CN106010972B

CN106010972B - 台湾冬虫夏草分离株及其用途

Info

Publication number: CN106010972B
Application number: CN201510606334.8A
Authority: CN
Inventors: 沈汤龙; 曾显雄; 王彦文; 蔡昇宏; 洪子雯
Original assignee: Mucho Biotech Co ltd
Current assignee: Mucho Biotech Co ltd
Priority date: 2015-03-23
Filing date: 2015-09-22
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2035-09-22
Also published as: CN106010972A

Abstract

本发明公开了台湾冬虫夏草分离株及其用途。具体地，本发明涉及一种新颖的台湾冬虫夏草分离株，其能展现出优越的抗氧化和癌细胞抑制性质。本发明也涉及台湾冬虫夏草在用于制造在一个体中治疗活性氧相关性疾病的医药品上的用途。

Description

台湾冬虫夏草分离株及其用途

技术领域

本发明涉及一种新颖的台湾冬虫夏草分离株，其能展现出优越的抗氧化和癌细胞抑制性质。本发明也涉及台湾冬虫夏草在用于制造在一个体中治疗活性氧相关性疾病的医药组合物上的用途。

背景技术

昆虫病原性(entomopathogenic)真菌中的广义虫草属(Cordyceps s.l.(sensulato))包括有西藏冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)和蛹冬虫夏草(Cordycepsmilitaris)等物种，其乃是一种极负盛名的传统汉药，长年以来被使用做为补品和民间药方，与人参、鹿茸并称“中药三大宝”。除了使用上的安全性以外，冬虫夏草在治疗呼吸和脑血管疾病(Wang等,Metab.Brain Dis.27,p.159-165(2012))、促进免疫调节功能(Shi等,Int.Immunopharmacol.9,p.582-586(2009))、调整肝脏代谢(Manabe等,Br.J.Nutr.83,p.197-204(2000))和治疗癌症(Jayakumar等,J.Cancer Res.Ther.10,p.43-49(2014))上的高度药学和治疗价值也受到注意。对此，近年来研究者也倾注了大量心力在发掘广义虫草属各物种中的生物活性组份、药学有效性和第二代谢产物的机转。此外，活性氧(ROS)会促使细胞坏死，并促成癌症(Faisal等,Urology 84,p.1434-1441(2004))、神经退化疾病(Tiurenkov等,Eksp.Klin.Farmakol.77,p.16-19(2014))、肝病(Matsui等,JPEN.J.Parenter.Enteral.Nutr.31,p.373-380(2007))、动脉粥状硬化(Park等,Cardiovasc.Toxicol.14,p.1-9(2014))等各种病理状况，甚至引发老化(Ji等,Phytother.Res.23,p.116-122(2009)；Lee等,Arch.Biochem.Biophys.490,p.103-109(2009))。经报导，冬虫夏草可以清除自由基，能够做为一种抗氧化剂(Yu等,J.Agric.FoodChem.54,p.3132-3138(2006)；Li等,Life Sci.73,p.2503-2513(2003))。

就分类学而言，广义虫草属是广义麦角菌科(Claviciptaceae s.l.)的一个庞大侧系群(paraphyletic group)，其包含许多物种，具有昆虫、蜘蛛乃至于松露类真菌的广泛寄主范围。近来，ITS(内转录间隔区)、RPB(RNA聚合酶II)、EF(延长因子)等分子标记已被普遍地应用于物种鉴别和系统发生的研究上(Gardes,M.and Bruns,T.D.,Mol.Ecol.2,113-118(1993)；Schoch等,Proc.Natl.Acad.Sci.109,p.6241-6246(2012)；Tanabe等,Mol.Phylogenet.Evol.30,p.438-449(2004))。基于多基因系统发生分析法(multiplegenes phylogenetic analysis)的研究结果，目前广义虫草属已被划分成几个属，包括狭义虫草属(Cordyceps s.s.)、大团囊虫草属(Elaphocordyceps)、绿僵虫草属(Metacordyceps)和线虫草属(Ophiocordyceps)。

台湾冬虫夏草(Ophiocordyceps formosana)是在1981年由日本人小林氏和清水氏在台湾南投县溪头地区发现并率先提出报告(Kobayasi,Y.,Bull.Natn.Sci.Mus.,Tokyo.Ser.B 7,p.113-122(1981))，其原本被认定为台湾的原生菌种。2001年，安徽大学李春如教授在安徽省黄山地区也采集到台湾冬虫夏草，意味着台湾冬虫夏草的分布范围并不限于台湾(Li等,Mycosystema 24,p.349-355(2005))。然而，在本申请提出申请前，台湾冬虫夏草的鉴定仅局限于形态学上的描述。对于台湾冬虫夏草的生理学和生化学分析，乃至于医药上的应用，皆付的阙如。台湾冬虫夏草的生长习性和形态特征与广义虫草属中其他物种类似，使得它的药用潜力引人注意。但在本申请提出申请前，台湾冬虫夏草少有文献报告，也没有足够的材料进行进一步的鉴定和探讨。

由于广义虫草属各菌种及其相关产品的安全性和有效性，使其发展出各式各样的辅助性药品和传统性药品。但是，因为其供应来源有限、价格高昂、过度采集以及人工培植不易等原因，导致虫草属各菌种濒临绝迹。因此，相关技术领域中亟需以虫草属各物种间的系统发生关为基础，建立一个台湾冬虫夏草的典型菌株。此外，相关技术领域中也需要就台湾冬虫夏草的癌细胞抑制潜力、抗氧化活性以及其给予个体时的安全性进行进一步的研究。

发明内容

依据本发明，本申请发明人已鉴定出一种新颖的台湾冬虫夏草分离株，其在形态(morphologically)和系统发生上(phylogenetically)与台湾冬虫夏草的已知特征相同，但不同于广义虫草属中的其他物种。尤其是，通过鉴定和分析本申请所揭露的台湾冬虫夏草分离株，本申请发明人意外地发现到，台湾冬虫夏草在抗氧化活性和癌细胞抑制活性上较广义虫草属中的其他物种更为优越，而且对于正常细胞具有更低的毒性。这意味着相比于广义虫草属中的其他物种，台湾冬虫夏草在治疗癌症上能够展现出更高的有效性以及更高的安全性。本申请揭露内容显示出，台湾冬虫夏草，特别是本申请所揭露的新颖台湾冬虫夏草分离株，在医药用途上具有极高的应用价值。

据此，在本申请所揭露的第一方面是提供一种台湾冬虫夏草分离株即台湾冬虫夏草(Ophiocordyceps formosana)MUCHO 815，它是以BCRC 930172的寄存编号于2015年01月16日被寄存在中国台湾食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)，并且基于布达佩斯条约在国际承认用于专利程序的微生物寄存上的效力，以DSM 32000的寄存编号于2015年01月28日被寄存在德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen；DSMZ)。

在本申请所揭露的第二方面是提供一种冬虫夏草组合物，其包含前述台湾冬虫夏草分离株的干燥粉碎颗粒或是前述台湾冬虫夏草分离株的水性萃出物，且任选地包含有一可接受的赋形剂。

在本申请所揭露的第三方面是提供一种保健食品，其包含前述台湾冬虫夏草组合物。

在本申请所揭露的第四方面是提供一种台湾冬虫夏草的用途，其供用于制造一用来在一个体中治疗活性氧相关性疾病的医药品，较佳为供用于制造一用来治疗癌症的医药品，例如用来治疗肺癌、乳癌、肝癌和白血病的医药品。

附图说明

图1A-图1G显示实例1中采集到的台湾冬虫夏草的形态特征，其中图1A显示所述台湾冬虫夏草的子座由寄主长出，且具有长柱状的柄，图1B显示子座头部呈长椭圆形，图1C显示卵形子囊壳埋生于子座内，图1D显示子囊壳孔口处具有被子囊壳厚壁所包围的缢缩颈部，图1E显示由子囊孢子断裂而生成的杆状次生孢子，图1F显示本申请所揭分离株在马铃薯右旋糖琼脂培养基上的菌落呈橘色至白色，外表具绒毛且带有小水珠，而图1G显示台湾冬虫夏草的无性世代中华被毛孢(Hirsutella)；

图2显示广义虫草属的系统发生树，其利用三组基因(RPB1,RPB2,EF1-α)加以连锁并通过最大近似法则进行推衍，而得出其归属于三个新创科别：线虫草科(Ophiocordycipitaceae)、虫草科(Cordycipitaceae)和狭义麦角菌科(Clavicipitaceaes.s.)，图中的比例尺代表50个变异；

图3A-图3F为各种虫草的水性萃出物的HPLC图谱，其中图3A显示D-甘露醇(标注为D)、腺苷(标注为A)和虫草素(标注为C)在HPLC管柱内的滞留时间，而图3B至图3F分别为台湾冬虫夏草菌丝体(OF_MY)、西藏冬虫夏草菌丝体(OS_MY)、西藏冬虫夏草子实体(OS_FB)、蛹冬虫夏草菌丝体(CM_MY)和蛹冬虫夏草子实体(CM_FB)的水性萃出物的HPLC冲提图谱；

图4A1-图4A4显示各种癌细胞株暴露于台湾冬虫夏草菌丝体(OF_MY)、西藏冬虫夏草菌丝体(OS_MY)、西藏冬虫夏草子实体(OS_FB)、蛹冬虫夏草菌丝体(CM_MY)和蛹冬虫夏草子实体(CM_FB)的热水萃出物下的存活率；

图4B1-图4B2显示正常细胞株暴露于各虫草萃出物下的存活率；

图5A-图5D显示各虫草萃出物于活体外和于活体内的抗氧化活性，其中图5A显示台湾冬虫夏草菌丝体(OF_MY)、西藏冬虫夏草菌丝体(OS_MY)和蛹冬虫夏草菌丝体(CM_MY)的热水萃出物于活体外的DPPH抗氧化活性，图5B显示台湾冬虫夏草菌丝体(OF_MY)、西藏冬虫夏草子实体(OS_FB)和蛹冬虫夏草子实体(CM_FB)的热水萃出物于活体外的DPPH抗氧化活性，图5C-图5D分别显示通过流式细胞仪来测量各种虫草萃出物于活体内的ROS清除功效及其定量结果(p<0.05)；以及

图6A-图6B显示台湾冬虫夏草分离株O.formosana MUCHO 815在接种有MDA-MB-231人类乳癌细胞的异种移植裸鼠模型中所展现的抗肿瘤生成活性，其中图6A为柱状图，显示1倍量和5倍量的台湾冬虫夏草分离株O.formosana MUCHO 815的热水萃出物(分别以1×OF_MY和5×OF_MY标示组别)以剂量相依方式抑制裸鼠模型中肿瘤的发展，数据以平均值±标准偏差表示，而图6B显示各组裸鼠在接受处理20天时的肿瘤尺寸照片。

具体实施方式

除非另行说明，否则本申请专利说明书和各权利要求项中所使用的下列用语具有下文给予的定义。请注意，本申请说明书和各权利要求项中所使用的单数形用语“一”意欲涵盖在一个以及一个以上的所载事项，例如至少一个、至少二个或至少三个，而非意味着仅仅具有单一个所载事项。此外，本申请各权利要求项中使用的“包含”、“包括”等开放式连接词是表示权利要求项中所记载的元件或成分的组合中，不排除权利要求项未载明的其他元件或成分。

本说明书中所使用的术语“台湾冬虫夏草”意欲涵盖被分类于Cordycepsformonsana此物种以及被分类于Ophiocordyceps formosana此物种中的所有分离株，特别是依据RPB1、RPB2和EF1-α基因的核苷酸序列相同性，而被分类于Ophiocordycepsformosana此物种中的所有分离株。这些台湾冬虫夏草菌株包括本领域技术人员可易于获得的台湾冬虫夏草菌株，例如可由国内或国外寄存机构购买或是通过申请分让而获得的分离株，或者是利用本技术领域中所惯用的微生物分离方法而从天然来源中单离出来的台湾冬虫夏草菌株。在一较佳具体例中，所述台湾冬虫夏草为本申请所揭露的台湾冬虫夏草分离株，其是以BCRC 930172的寄存编号被寄存在中国台湾食品工业发展研究所(FoodIndustry Research and Development Institute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)，以及以DSM 32000的寄存编号被寄存在德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)。

本申请所揭露的台湾冬虫夏草分离株可以参照习用的虫草菌丝体培养方法进行菌丝体的培养和增殖。一般来说，适合于虫草菌丝体的培养条件为使用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、玉米淀粉、麦芽萃出物或是其组合做为碳源，且使用硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、酪蛋白胺基酸(casamino acid)、酵母菌萃出物、蛋白胨(peptone)及胰化胨(tryptone)或是其组合做为氮源，另将培养基的酸碱值调整到中性至微酸性，较佳为pH 5.0-7.0，例如pH5.5-6.0。在一较佳的具体例中，所述培养基是适合摇瓶发酵培养以获取虫草菌丝体的液态培养基，例如马铃薯右旋糖液态培养基(potato dextrose broth)。在另一较佳具体例中，所述培养基是固态培养基，例如马铃薯右旋糖琼脂(PDA)或沙氏右旋糖琼脂酵母菌萃出物(S-DAY)。培养温度较佳为被控制在室温或略低于室温，例如15℃-25℃。

经由后文所述的MTT分析发现，台湾冬虫夏草这个物种，特别是本申请所揭露的台湾冬虫夏草分离株，能够展现出显著的癌细胞抑制活性。而且，相比于西藏冬虫夏草和蛹冬虫夏草的菌丝体所得到的活性，台湾冬虫夏草能够展现出更强的癌细胞抑制效果，而其抑制癌细胞的能力甚至与西藏冬虫夏草的子实体相当(参见实例7)。

大体来说，冬虫夏草不容易以人工培养方式生产子实体，通常只能利用发酵技术大量生产菌丝体。虽然目前已经成功地使用人工培养方式培养出蛹冬虫夏草的子实体，但子实体长成所需要的时间长，且子实体的出菇率低且变异率高，故仍以菌丝体的生产较具经济效益。如本项技术领域技术人员所知悉，虫草子实体中的腺苷和虫草素(cordycepin)等活性成份的含量远较菌丝体为高，故一般认定虫草子实体相比于菌丝体具有更高的药用价值。然而，依据本申请说明书的揭露内容，台湾冬虫夏草，特别是本申请所揭露的台湾冬虫夏草分离株，其菌丝体萃出物所展现的癌细胞抑制活性竟然与西藏冬虫夏草的子实体萃出物相当，更远高于西藏冬虫夏草和蛹冬虫夏草的菌丝体萃出物所展现的抑癌活性。

另一方面，氧化压力对于人体健康的不利影响也广为受注意。事实上，生物体或细胞暴露于过量活性氧(ROS)会明显导致体内平衡失调。最后，大量的ROS会促使细胞和DNA损坏、引发细胞淍亡，并且促成有害并发症的发生，例如老化、高血压、发炎反应等，甚至癌症。一般相信，虫草的抗氧化活性与其医药上的疗效息息相关。在本申请说明书中，DPPH抗氧化分析(参见实例8)和活性氧(ROS)清除分析(参见实例9)的结果显示，台湾冬虫夏草的菌丝体相比于等量的其他虫草物种的菌丝体具有更为优越的抗氧化能力，其抗氧化能力甚至与西藏冬虫夏草的子实体相当，而且对于细胞或个体的毒性最低，因而适用于治疗、预防或改善与活性氧相关性疾病。

综合上述分析所获得的结果，本发明的一个方面为台湾冬虫夏草在制造用于在一个体中治疗活性氧相关性疾病(diseases associated with ROS)的药品上的用途。本说明书所称“活性氧”的定义如WO 94/13300 A1中所述，且意欲涵盖以氧为中心的自由基，例如氢氧自由基(·OH)、超氧阴离子(O2·-)等，以及非自由基型含氧氧化剂，例如过氧化氢。本说明书所称“活性氧相关性疾病”意指至少部分地由于活性氧的产生或是至少部分地由于暴露在活性氧环境中所导致的个体病况，其包括但不限于白内障、糖尿病、阿兹海默症、心脏病、发炎、癌症、雄性不孕性、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateralsclerosis)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、帕金森氏症和老化。

在一较佳具体例中，前述活性氧相关性疾病为癌症，其包括但不限于固体肿瘤，例如肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC))、肺部、头部和颈部的鳞状细胞癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、子宫颈癌、食道癌、膀胱癌、胰脏癌、脑癌、肝癌、大肠癌、直肠癌、皮肤癌、遗传性和散发性乳突肾细胞癌、黑色素瘤、神经胶质母细胞瘤、神经纤维瘤、间皮细胞瘤和骨肉瘤；以及液体肿瘤，例如淋巴癌、白血病，例如急性淋巴性白血病(acute lymphoblastic leukemia)、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia)、B-细胞慢性淋巴性白血病(B-cell chronic lymphocytic leukemia)和慢性粒细胞性白血病(chronic granulocytic leukemia)，以及多发性骨髓瘤。在一更佳具体例中，所述癌症是选自于由肺癌、乳癌、肝癌和白血病所组成的群组。

本说明书所称“治疗”等用语意指将本申请说明书所述疾病或是它们的一或多种症状的进展予以逆转、缓和、延迟发作或抑制。在一些具体例中，治疗可在发展出一或多种症状后再施行。在其他具体例中，治疗可在无症状下施行。例如，治疗可在症状发作前施行至易染病个体(例如根据症状历史及/或根据遗传或其他感病性因素)。治疗亦可于症状解除后持续施行，以进行预防或延迟其复发。

依据本申请揭露内容，可以将能够有效治疗活性氧相关性疾病或是将能够有效减缓这些疾病的严重性的任何用量的台湾冬虫夏草，通过任何投药途径给予需要的个体。所需要的精确用量随个体不同而有别，依据个体的物种、年龄和健康情况、性别和饮食、患病的严重性、特定药剂形式、投药模式、治疗持续时间以及合并使用或同时使用的药剂等因素而定。本领域技术人员应能明了，台湾冬虫夏草的每日总和用量将在合理医学判断的范畴内由医师来决定。当给予人类个体时，台湾冬虫夏草萃出物通常是以每日一至三次、每周一至三次或是每双周一次的频率，以每次约0.01-1000毫克/公斤体重的用量进行给予，较佳为以每次约0.1-100毫克/公斤体重的用量给予，更佳为以每次约1-50毫克/公斤体重的用量给予。

本申请说明书中所使用的术语“个体”意欲涵盖人类或非人类脊椎动物，例如非人类哺乳动物。非人类哺乳动物包括畜产动物、伴侣动物、实验动物和非人类灵长类动物。非人类哺乳动物亦非限制性地包括有马、牛、猪、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、兔、貂等。较佳为人类，且更佳为罹患活性氧相关性疾病的个体，例如罹患癌症的个体。

为了供研究之用，本申请说明书中所使用的术语“个体”也意欲涵盖细胞、组织和器官。本申请所揭露的发明也因而不仅适用于活体内，也适用于活体外。

台湾冬虫夏草可以子实体和菌丝体的形式给予个体。由于子实体不易培养，所以较佳为呈菌丝体的形式给予个体，更佳为呈菌丝体的干燥粉碎颗粒、水性萃出物或是水性萃出物的制剂的形式给予个体。

可以使用研磨机将干燥后的冬虫夏草子实体或菌丝体直接予以研磨，而制成前述干燥粉碎颗粒。干燥粉碎颗粒的粒径并无特别限制，只要适合于直接给予个体且有利于个体的摄取和吸收，或是有利于进一步加工制成其他适合给予个体的形式即可。

可以选用任何现用制程来制备出虫草的水性萃出物，只要所述萃取制程可以有效地将虫草的水溶性以及水可混溶性组份由虫草的固体部分转移至水性溶剂中即可。一般来说，所述萃取制程包括将台湾冬虫夏草的子实体或菌丝体加以粉碎，再以水、具有1至4个碳原子的低级醇类(例如甲醇、乙醇)或其组合等水性溶剂进行萃取作业，且较佳为在萃取作业进行同时施加热能、超音波振荡或机械性搅拌等手段来促进萃取的效率，最后再以过滤、离心等手段去除固体部分，从而获得虫草的水性萃出物。较佳为所述萃取制程是选自于由浸提法、热水回流法、热醇回流法、超音波水提法，超音波醇提法所组成的群组。在一较佳具体例中，是以热水回流法来制备台湾冬虫夏草的水性萃出物，也就是使定量热水持续地流过虫草材料以提取水性萃出物，较佳为热水温度为30-100℃，更佳为40-60℃，最佳为45-55℃，例如50℃，而且萃取作业历时30分钟至12小时，较佳为1-6小时，例如2小时。在一较佳具体例中，萃取作业的效率可以通过D-甘露醇、腺苷及/或虫草素等虫草活性成份的萃出量来进行评估。

前述台湾冬虫夏草的水性萃出物可经调制成适当浓度后，再配制成口服形式或非经肠形式而给予个体。调制这些给予形式时，可加入例如填充剂、膨化剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、界面活性剂等稀释剂，或是加入其他类型的赋形剂。

口服用液态制剂的形式包括悬浮液、溶液(糖浆、饮料等)、乳剂等。除了可以添加水或液态石蜡等最常用的稀释剂以外，也可额外添加湿润剂、增甜剂、调味剂以及防腐剂。口服用固态制剂的形式包括锭剂、药丸、粉末、颗粒、胶囊、糖锭等。

非经肠给予用制剂的形式包括无菌溶液、非水性溶液、悬浮液、乳剂、冷冻干燥剂等。非水性溶液用溶剂、悬浮液或乳剂所使用的溶剂包括但不限于蔬菜油、丙二醇、聚乙二醇、橄榄油及油酸乙酯。

一般而言，这些制剂是通过将至少一种赋形剂加入前述粉碎颗粒或水性萃出物中，必要时加以干燥，然后再进行造粒、打锭或囊封而制备出来。所述赋形剂包括但不限于水、具有1至4个碳原子的低级醇类、天然油或合成油、胶凝剂、助悬剂、乳化剂、增稠剂、惰性粉末、天然和合成的聚合物、湿润剂、增甜剂、调味剂、芳香剂、香料、着色剂，防腐剂、润滑剂、介面活性剂。较佳的赋形剂包括但不限于水、乙醇、淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶、树胶类、糊精、环糊精、微晶性纤维素、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠等。此外，除了单纯地添加赋形剂以外，还可加入例如硬脂酸镁、滑石等润滑剂。

因此，本申请所揭露的一方面为一种冬虫夏草组合物，其包含如前所述的台湾冬虫夏草分离株的水性萃出物或是干燥粉碎颗粒，且任选地包含有一可接受的赋形剂。本申请所称“可接受的赋形剂”意指被使用做为本申请冬虫夏草组合物的载体的惰性物质，其对于给予的个体不具有毒性、刺激性、热原性、抗原性及溶血性，而且无实质的药理活性，也不会妨碍本申请冬虫夏草组合物的有益效果的发挥。本申请所揭露的另一方面为一种保健食品，其包含前述的冬虫夏草组合物，以供直接食用、入菜、掺混于饮料、零食、动物饲料、膳食补充品、其他中草药材等各种可食性材料中，或是包装成其他适合服用的形式，例如将前述干燥粉碎颗粒以茶袋包装成茶包形式以供冲泡饮用。在一较佳具体例中，本申请所揭露的冬虫夏草组合物可以搭配来自于其他虫草物种的组合物，例如搭配来自于西藏冬虫夏草及/或蛹冬虫夏草的子实体或菌丝体组合物，从而调配成适合个体摄取且能兼顾安全性及有效性的健康食品和医药品。

在另一较佳具体例中，本申请的冬虫夏草组成物主要由如前所述的台湾冬虫夏草分离株的水性萃出物或是干燥粉碎颗粒及前述可接受的赋形剂所组成。此处所称「主要由…所组成」意指所记载的成分组合中不排除另外含有实质上不会影响水性萃出物或是干燥粉碎颗粒的性质的其他没有述及的结构组成部分。在另一较佳具体例中，本申请的冬虫夏草组成物仅由前述台湾冬虫夏草分离株的水性萃出物或是干燥粉碎颗粒及前述可接受的赋形剂所组成。

下列实例仅供用于例示，而非意欲限制本发明的范围。实例中所显示的所有数据皆经由至少三个独立实验来完成，且以平均值±标准差表示的。统计学分析是利用单因子变异数分析(ANOVA)再进行杜凯氏测验(Tukey’s test)来完成，并通过实例中所述方式判定其显著性。

实例1：分离株的收集和微形态镜检维持

本申请所揭露的台湾冬虫夏草分离株是在2013年8月在台湾桃园县拉拉山区，于倒伏腐烂树干中的拟步行虫幼虫(Tenebrionoidea)采集而得，因此命名为台湾冬虫夏草分离株O.formosana MUCHO 815。立即拍摄所收集到的样品的影像，如图1A和图1B所示。将样品带回位于台北市的台湾大学应用真菌实验室，在标准去污染程序下将孢子和菌丝体(mycelium)分离出来。

运用冷冻切片技术(cryosection)和复式光学显微镜技术(compoundmicroscopy)来进行镜检。运用配于磷酸盐缓冲化生理食盐水(PBS)中的4％甲醛溶液，将样品予以固定，历时1天，期间更换溶液一次。将样品置入最佳切割温度复合物(optimalcutting temperature compound；OCT)内之后，在一具徕卡CM3050-S型恒冷箱切片机中进行冷冻切片，以获得5微米(μm)至10微米厚的切片。检视各切片，并在一具有配备有佳能-ds126型摄像机(Canon-ds 126 camera)的奥林巴斯BH2型显微镜(Olympus BH2microscope)下取像，如图1C-图1E所示。

图1A-图1E显示，实例1所采集到的台湾冬虫夏草分离株，其子座由寄主的头部或腹部长出。柄呈长柱状，呈橘色，尺寸为10-30毫米×0.5-2毫米，具短毛，无被膜鞘。子座头部呈长椭圆形，尺寸为4-6毫米×1-4毫米。菌丝组织拟薄壁组织状，子囊壳埋生，卵形，呈棕橘色，尺寸为360-480微米×240-320微米。子囊壳孔宽60微米，子囊壳壁厚20微米，埋于40微米厚的菌丝组织下。子囊呈长筒状，基部缢缩，宽6.5-7.9微米，长160-240微米。子囊顶宽3.9-5.3微米，长3.2-4.6微米，铁钟罩状，具狭沟。子囊孢子8个，透明无色，成熟时断裂成次生孢子，次生孢子呈杆状，两端呈截头状，尺寸为2.6-3.0微米×6.5-7.3微米。

实例2：分离株的维持

接着，将分离出来的孢子和菌丝体转移至含有马铃薯右旋糖琼脂(PDA；购自于位在美国密西根州底特律市的Difco公司)或沙氏右旋糖琼脂酵母菌萃出物(S-DAY；购自于位在美国密西根州底特律市的Difco公司)的培养皿中，并在25℃下予以培植。每隔3-4周采收菌落一次。先在55℃下将所采收到的菌落加以干燥至隔日，再将其储存在干燥器(desiccator)中，供后续分析或制作萃出物之用。将含有菌丝体的小块琼脂经常性地转移至新的PDA或S-DAY培养基中，以维持这个台湾冬虫夏草分离株的培养。

如图1F至图1G所示，本申请所揭露的台湾冬虫夏草分离株在马铃薯右旋糖琼脂培养基上的菌落呈橘色至白色，呈褥垫状至钮扣状，白色菌丝，且外表带有小水珠。其无性型似中华被毛孢(Hirsutella)，生成分生孢子的细胞为单生、透明，呈安瓿形(尺寸为1.5-2.3×8.6-17.0微米)。分生孢子透明呈圆柱形(尺寸为1.6-2.3×3.6-6.9微米)。

综合实例1、2所示观察结果，本申请所揭露的虫草分离株在巨观和微观形态上皆与先前所发现的其他台湾冬虫夏草菌株相同，显示其确为台湾冬虫夏草分离株。

实例3：虫草基因体DNA的萃取

虫草基因体DNA的萃取方法是参照杜尔等人所发表的文献再进行修攺((Doyleand Doyle 1990))。简单来说，真菌样品来自于直接切下虫草的子座(stroma)和菌柄(stalks)，或是来自于在培养皿中采取菌丝体。将收集到的样品加以冷冻干燥，再加入500微升热的溴化十六烷基三甲铵(Cetyltrimethyl ammonium bromide；CTAB)缓冲液(2％CTAB、1.4M NaCl、20mM EDTA、酸碱值为8.0的100mM Tris、2％PVP-40)和新鲜的3微升2-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)，以磨杵加以磨碎。在60℃下培育20分钟后，添加500微升CI(氯仿：异戊醇＝24:1)，并温和地混合10分钟，再于13,200g下予以离心2分钟。将上清液(supernatant)小心地转移至一个新的离心小管(eppendorf)中，再添加0.6倍体积的异丙醇。接着，在-20℃下将混合物予以培育30分钟，使DNA沉淀析出。通过在13,200×g下离心30分钟来收集DNA，并以75％冰冷乙醇洗涤一次，加以真空干燥，并使其再悬浮于50微升的二次去离子水中。

实例4：DNA的扩增和定序

运用聚合酶链锁反应(PCR)来进行特定片段的扩增，如下文所述。大致来说，PCR反应混合物在25微升的总体积中，含有2.5微升10X反应缓冲液、1微升的10μM各个特定引子(primer)、0.5微升的10mM dNTPs、2微升模版DNA，和0.3微升1U Taq聚合酶(购自于位在美国印地安纳州的Boehringer-Mannheim公司)。运用正向引子cRPB1(序列识别号：第1号)和反向引子RPB1c-r(序列识别号：第2号)(Castlebury等,Mycol.Res.108,p.864-872(2004))，且遵循下列步骤来扩增rpb1序列：在95℃下进行变性(denaturation)5分钟，再进行由95℃历时1分钟、55℃历时1分钟和72℃历时1分钟所组成的40个循环，随后在72℃下进行额外的延长步骤，历时10分钟。运用正向引子fRPB2-5f(序列识别号：第3号)和反向引子fRPB2-7cr(序列识别号：第4号)(Liu等,Mol.Biol.Evol.16,p.1799-1808(1999))，且遵循下列步骤来扩增rpb2序列：在95℃下进行变性5分钟，再进行由95℃历时50秒、55℃历时1分钟和72℃历时90秒所组成的40个循环，随后在72℃下进行10分钟的额外延长步骤。运用正向引子EF1-2218R(序列识别号：第5号)和反向引子EF1-983F(序列识别号：第6号)(Rehner,S.A.,Buckley,E.,Mycologia 97,84-98(2005))，且遵循下列步骤来扩增EF1-α序列：在94℃下进行变性5分钟，再进行由94℃历时1分钟、46℃历时30秒和72℃历时2分钟所组成的40个循环，并在72℃下进行7分钟的额外延长步骤。使PCR产物接受电泳分析并将其洗提出来，以供利用ABI 3730XL系统(美国加州应用生物系统公司)进行定序。接着，利用ContigExpress of Vector

软体(美国加州Invitrogen公司)来拼接和修整所得到的序列。

依据上述方法，获得了本申请所揭露的台湾冬虫夏草分离株的RPB1、RPB2和EF1-α基因的核苷酸序列，它们分别具有790个、1062个和1068个核苷酸。利用所获得的序列在NCBI资料库中进行blast搜寻，综合考量三个序列，与本申请所揭露的台湾冬虫夏草分离株最为相近的前三名是台湾冬虫夏草分离株TNM F 13893、大团囊虫草分离株CBS 100239(Elaphocordyceps ophioglossoides CBS 100239)和台湾冬虫夏草分离株TNM F 13893，分别享有99％(676/679)、89％(939/1061)和99％(847/849)的序列相同性。就RPB2来说，虽然最为相近的并不是台湾冬虫夏草，但本申请所揭露的台湾冬虫夏草分离株的RPB2序列仍然与台湾冬虫夏草分离株TNM F 13893享有100％的相同性，且具有47％的涵盖度。这些结果显示，在分子层级上，本申请所揭露的台湾冬虫夏草分离株与现有台湾冬虫夏草分离株TNM F 13893属于同一物种，如下表1所示。

表1.

实例5：系统发生学的分析

各虫草菌株的RNA聚合酶Ⅱ(RPB1,RPB2)的最大和第二大次单元以及转译延长因子1α(EF1-α)等三个基因的核苷酸序列，是遵循宋等人发表的文献(Sung等,Mol.Phylogenet.Evol.44,p.1204-1223(2007))中所叙述的要件，或是通过蛹冬虫夏草分离株CM01的全基因体直系同源基因(orthologs)BlastN(Basic Local Alignment SearchTool Nucleotide)测序工具，而得自于本申请所揭台湾冬虫夏草分离株的PCR定序产物，或是得自于美国国家生物技术资讯中心(NCBI)的资料库。总共有51个物种/分离株被囊括在本实例所载研究中。运用分子演化遗传分析软体第6.0版(MEGA 6.0；网址：http://www.megasoftware.net)，将这三组基因的核苷酸序列予以连锁及比对。运用CIPRES入口网站中所架设的RAxML blackbox网页(RAxML 7.2.7；网址：http://embnet.vital-it.ch/raxml-bb)来分析比对完成的序列，以搜寻最近似的系统发生树。储存所获得到系统发生树，并运用

图形设计软体绘制成图。

最可能的系统发生树建构于图2，其树形与宋等人所发表的文献(Sung等,Mol.Phylogenet.Evol.44,p.1204-1223(2007))非常一致，而且台湾冬虫夏草这个物种位于线虫草科(Ophiocordycipitaceae)此一分支，而非位于虫草科(Cordycipitaceae)或狭义麦角菌科(Clavicipitaceae s.s.)此二分支。同理，本申请所建构的系统发生树显示，台湾冬虫夏草和西藏冬虫夏草的关系紧密，而蛹冬虫夏草则位于虫草科。据此，本申请所揭露的台湾冬虫夏草分离株与现有台湾冬虫夏草分离株在系统发生上属同一分支，属于同一物种。而且，依据本申请所建构的系统发生树，台湾冬虫夏草的学名应由原先的Cordycepsformonsana修改成为Ophiocordyceps formosana。

实例6：虫草萃出物的制备和HPLC分析

以下各实例中所使用的蛹冬虫夏草的菌丝体和子实体是得自于台湾慕求生技股份有限公司。西藏冬虫夏草的菌丝体和子实体则购自于北京同仁堂国药有限公司。台湾冬虫夏草分离株的菌丝体得自于实例2。

运用一具均质机在1300rpm的运转速度下将经干燥的虫草样品加以粉碎，并在室温下储存于控湿型干燥器中，以供后续进行高性能液相层析(日立D-2000型HPLC管理系统)，分析这些虫草样品中的次生代谢物(de novo secondary metabolites)。虫草萃出物是依据下文所叙述的标准作业流程进行制备。简单来说，在一个50毫升

离心管(购自于美国Becton Dickinson and Company)中，以固体相对于溶剂的比例为1：40的条件，使1克虫草粉末溶入去离子水中，并施以振荡30秒。接着，使50℃热水回流2小时来进行萃取作业(前30分钟另施加超音波振荡)。经过在4000rpm(约3200×g)下加以离心20分钟后，收集上清液，并通过0.22微米孔径的滤器进行过滤。所得到的萃出物可直接进行HPLC分析，或是储存在-20℃下供实例7至10的后续实验用。

高性能液相层析是在RP-18管柱(150252

STAR RP-18 endcapped(5μm)

250-4；Merck)中进行，流速为每分钟1毫升。流动相的组成为20％甲醇/H₂O。D-甘露醇、腺苷和虫草素等三种成份是在260nm下运用二极体阵列感测仪(DADdetector)进行检测。结果显示于图3A-图3F。

如图3A-图3F所示，本申请所揭台湾冬虫夏草分离株O.formosana MUCHO 815的化学总成与西藏冬虫夏草和蛹冬虫夏草极为类似，意味着本申请所揭台湾冬虫夏草分离株的生化特性理应与现有的广义虫草属物种/分离株相似。此外，将各虫草萃出物样品的HPLC图谱中对应于D-甘露醇、腺苷和虫草素标准品的波峰面积加以测量，以就D-甘露醇、腺苷和虫草素等三种虫草特有代谢物的含量进行比较(r²>0.999)，结果显示于下表2。表2的数据指出，本申请所揭台湾冬虫夏草分离株也含有与现有的广义虫草属物种/分离株相当甚至略高的代谢物含量。

表2.虫草特有物质的定量分析

实例7：细胞培养和MTT分析

MTT分析是用于测量虫草萃出物在抑制人类癌细胞增殖上的能力。在每个井孔含有200微升培养基的96井孔培养皿中，每一井孔中接种约5×10³个细胞，经过24小时后再进行处理。经暴露于各种浓度的指定虫草萃出物历时96小时后，加入20微升噻唑蓝溴化四唑(MTT；购自于美国密苏里州Sigma-Aldrich Corp.，型录编号：M2128)溶液，并将细胞加以培育4小时。运用一具光谱仪(

190UV-Vis Microplate,Molecular Devices,USA)测量570nm下的吸光值来测定细胞增殖情形。此测量重复三次。细胞存活百分率是以下式计算而得：(样品OD_570nm/空白试样OD_570nm)×100(％)。

在本实例中，使用参照实例6所载流程所制得的台湾冬虫夏草分离株的菌丝体、西藏冬虫夏草和蛹冬虫夏草的热水萃出物，以不同浓度来处理各式各样的人类癌细胞株，例如A549肺癌细胞株、MDA-MB-231乳癌细胞株、Huh7肝癌细胞株和HL-60白血病细胞株。如图5A所示，台湾冬虫夏草分离株O.formosana MUCHO 815的萃出物(标注为OF_MY)成功地展现出显著的癌细胞抑制能力，且对于A549细胞具有1.0毫克/毫升的半抑制浓度(IC50)、对于MDA-MB-231细胞具有0.53毫克/毫升的IC50、对于Huh7细胞具有0.44毫克/毫升的IC50，以及对于HL-60细胞具有0.19毫克/毫升的IC50。相比于西藏冬虫夏草和蛹冬虫夏草的菌丝体萃出物(OS_MY和CM_MY)所得到的抑癌活性，台湾冬虫夏草分离株O.formosana MUCHO 815的萃出物(OF_MY)展现出更强的癌细胞抑制效果。而且，其抑制所有受测癌细胞株的能力甚至与西藏冬虫夏草的子实体萃出物(OS_MY)相当。各虫草萃出物在抗癌活性上的IC₅₀值如下表3所示。

表3.各虫草萃出物在抗癌活性上的IC₅₀值

细胞株(IC<sub>50</sub>)	OF<sub>MY</sub>	CM<sub>FB</sub>	CM<sub>MY</sub>	OS<sub>FB</sub>	OS<sub>MY</sub>
						A549	1.00±1.09	0.28±0.06	1.70±0.21	1.31±0.62	0.54±0.57
MDA-MB-231	0.53±0.15	0.20±0.09	0.85±0.08	2.75±0.11	6.86±0.06
						HUH7	0.44±0.16	0.01±0.01	0.44±0.13	2.68±0.11	1.16±0.43
HL-60	0.19±0.13	0.07±0.01	0.72±0.17	0.32±0.15	1.14±0.15

本申请发明人又意外地发现，相比于其他虫草萃出物，台湾冬虫夏草分离株O.formosana MUCHO 815的萃出物对于正常细胞，包括HCEC正常人类角膜上皮细胞和MCF10A正常人类乳腺上皮细胞(购自于美国典型培养物保藏中心(ATCC))，展现出最低的毒性(细胞存活率超过90％)，如图5B所示。特别值得注意的是，人类角膜上皮细胞对于毒性物质和刺激性物质极为敏感，经常被使用来检验物质的毒性，而本实例显示，台湾冬虫夏草分离株O.formosana MUCHO 815的萃出物对于人类角膜上皮细胞完全不具毒性。此外，小鼠以每公斤体重5克的用量喂食以台湾冬虫夏草菌丝体14天后，牺牲小鼠并观察其组织/器官切片，并没有发现任何明显损伤或生化变化(数据未揭示)。本实例的结果指出，本申请所揭台湾冬虫夏草分离株可以在不对正常细胞造成伤害的情况下，选择性地抑制癌细胞的增殖，故相比于现有虫草具有更高的药用潜力。

实例8：DPPH抗氧化分析

通过以激烈手段混合等量的虫草萃出物和2,2-二苯基苦基肼水合物(2,2-diphenyl-picrylhydrazyl hydrate；DPPH)溶液(0.1mM，配于甲醇中)，将DPPH自由基加以清除。接着在室温下培育50分钟，再于517nm下运用一具光谱仪(

190UV-VisMicroplate,Molecular Devices,USA)进行检测。清除活性是通过比较仅含有DPPH和溶剂的空白试样(设定为100％)来进行测定。清除活性百分率是以下式计算：(样品OD_517nm/空白试样OD_517nm)×100(％)。

如图5A所示，相比于西藏冬虫夏草和蛹冬虫夏草的菌丝体萃出物(分别标注为OS_MY和CM_MY)，本申请所揭台湾冬虫夏草分离株的菌丝体的热水萃出物(OF_MY)明显展现出更为优越的抗氧化能力。而且，如图5B所示，其抗氧化能力甚至与西藏冬虫夏草的子实体萃出物(OS_FB)相当。

实例9：活性氧(ROS)清除分析

在一个12井孔培养皿中，每一井孔中接种约5×10⁴个CHO-K1细胞(购自于美国典型培养物保藏中心(ATCC))，并在16小时血清饥饿处理后，再暴露于指定虫草萃出物，历时1小时。在本实例中，以10mM N-乙酰半胱胺酸处理做为正对照组。以H₂O₂(1800M)处理5分钟后，在暗室条件下使细胞与萤光探针CM-H2DCFDA(美国加州Invitrogen公司)共同培育于一个37℃培育箱中。最后，以胰蛋白酶处理细胞使细胞脱离培养皿，再运用一具BDFACSCanto^TM流式细胞仪(购自于美国B.D.Biosciences)在525nm下检测二氯萤光素(DCF)的位准，进而推算出活性氧的含量。

如图5C所示，相比于西藏冬虫夏草和蛹冬虫夏草的菌丝体萃出物(分别标注为OS_MY和CM_MY)，本申请所揭台湾冬虫夏草分离株的菌丝体的热水萃出物(OF_MY)明显展现出更为优越的抗氧化能力。值得注意的是，其抗氧化能力亦与西藏冬虫夏草和蛹冬虫夏草的子实体萃出物(OS_FB和CM_FB)相当，如图5D所示。

实例10：裸鼠肿瘤动物模型

为了进一步研讨台湾冬虫夏草的抗肿瘤生成活性，本实例建立了一个异种移植小鼠模型(xenograft mouse model)。经由皮下注射，将5×10⁶个MDA-MB-231人类乳癌细胞接种在9只10周龄裸鼠(BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu/CrlNarl)的左大腿内。10天后，肿瘤已长大到可藉由以手触摸而察觉其存在，随即开始灌食处理。将这些裸鼠分成三组，分别灌食以1倍量台湾冬虫夏草分离株O.formosana MUCHO 815的热水萃出物(浓度为25毫克/毫升，每日灌食100微升；以1×OF_MY标示组别)、5倍量台湾冬虫夏草分离株O.formosana MUCHO 815的热水萃出物(浓度为125毫克/毫升，每日灌食100微升；以5×OF_MY标示组别)，以及对照组(仅灌食100微升PBS)。每隔4日测量并记录肿瘤尺寸，即肿瘤尺寸＝0.4×肿瘤长度×(肿瘤宽度)²，其结果显示于图6A。处理20天以后，将肿瘤的影像照相留存，如图6B所示。

从图6A和图6B可以观察到，相较于对照组，1×OF_MY组和5×OF_MY组以剂量相依方式降低了肿瘤的尺寸，这证实了台湾冬虫夏草分离株O.formosana MUCHO 815能够于活体内展现出优越的抗肿瘤生成活性。

虽然本发明已被详细描述于说明书中，但在本发明精义和范围内的各种修改和变化对于本领域技术人员而言属于明显。基于前述的揭露内容，相关技术中的知识以及在发明背景和发明的详细叙述中所讨论到的参考文献的揭露内容完全地被纳入于此作为参考。

Claims

1.一种台湾冬虫夏草Ophiocordyceps formosana分离株，其是以BCRC 930172的寄存编号被寄存在中国台湾食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)，以及以DSM 32000的寄存编号被寄存在德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen；DSMZ)。

2.一种冬虫夏草组合物，其包含根据权利要求1所述的台湾冬虫夏草分离株的水性萃出物，任选地包含有一可接受的赋形剂，其中所述台湾冬虫夏草分离株的水性萃出物是通过将台湾冬虫夏草的菌丝体加以粉碎，以温度为40-60℃的热水回流萃取台湾冬虫夏草的菌丝体，历时30分钟至12小时，再去除固体部分而制备出来。

3.一种冬虫夏草组合物，其包含根据权利要求1所述的台湾冬虫夏草分离株的干燥粉碎颗粒，任选地包含有一可接受的赋形剂。

4.一种根据权利要求1所述的台湾冬虫夏草分离株的用途，其供用于制造一用来在一个体中治疗活性氧相关性疾病的医药品。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述台湾冬虫夏草分离株所呈现的形式是根据权利要求2-3中任一项所述的台湾冬虫夏草组合物。

6.根据权利要求4所述的用途，其中所述活性氧相关性疾病是选自于由白内障、糖尿病、阿兹海默症、心脏病、发炎、癌症、雄性不孕性、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化症、帕金森氏症和老化所组成的群组。

7.根据权利要求4所述的用途，其中所述活性氧相关性疾病是癌症。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述癌症是选自于由肺癌、头部和颈部的鳞状细胞癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、子宫颈癌、食道癌、膀胱癌、胰脏癌、脑癌、肝癌、大肠癌、直肠癌、皮肤癌、遗传性和散发性乳突肾细胞癌、黑色素瘤、神经胶质母细胞瘤、神经纤维瘤、间皮细胞瘤和骨肉瘤、淋巴癌、白血病和多发性骨髓瘤所组成的群组。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述癌症是选自于由肺癌、乳癌、肝癌和白血病所组成的群组。

10.一种保健食品，其包含根据权利要求2-3中任一项所述的台湾冬虫夏草组合物。