慢地惡化，而對於神經造成之破壞多為不可逆之傷害，因此目前臨床上用於治療神經退化性疾病之藥物不僅數量很少，且療效有限。
更進一步來說，神經退化性疾病之種類眾多，如阿茲海默症、帕金森氏症、多系統萎縮症、多發性硬化症、亨丁頓舞蹈症等，而雖然各個疾病之發生皆與神經退化相關，但是基於各個疾病之致病機轉不同，以致於所使用之藥物或治療手段會不相同；例如帕金森氏患者腦內之乙烯膽鹼含量減少或多巴胺分泌不足，因而投予乙烯膽鹼抑制劑係能夠有效改善帕金森氏症患者之症狀；但對於非由乙烯膽鹼含量降低而引起之神經退化性疾病，則投予乙烯膽鹼抑制劑係無法發揮治療之功效。
據此可知，目前臨床上仍極度缺乏對於特定神經退化性疾病具有專一性且有效之之治療手段。
本發明之主要目的係在於提供一種新穎冬蟲夏草，其係為冬蟲夏草CS-100菌株(中華被毛孢Hirsutella sinensis CS-100)，寄存編號BCRC930196，寄存日：2018年9月21日，寄存於台灣財團法人食品工業發展研究所，另於2017年7月7日寄存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，寄存編號：CGMCC No.14350。
本發明之另一目的係在於提供該冬蟲夏草CS-100菌株之用途，其係能夠用於有效且特異性地抑制神經細胞內QN1蛋白堆積，能夠達到治療或改善與QN1蛋白異常相關疾病之功效，例如肌萎縮性脊髓側索硬化症。
本發明之次一目的係在於提供該冬蟲夏草CS-100菌株之用途，其係能夠促進神經突觸再生，而能夠達到治療或改善與神經突觸傳導相關疾病之功效。
緣是，為能達成上述目的，本發明係揭露一種新穎冬蟲夏草CS-100菌株，其核糖體DNA序列包含SEQ ID No.1所示序列，經以NCBI Blast比對後發現其與資料庫中冬蟲夏草菌株未有百分百相同者。
於本發明之一實施例中，將本發明所揭冬蟲夏草CS-100菌株培養後，取其菌絲體進行實驗，發現本發明所揭其冬蟲夏草CS-100菌株之菌絲體具有抑制QN1蛋白聚集之能力，而QN1蛋白異常與特定之神經退化性疾病相關，如肌萎縮性脊髓側索硬化症，因此，藉由投予有效量之本發明所揭冬蟲夏草CS-100菌株之菌絲體、其萃取物或含有上述物質之一組合物至一罹患由QN1蛋白異常引起之疾病之患者，係能夠達到治療或改善由QN1蛋白異常引起之疾病，或避免由QN1蛋白異常引起之疾病惡化之功效。
於本發明之一實施例中，該冬蟲夏草CS-100菌株之菌絲體係被製備為濃度至少為1.7ppm之菌絲體萃取液。
於本發明之另一實施例中，本發明所揭冬蟲夏草CS-100菌株之菌絲體係具有促進神經突觸生長之功能，因而冬蟲夏草CS-100菌株之菌絲體或其萃取液係能用於製備神經突觸生長促進劑。具體來說，將含有效量之冬蟲夏草CS-100菌株之菌絲體、其萃取物或含有上述任一物質之組合物投予至一罹患與神經退化疾病之患者，係能夠有效地促使其神經突觸再生，達到治療神經突觸生長異常或退化相關疾病之功效。
此外，於本發明之又一實施例中，該冬蟲夏草CS-100菌株之菌絲體係具有抑制神經細胞內β澱粉樣蛋白堆積之能力，因此，藉由投予含有有效量之冬蟲夏草CS-100菌株之菌絲體、其萃取物或含有上述任一物質之組合物至罹患與β澱粉樣蛋白堆積相關疾病之患者，係能夠改善神經細胞內β澱粉樣蛋白堆積之病徵而能夠達到治療與β澱粉樣蛋白堆積相關疾病之功效。
第一圖係為冬蟲夏草CS-100菌株之rDNA ITS1/ITS2序列。
第二圖係為不同菌株進行抑制Aβ1-40試驗之結果。
第三圖係為CS-100萃取物在不同濃度下之細胞存活結果。
第四圖係為檢測本發明所揭冬蟲夏草CS-100菌株之菌絲體對於神經細胞突觸再生能力之結果，其中，左圖A為與磷酸鹽緩衝液共培養之神經細胞，右圖B為與本發明所揭冬蟲夏草CS-100菌株之菌絲體共培養之神經細胞。
本發明所揭冬蟲夏草CS-100菌株之rDNA ITS1/ITS2序列如SEQ ID No.1及第一圖所示，經NCBI Blast比對，冬蟲夏草CS-100菌株之rDNA ITS1/ITS2序列係不同於現有冬蟲夏草菌株而為一新穎菌株，目前寄存於台灣財團法人食品工業發展研究所，寄存編號BCRC 930196，寄存日：2018年9月21日，並寄存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，寄存編號：CGMCC No.14350，寄存日：2017年7月7日。
冬蟲夏草CS-100菌株之培養方式如下：將冬蟲夏草CS-100菌株接種於平板培養基中，於15~20℃培養30天後，平板培養基上菌落直徑平均約12-15mm，呈乳白色或淡黃色，而菌落生長緩慢，且幾乎不擴張，氣生菌絲短而緻密，平板背面呈褐色。
以下，為能說明本發明之功效，將茲舉若干實例並搭配圖表做更進一步說明如後。
以下實例中所使用之N2a細胞係來自於中央研究院生醫所。
實例一：製備冬蟲夏草菌絲體液
將培養後之冬蟲夏草CS-100菌株以去離子水重新懸浮(1.0g/50.0mL)，進行高壓破菌程序，破菌後，移除不溶物質，再以0.2μm孔徑濾膜進行過濾，將所得到之濾液乾燥，即為本發明所揭冬蟲夏草菌絲體；並將冬蟲夏草菌絲體配製成為冬蟲夏草菌絲體液(1.0mg/mL)供下列實例使用。
實例二：抑制Aβ1-40試驗
取不同菌株，分別為本發明所揭冬蟲夏草CS-100菌株、雲芝、巴西蘑菇、猴頭菇，並參照實例一之方式獲得萃取物，再分別以磷酸鹽衝溶液配置成濃度為50ppm之待測樣品。將該些待測樣品1mL分別與與製備為濃度30μM之Aβ1-40胜肽片段於室溫下混合，進行共培養24小時；培養後以圓二色光譜儀進行判定Aβ1-40是否形成纖維狀聚集測試，其中，以200nm做為基準；在抑制率 (inhibition %)之分析計算上，所有數據應先扣除背景值，以CD光譜中200nm為基準，並將Aβ1-40培養前與培養後分別定義為抑制100%與0%，進行抑制率之計算。試驗結果如第二圖及下表一所示。
Figure 108126441-A0305-02-0006-1
由第二圖及表一之結果可知，本發明所揭冬蟲夏草菌絲體確實能夠有效地抑制β澱粉樣蛋白聚集。
實例三：抑制QN1試驗
取不同菌株，分別為本發明所揭冬蟲夏草CS-100菌株、冬蟲夏草CS-300菌株、巴西蘑菇、舞菇，其中，冬蟲夏草CS-300菌株係為本案申請人自行篩選出另一冬蟲夏草。將上述菌株分別參照實例一之方式獲得萃取物，再分別以磷酸鹽衝溶液配置成50ppm之濃度，並與QN1(30μM)胜肽片段於室溫下進行共培養七天；培養完後以圓二色光譜儀進行判定QN1胜肽是否形成纖維狀聚集測試(以200nm做為基準)；在計算抑制率時，所有數據應先扣除背景值，並以CD光譜中200nm為基準，且將QN1胜肽培養前後分別定義為抑制100%與0%，以進行抑制率之計算。試驗結果如下表二所示。
由表二之結果可知，本發明所揭冬蟲夏草CS-100菌株之菌絲體確實能夠抑制QN1蛋白於神經細胞中之堆積，而能作為治療或改善與QN1蛋白病變或累積引起之疾病之有效成份。
表二：不同菌株對於QN1之抑制率
Figure 108126441-A0305-02-0007-2
綜合表一及表二之結果可知，本發明所揭冬蟲夏草CS-100菌株之菌絲體或其萃取物係能夠有效抑制對於神經細胞有害蛋白之聚集，並且抑制率可達到超過50%。而經先前文獻可知，QN1蛋白與肌萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)之發病為正相關，因此，由上述結果清楚顯示本發明所揭冬蟲夏草CS-100菌株菌絲體確實具有抑制QN1之能力，而能夠用於治療或預防與QN1聚集相關之疾病，如肌萎縮性脊髓側索硬化症。
實例四：有效濃度試驗
將Aβ1-40利用有機溶劑分散後，分裝成30μM於離心管中，並且以冷凍乾燥除去有機溶劑；移除有機溶劑後分別加入不同濃度之樣品，並以超音波震盪機震盪10分鐘，以混合均勻。於96孔盤中以DMEM培養基(200μL)培養N2a細胞(104 cell/per well)1天後，加入配製好之Aβ1-40與樣品萃取物之混合物20μL，每培養孔中總體積為200μL，其中，樣品萃取物係參照實例一所示步驟進行。培養16小時後，以DMEM培養基沖洗除去表面上之Aβ1-40與樣品後繼續培養3天。3天後更換DMEM培養基後加入XTT試劑25μL，於培養箱中培養2小時，2小時後以UV/Vis光譜儀進行分析，其中，以沒有添加Aβ1-40之細胞做為控制組(A0，存活率定為100%)，以XTT試劑做為背景值(AXTT，存活定義為0%)，分別對各樣品之吸收度進行統計分析。試驗結果如第三圖及下表三所示。
Figure 108126441-A0305-02-0007-4
Figure 108126441-A0305-02-0008-5
由第三圖及表三之結果可知，本發明所揭冬蟲夏草菌絲體於濃度為至少1.77ppm時能夠保護50%以上神經細胞免受於如β澱粉樣蛋白之毒蛋白累積破壞，達到改善或預防神經損傷相關疾病之功效。
實例五：細胞毒性試驗
將Aβ1-40利用有機溶劑分散後，分裝成30μM於離心管中，並且以冷凍乾燥除去有機溶劑；移除有機溶劑後分別加入不同之樣品萃取物(50ppm)後以超音波震盪機進行混合。於96孔盤中以DMEM培養基(200μL)培養N2a細胞(104 cell/per well)1天後，加入配製好的Aβ1-40與樣品之混合物(20μL，每個培養孔中總體積為200μL；每培養孔中最終濃度為：Aβ1-40 3μM，樣品5ppm)。培養16小時後以DMEM培養基沖洗除去表面上的Aβ1-40與樣品後，再培養3天，而後更換DMEM培養基，再加入XTT試劑25μL，培養2小時，之後以UV/Vis光譜儀進行分析，而以沒有添加Aβ1-40之細胞做為控制組(A0，存活率定為100%)，以XTT試劑做為背景值(AXTT，存活定義為0%)，分別對各樣品之吸收度進行統計分析。試驗結果如下表四所示。
Figure 108126441-A0305-02-0008-6
實例六：促進神經突觸生長測試
將12孔細胞培養盤以Poly-Lysine進行表面貼附後加入培養液培養一天；一天後，將N2a細胞(105 cell/per well)放於具有表面改質的12孔細胞培養盤中培養一天；一天後加入待測樣品(萃取物50ppm與Aβ1-40 30μM)於培養液中稀釋十倍後培養24小時；培養24小時後，移除培養液並加入含有維生素A酸之 培養液，再次培養24時，24小時後固定細胞進行免疫染色後，以螢光顯微鏡觀察，結果如第四圖所示。
由第四圖之結果可知，與磷酸鹽緩衝液共培養之神經細胞，其突觸平均長度僅有17.1±5.5μm；而與本發明所揭冬蟲夏草CS-100菌株之菌絲體共培養之神經細胞，其突觸平均長度係為35.3±5μm。由此結果顯示，本發明所揭冬蟲夏草CS-100菌株之菌絲體係具有促使神經細胞突觸再生之能力，而能夠達到有效治療或改善神經退化相關疾病之功效。
【生物材料寄存】
TW中華民國 台灣財團法人食品工業發展研究所2018/09/21 BCRC 930196
CN中國大陸 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心2017/07/07 CGMCC No.14350
<110> 生展生物科技股份有限公司
<120> 冬蟲夏草CS-100菌株用於促進神經細胞生長之用途
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 552
<212> DNA
<213> Cordyceps sinensis CS-100
<400> 1
Figure 108126441-A0305-02-0010-7
Figure 108126441-A0305-02-0011-8

Claims (3)

  1. 一種將新穎冬蟲夏草CS-100菌株(中華被毛孢Hirsutella sinensis CS-100)水萃物用於製備神經突觸生長促進劑之用途，其中，該新穎冬蟲夏草CS-100菌株寄存於台灣財團法人食品工業發展研究所，寄存編號BCRC 930196，寄存日：2018年9月21日，並寄存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，寄存編號：CGMCC No.14350，寄存日：2017年7月7日。
  2. 依據申請專利範圍第1項所述用途，其中，該新穎冬蟲夏草CS-100菌株之核糖體DNA序列包含SEQ ID No.1所示序列。
  3. 依據申請專利範圍第1項所述用途，其中，該冬蟲夏草CS-100菌株之菌絲體係被製備為濃度至少為1.7ppm之溶液。
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