KR20220169108A - 인삼 유래 균주 및 블랙커민 추출물을 이용한 금 나노입자의 제조방법 및 상기 금 나노입자를 포함하는 암 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 쿠르토박테리움 프로이뮨(C. proimmune) K3 균주 및 블랙커민 추출물을 이용하여 금 나노입자를 제조하는 방법 및 상기 금 나노입자의 암 치료 용도에 관한 것이다.

Description

인삼 유래 균주 및 블랙커민 추출물을 이용한 금 나노입자의 제조방법 및 상기 금 나노입자를 포함하는 암 치료용 약학 조성물 {METHOD FOR PRODUCING GOLD NANOPARTICLE USING STRAIN FROM GINSENG AND NIGELLA SATIVA EXTRACT AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING CANCER COMPRISING THE GOLD NANOPARTICLE}

본 발명은 인삼 유래 신규 균주 및 블랙커민 추출물을 이용한 금 나노입자의 제조방법 및 상기 금 나노입자의 암 치료 용도에 관한 것이다.

외과절제술, 화학요법, 방사선요법과 같은 다양한 암 치료법에도 불구하고 위암 (gastric cancer; GC)은 예후가 좋지 않은 치명적인 악성 종양 중 하나로 5년 내 생존율이 25-35%에 그치고 있다. 위암을 치료하기 위해 새로운 치료법들이 도입되고 있지만, 새로 발견되는 케이스의 치료에는 큰 진전을 보이지 못하고 있다. 따라서, 위암 극복을 위한 새로운 전략이 요구되고 있으며, 이에 따라 항암 효과를 갖는 약용 식물이 대체 약물로서 관심을 받고 있다.

타겟팅 능력을 갖는 나노 약물 수송 시스템은 치료제 및 생약 분야 모두에 적용될 수 있는 다양한 생물학적 특성들을 갖고 있다. 나노테크놀로지는 암세포 관련 단백질, 인공 세포 치료제, 효소 및 유전자의 대안으로서 중요한 역할을 수행한다. 최근 금 (Au), 은 (Ag), 구리 (Cu), 아연 (Zn) 등에 의해 합성된 금속 나노입자가 비독성이고 친환경적인 ‘그린 프로덕트 (green product)’로서 관심받고 있다. 특히, 금 나노입자 (AuNP)는 암 진단 및 암 세포의 표적 치료에서 약물 수송을 비롯한 생체의학 분야에 널리 사용되고 있다. 다른 금속 나노입자에 비해, AuNP는 독성이 적고 합성 시간이 짧은 것으로 알려져 있다. 특히, 식물 추출물 및 박테리아 생체내변환 시스템을 이용한 AuNP의 생합성이 많은 이점을 갖는다. 현재까지, 나노입자를 합성하기 위해 화학적, 물리적, 생물학적, 열적, 전기화학적, 나노화학적 방법 등의 여러 기술이 개발되었다. 그 중에서도, 최근 박테리아, 효모, 방선균, 균류 등의 미생물을 이용한 AuNP의 생물학적 합성이 간단하고 친환경적인 방법으로 많은 주목을 받고 있다. AuNP의 생합성을 위해, Lactococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Enterococcus, Pediococcus, Leuconostocs, Weisella, 및 Saccharomyces와 같은 다양한 박테리아 종이 널리 사용되고 있으나, Curtobacterium 종을 사용한 AuNP의 생합성에 대한 연구는 많지 않다. 최근, 본 발명의 발명자는 전통적으로 발효시킨 한국 인삼(Korean Panax ginseng C.A. Meyer) 음료로부터 신규한 박테리아 균주를 분리하고 16S rRNA 시퀀싱을 통해 이 균주가 쿠르토박테리움 프로이뮨(Curtobacterium proimmune) K3임을 확인하였다 (도 1).

작약속에 속하는 블랙커민(Nigella sativa)은 고대로부터 세계적으로 약용 식물로서 널리 알려져 있다. 블랙커민은 유망한 항암 및 항-증식 활성을 가지며 특히 씨앗 조직에 풍부한 티모퀴논, 티모하이드로퀴논, 티몰, 피넨, p-시멘, 및 디티모퀴논과 같은 여러 생리활성 터페노이드를 포함하고 있다. 특히, 티모퀴논은 블랙커민의 주요 생리활성 구성물질로서 광범위한 약제학적 및 약학적 효과를 갖고 있다.

한국등록특허 제10-1526852호

이에, 본 발명의 발명자는 쿠르토박테리움 프로이뮨(Curtobacterium proimmune) K3 및 블랙커민 씨앗 추출물을 이용하여 신규한 AuNP를 생합성하고, 이를 C. proimmune K3 및 블랙커민 씨앗 추출물 각각 단독으로 사용하여 생합성하였을 때와 비교하여 항암 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 뿐만 아니라, CC-AuNP-처리 암세포에 대하여 암세포에서 자가포식 및 아폽토시스 사이의 근본 메커니즘을 추가 확인하였다.

이에 따라 본 발명은 인삼 유래 균주 및 블랙커민 추출물을 이용하여 금 나노입자를 제조하는 방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 금 나노입자, 상기 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 기능성 건강식품과 이를 이용한 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 기탁번호 KCTC 14591BP로 기탁된 인삼 유래 쿠르토박테리움 프로이뮨(Curtobacterium proimmune) K3 균주를 제공한다.

또한, 인삼 유래 쿠르토박테리움(Curtobacterium) 균주로부터 분리된 막 소포 (membrane vesicle); MAuX₄ (여기서, M은 H, K 또는 Na이고, X는 Cl 또는 Br임)의 수용액; 및 블랙커민 씨앗 추출물;을 반응시키는 것을 포함하는, 금 나노입자의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 금 나노입자를 제공한다.

또한, 본 발명은 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 천연물 유래 성분으로서 생체친화적이고 부작용이 없는 블랙커민 추출물 및 인삼 유래 신규 균주를 이용하여 항암 활성이 우수한 금 나노입자를 생합성한 것으로, 부작용이 적으면서도 효과가 우수한 유망한 암 치료 후보제로서 사용될 수 있다.

도 1은 쿠르토박테리움 프로이뮨(Curtobacterium proimmune) K3의 16S rRNA 서열에 기반한 계통수를 나타낸 것이다. 가지점에 나타낸 부트스트렙 수치는 복제 비율을 나타낸 것이고, 바 0.005는 누클레오티드 위치 당 치환이다.
도 2는 CC-AuNP의 물리화학적 특성화 결과를 나타낸 것이다: (A) 합성된 CC-AuNP의 λmax UV 흡광도. (B) CC-AuNP의 형태학적 특성을 확인하기 위한 TEM 이미지 및 원소 분포 확인을 위한 EDX 스펙트럼. (C) CC-AuNP의 강도 및 부피 분포를 확인하기 위한 DLS 스펙트럼. (D) 결정 구조의 확인을 위한 XRD 스펙트럼. (E) CC-AuNP의 결정 구조를 확인하기 위해 TEM 분석으로 수득한 SAED 이미지. (F) 적외선 흡광 스펙트럼을 생성하여 CC-AuNP에서 화학적 연결을 확인하기 위한 FT-IR 스펙트럼. (G) CC-AuNP 및 블랙커민의 열 안정성 확인을 위한 TGA 결과.
도 3은 정상 세포 및 암 세포에 대한 블랙커민, CC-AuNP, 및 C. proimmune K3의 세포독성 효과를 나타낸 것이다: (A) RAW264.7 마우스 마크로파지; (B) HaCaT 인간 케라티노사이트; (C) AGS 인간 위암 세포. (D) EDF microscopy를 사용하여 확인한 1시간 및 3시간에서 AGS 세포로의 CC-AuNP의 세포 유입. 컬럼의 별표는 실험한 각 샘플 및 비처리 대조의 유의차를 나타낸다. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001. ns, not significant.
도 4A는 Hoechst 및 프로포피디움 아이오다이드 (PI) 염료로 염색한 AGS 세포의 형광 현미경 이미지이다. 노란색 화살표는 응축된 염색질을 갖는 분열된 핵을 나타낸 것이며, 결과는 Image J software를 사용하여 정량하였다. 도 4B는 AGS 세포에서 p53, Bax, Bcl2, 시토크롬 c, 카스파제 9, 및 카스파제 3을 포함하는 아폽토시스 관련 유전자의 발현에 대한 CC-AuNP의 효과를 나타낸 것이다. 시스플라틴은 양성 대조로서 사용하였다. 각 유전자의 발현 수준은 qRT-PCR로 결정하였다. 컬럼의 별표는 실험한 각 샘플 및 비처리 대조의 유의차를 나타낸다. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001.
도 5는 AGS 세포에서 p53, Bax, Bcl2, 시토크롬 c, 카스파제 9, 및 카스파제 3을 포함하는 아폽토시스 관련 단백질의 발현에 대한 CC-AuNP의 효과를 나타낸 것이다: (A) 각 단백질의 웨스턴 블롯팅 이미지 및 (B) Image J software에 의한 정량 결과. 시스플라틴은 양성 대조로서 사용하였다. 각 단백질의 발현 수준은 qRT-PCR로 결정하였다. 컬럼의 별표는 실험한 각 샘플 및 비처리 대조의 유의차를 나타낸다. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001.
도 6A는 Mito-Tracker, Mito-SOX, 및 ROS로 염색된 AGS 세포의 미토콘드리아 형태의 형광 현미경 이미지 및 Image J software에 의한 정량 결과를 나타낸 것이다. 도 6B는 PINK1 및 Parkin을 포함하는 자가포식-관련 유전자의 발현에 대한 CC-AuNP의 효과를 나타낸 것이다. 도 6C는 AGS 세포에서 세포내 발현 평가를 위한 웨스턴 블롯팅 이미지를 나타낸 것이다. 도 6D는 Image J software에 의한 정량 결과를 나타낸 것이다. 컬럼의 별표는 실험한 각 샘플 및 비처리 대조의 유의차를 나타낸다. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001.
도 7은 AGS 세포에서 LC3, Beclin-1, p62, 및 카스파제 8을 포함하는 자가포식 관련 (A) mRNA 및 (B) 단백질의 발현에 대한 CC-AuNP의 효과를 나타낸 것이다. 컬럼의 별표는 실험한 각 샘플 및 비처리 대조의 유의차를 나타낸다. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001.
도 8은 라파마이신 (Rapa)-유도 AGS 세포에서 자가포식 (LC3, Beclin-1, p62, 및 카스파제 8) 및 아폽토시스 (Bax, Bcl2, 시토크롬 c, 카스파제 9, 및 카스파제 3)과 관련된 mRNA 및 단백질의 발현에 대한 CC-AuNP의 효과를 나타낸 것이다: (A) 및 (C-D) LC3, Beclin-1, p62, 및 카스파제 8을 포함하는 단백질. Determination of Bax, Bcl2, 시토크롬 c, 카스파제 9, 및 카스파제 3을 포함하는 자가포식-관련 (E) mRNA 및 (F-G) 단백질의 결정. 컬럼의 별표는 비처리 대조 및 CC-AuNP 또는 Rapa 사이의 유의차를 나타낸 것이다. 컬럼의 # 표시는 Rapa 및 CC-AuNP+Rapa 사이의 유의차를 나타낸 것이다. 컬럼의 & 표시는 Rapa 및 CC-AuNP+Rapa 사이의 유의차를 나타낸 것이다. * or # or &, p<0.05, ** or ## or &&, p<0.01, *** or ### or &&&, p<0.001.
도 9는 CC-AuNP 생합성을 위해 다양한 조건을 실험한 결과를 나타낸 것이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.

따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 기탁번호 KCTC 14591BP로 기탁된 인삼 유래 쿠르토박테리움 프로이뮨(Curtobacterium proimmune) K3 균주에 관한 것이다.

상기 쿠르토박테리움 프로이뮨(Curtobacterium proimmune) K3 균주는 전통 발효 인삼 음료로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 인삼 유래 쿠르토박테리움(Curtobacterium) 균주로부터 분리된 막 소포 (membrane vesicle); MAuX₄ (여기서, M은 H, K 또는 Na이고, X는 Cl 또는 Br임)의 수용액; 및 블랙커민 씨앗 추출물; 을 반응시키는 것을 포함하는, 금 나노입자의 제조방법에 관한 것이다.

상기 MAuX₄의 수용액은 본 분야에서 사용되는 물질이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, HAuCl₄·3H₂O일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 쿠르토박테리움 균주는 발효된 인삼으로부터 분리된 쿠르토박테리움 프로이뮨(Curtobacterium proimmune) K3 (KCTC14591BP) 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 쿠르토박테리움 균주의 농도는 1×10¹ 내지 1×10⁵ cells/mL, 예를 들어 1×10³ cells/mL일 수 있으며, 상기 MAuX₄의 농도는 1 내지 5 mM, 예를 들어 3 mM일 수 있고, 상기 블랙커민 씨앗 추출물의 농도는 0.25 내지 2 mg/mL, 예를 들어 1 mg/mL일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 반응은 6.0 내지 10.0, 예를 들어, 7의 pH 하에서 12 내지 48시간, 예를 들어 36시간 동안 실시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 블랙커민 씨앗 추출물은 블랙커민 씨앗을 적절한 용매로 추출한 것으로, 상기 추출하기 위한 적절한 용매는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 추출 용매로서 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 클로로포름, 디에틸 에테르, 디클로로 메탄, 헥산, 에테르, 벤젠, 메틸렌 클로라이드, 및 시클로헥산 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 블랙커민 씨앗 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 금 나노입자에 관한 것이다.

상기 금 나노입자는 20 내지 50 nm의 직경을 갖는 다각형 또는 타원형의 입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 암은 위암, 대장암, 유방암, 신장암, 폐암, 자궁경부암, 난소암, 방광암, 간암 또는 췌장암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 암의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 암의 발달을 저지시킴,

(2) 암의 확산을 예방함,

(3) 암을 경감시킴,

(4) 암의 재발을 예방함 및

(5) 암의 증상을 완화함(palliating)

상기 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이나 식품 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 금 나노입자는 조성물물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있으며, 본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 금 나노입자를 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 금 나노입자 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 암 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 금 나노입자를 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 금 나노입자를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 금 나노입자를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 금 나노입자와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 금 나노입자와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

또한 본 발명은 개체에게 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 예를 들어, 인간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 톱니모자반 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01㎎/kg~100㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예>

물질

DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), FBS (fetal bovine serum), 페니실린-스트렙토마이신 (PS)은 GenDEPOT (Katy, TX, USA)에서 구입하였다. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), dimethyl sulfoxide (DMSO), Hoechst 33258, 금 (III) 클로라이드 트리하이드레이트 (HAuCl_4·3H₂O)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 블랙커민 씨는 Coimbatore (Tamil Nadu, India)의 로컬 마켓에서 구입하였다. 프로포피디움 아이오다이드 용액(PI)은 Invitrogen (ThermoFisher Scientific, Rockford IL, USA)에서 구입하였다. Bax, Bcl2, 카스파제 3, 카스파제 8, 카스파제 9, LC3, Beclin-1, β-actin의 일차 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하고, p62/SQSTM1, PINK1, 및 Parkin은 Proteintech (Chicago, USA)에서 구입하였다. anti-mouse/rabbit IgG for IP (HRP)의 이차 항체는 Cell Signaling Technology에서 구입하였다. Guaranteed reagent L-cysteine hydrochloride monohydrate는 Samchun chemicals (Seoul, Republic of Korea)에서 구입하였다.

실시예 1. 신규 쿠르토박테리움 프로이뮨 (C. proimmune) K3의 분리, 확인 및 배양

박테리아 세포 용해물 및 막 소포를 나노입자 합성을 위한 카고 (cargo)로서 사용하였다. 박테리아 막 소포를 사용하여 AuNP를 합성하기 위해, 전통 발효 인삼 음료로부터 신규한 균주인 쿠르토박테리움 프로이뮨(Curtobacteriaum proimmune) K3을 분리하였다. 균주 쿠르토박테리움 프로이뮨(Curtobacteriaum proimmune) K3을 전통적으로 발효된 인삼 음료 (Namyangju, Republic of Korea)에서 분리하였다. LB (de Man, Rogosa, and Sharpe) 브로스 및 아가는 BD Biosciences (San Jose, CA, USA)에서 구입하였다. 균주는 German Collection of Microorganisms 및 NCBI 수탁번호 (MW563938)의 세포 배양으로부터 확인하였다. 계통수를 구성하기 위해, 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 Genocell (Daejeon, Republic of Korea)로 분석하고 관련된 분류군을 Genebank 데이터베이스에서 검색하였다. 관련된 분류군 데이터베이스로부터의 Multiple alignment를 클러스터 소프트웨어 및 관련된 분류군이 bootstrap test (1000 replicates)에서 함께 클러스터되는 replicate tree의 백분율을 사용하여 체계화하였다. 진화적 거리는 Kimura 2-parameter method로 계산하고 사이트 당 염기 치환 수의 유닛으로 나타냈다. 계통수는 Mega-X program-using neighbor joining, maximumal parsimony 및 likelihood algorithm (도 1)로 구성하였다. 유형 변이체에 대한 16S rRNA 유전자 서열의 비교는 EZ-Bio edit server를 사용하여 실시하였다. C. proimmune K3을 pH 7.0에서 10.0 g tryptone (BD Biosciences), 0.5 g/L 효모 추출물 (BD Biosciences), 및 염화나트륨 (Sigma-Aldrich)을 포함하는 LB broth (BD Biosciences)에서 배양하였다. 박테리아 배양을 120 rpm의 진탕 인큐베이터에서 24시간 동안 실시하였다. 박테리아 배양 후, 바이오매스를 90분 동안 초음파처리하였다. 또한, 초음파처리된 바이오매스를 4000 rpm에서 15분간 원심분리하여 침전된 펠렛 (막 소포)을 수집하였다. 마지막으로, 막 소포를 1 mM PBS로 꼼꼼히 세척하고, 나노입자를 생물학적 합성하기 위해 PBS에 재현탁하였다.

그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 계통수는 C. proimmune K3가 Curtobacterium oceanosedimentum (ATCC 31317^T)와 98.66 % 및 Curtobacterium herbarum (P420/07^T)와98.31%로 가장 유사함을 보였으며, 16S rRNA 유전사 서열의 C. proimmune K3 NCBI 수탁 번호는 MW563938이다. 수득한 신규 균주인 쿠르토박테리움 프로이뮨(Curtobacteriaum proimmune) K3을 한국생명공학연구원에 2021.06.01.자로 기탁번호 KCTC14591BP로 기탁하였다

실시예 2.

CC-AuNP 의 합성 및 최적화

CC-AuNP의 생합성 방법은 이전에 공개된 문헌의 방법을 약간 변형시켰다. CC-AuNP의 생합성을 최적화하기 위해, 소스의 농도 (금 이온, 블랙커민 씨 추출물, 및 C. proimmune K3) 및 반응 조건 (pH 및 시간)을 다양한 조건으로 실험하였다. 우선, C. proimmune K3 (1×10¹ 내지 1×10⁵ CFU)로부터 분리된 막 소포를 PBS에 재현탁한 후 HAuCl₄ (1-5 mM)및 블랙커민 씨 추출물 (0.25-2 mg/mL). 70% 에탄올(주정)로 상온에서 추출하여 사용하였다. 반응 pH 및 시간은 각각 6-10의 pH 범위 및 0-48 h의 시간 범위로 설정하여 확인하였다. 합성된 CC-AuNP를 수집하고 13000 rpm에서 20분간 여러 번 원심분리하여 세척하였다. CC-AuNP를 다름 실험 전까지 4˚C에서 보관하였다. double beam UV-Vis spectrometer (Optizen POP; Mecasys, Daejeon, Korea)를 사용하여 금속 이온의 환원을 입증하고 300-800 nm 범위에서 스캐닝하여 CC-AuNP의 안정화를 확인하였다.

CC-AuNP 의 물리화학적 특성화

합성된 CC-AuNP의 X-ray diffraction (XRD) 패턴을 1.54 Å CuKα radiation 및 20-80°C 범위의 스캔을 갖는 40 kV, 40 mA powered X-ray diffractometer (D8 Advance, Bruker, Karlsruhe, Germany)를 사용하여 확인하였다. 4,000-500 cm^-1 범위 및 4 cm^-1의 해상도의 fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 CC-AuNP 표면 상에 캡핑된 기능기들을 분류하였다. 금 나노입자의 모양 관찰, 원소 맵핑, selected area electron diffraction (SAED), 및 energy-dispersive X-ray spectrometer (EDX) 스펙트럼을 음성 염색 (Nanoprobes, Yaphank, NY, USA)을 사용하여 transmission electron microscopy (TEM, Tecnai G2 Spirit, FEI Company, U.S.A.) 하에서 실시하였다. TEM 분석을 위한 샘플은 현미경으로 옮기기 전에 물에 분산된 정제 나노입자의 액적을 탄소-코팅된 구리 그리드 상에 위치시킨 후 실온에서 건조시켜 제조하였다. dynamic light scattering (DLS) particle analyzer (Otsuka Electronics, Shiga, Japan)를 이용하여 나노입자의 크기 및 분산 성질을 확인하였다. CC-AuNP의 표면 상에 그래프트된 폴리머의 양 및 블랙커민의 열 안정성을 30-600°C에서 thermogravimetric analysis (TGA)로 측정하였다.

CC-AuNP 생합성을 위해 다양한 조건을 실험하였으며 그 결과를 도 9에 나타냈다. 블랙커민 씨 추출물의 농도, 합성 시간, 금 염(Au)의 농도, 반응 시간 및 pH와 같은 다양한 조건을 실험한 결과로부터 CC-AuNP 합성을 위한 최적의 조건을 확인하고 표 1에 나타냈다. 대표 FT-TEM 이미지는 다각형 또는 타원형의 CC-AuNP가 20-50 nm의 입자 크기를 가짐을 보인다 (도 2A). EDX 스펙트럼은 각각 금 및 구리에 해당하는 2.1 및 8 keV에서 광학 흡착의 최고 피크를 보였다 (도 2B). 커퍼(cupper) 그리드는 TEM 구조 분석에 사용된 구리 그리드에 의해 유도될 수 있다. DLS spectroscopy 을 사용한 크기 분포 프로파일은 CC-AuNP의 강도 및 부피 분포가 각각 37-200 nm 및 55-320 nm임을 나타냈다 (도 2C). TEM 및 DLS 둘 다 분자 크기 분석을 위한 목적으로 사용되었지만, 측정의 원리 차이로 인해 상당히 다른 결과를 나타냈다. 결정학적 구조를 결정하기 위해, XRD 및 SAED spectroscopy를 사용하였다. 도 2D 및 2E에 도시된 바와 같이, 38.17°, 44.33°, 64.60° 및 74.59°의 2θ 수치에서 4개의 주요 피크가 나타났으며, 이는 111, 200, 220, 및 311 평면에 해당하는 것으로 Bragg’s reflection의 금 격자 평면의 면심입방 결정 구조를 나타내는 것이다. CC-AuNP의 예상 기능기를 확인하기 위해, 샘플의 FTIR 스펙트럼을 천연 성분의 온라인 데이터베이스 및 인-하우스 FTIR 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 분석하였다. 도 2F에 도시된 바와 같이, 3개의 샘플이 약간 다른 흡광 패턴을 나타냈다. 스펙트럼 라이브러리에 따르면, 3271, 3281, 및 3331 cm^-1에서 관찰된 밴드는 페놀 또는 알코올의 O-H 스트레칭기에 해당한다. 1654cm^-1,1633cm^-1,및 1631 cm^-1에서의 특정 피크는 카르보닐기 및 아민의 C=O 스트레치 및 C=C 알켄 결합에 의한 것으로 생각된다. 비대칭 스트레칭의 약한 밴드 1232 cm^-1 및 1227 cm^-1은 PO₂에 상응하는 것으로 보인다. 0-600℃의 온도 범위에서 폴리머의 열 안정성을 평가하는 TGA 분석에 의하면, CC-AuNP의 중량 손실 (59.46%)은 블랙커민 (81.78%)보다 낮았으며, 이는 CC-AuNP가 PEFE보다 열 안정성이 높음을 입증하는 것이다 (도 2G).

실시예 3. CC-AuNP, 블랙커민 및 C. proimmune K3의 세포독성 효과 비교

세포 배양 및 세포독성 효과 확인

RAW 264.7 (murine macrophage) 및 AGS (인간 gastric adenocarcinoma)를 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)에서, (인간 keratinocyte)는 CLS Cell Line Service (Eppelheim, Heidelberg, Germany)에서 구입하였다. 모든 세포는 10% heat-inactivated FBS 및 1% PS를 함유한 DMEM 1640에서 배양하고 37°C, 5% CO₂/95% air-conditioned humidified incubator에서 유지시켰다. 세포독성 효과를 MTT 분석으로 분석하였다. 모든 세포를 96-웰 플레이트에 1×10⁴ 세포/well의 초기 밀도로 접종하고 안정화시켰다. 24시간 후, 세포를 다른 농도의 블랙커민, C. proimmune K3, 및 CC-AuNP로 처리하였다. 샘플이 없는 배양 배지 및 상업적으로 구입가능한 암의 화학요법 치료제인 시스플라틴 (cisplatin; CAS No. 15663-27-1)을 각각 음성 대조 및 양성 대조로 사용하였다. 샘플을 처리하고 24시간 후에 MTT 용액 (5 mg/mL)을 사용하고 결과적으로 생성된 포르마잔 결정을 100 μL DMSO에 용해하였다. 570 nm에서 microplate reader (스펙트럼Max® ABS plus, San Jose, CA, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.

AGS 세포를 배양 접시에 접종하고 (5×10⁴ cell/well) 24시간 동안 안정화시켰다. 배양 배지를 교체한 후, 세포를 CC-AuNP을 함유한 새로운 배지로 1시간 및 3시간 동안 처리하였다. 배양 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후, 세포를 4 % 파라포름알데히드 용액 (Sigma)으로 고정한 후 고해상도 enhanced dark-field (EDF) microscopic system (Cytoviva, Inc. Auburn, USA)을 사용하여 CC-AuNP의 유입 능력을 시각화하였다.

암 세포에 대한 세포독성 효과를 측정하기 전에, 마우스 마크로파지 RAW264.7 및 HaCaT 세포를 포함하는 일반 세포를 50-300 μg/mL 범위의 투여량으로 일반 세포에 대한 샘플의 세포독성 효과의 확인을 위해 사용하였다. 도 3A 및 3B에 도시된 바와 같이, C proimmune K3는 처리된 모든 농도에서 두 세포 모두에 유의성있는 세포독성을 보이지 않았으며, 블랙커민 및 CC-AuNP는 약간 감소되는 세포 생존율을 보였으나, 대조군에 비해 처리된 모든 농도에서 80% 이상의 생존률을 보였는데, 이는 모든 샘플에서 심각한 독성 효과가 관찰되지 않음을 나타내는 것이다. 세포독성을 보이지 않은 모든 농도에서, AGS 인간 위암 세포에 대한 샘플의 항암 효과를 평가하였다 (도 3C). 그 결과, CC-AuNP은 블랙커민 및 C. proimmune K3에 비해 AGS 세포에 대해 증가된 저해 활성을 보였으며, 이는 블랙커민이 금 나노입자로 전환되었을 때 항암 활성이 증가함을 제시하는 것이다. CC-AuNP가 세포 내로 유입되는지를 확인하기 위해, CC-AuNP 처리 후 EDF microscopy를 이용하여 AGS 세포를 관찰하였다. 그 결과 도 3D에 도시된 바와 같이, 3회 독립된 방식으로 도입 후 CC-AuNP가 세포 내부에 축적되었다. 증가된 밝기는 CC-AuNP 유입의 급격한 증가를 나타내는 것으로, 이는 합성된 CC-AuNP가 세포에 흡착될 수 있음을 제시하는 것이다.

실시예 6.

Hoechst 및 프로포피디움 아이오다이드 (PI) 염색

아폽토시스 세포의 모양 및 수를 정량하기 위해, 샘플을 처리한 AGS 세포를 Hoechst 33258 및 PI로 염색하였다. AGS 세포 (1×10⁵ cells)를 6-웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 안정화시켰다. 배지를 적절한 농도의 샘플을 함유한 새로운 배지로 교체하고 24시간 더 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2회 세척한 후 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정하고, 37^℃에서 30분간 5 μL Hoechst 33258 및 PI 용액으로 각각 염색하였다. Leica DM IRB fluorescence microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)를 사용하여 세포를 관찰하였다.

Mito-Tracker 및 Mito-SOX 염색, 및 ROS 생성

미토콘드리아의 위치를 확인하고 형태 변화를 확인하기 위해, Mito-Tracker Green 염색 시약(Abcam, Cambridge, UK)을 사용하였다. AGS 세포를 샘플로 24시간 동안 처리하고 Mito-Tracker 염색 시약(0.1 M)으로 37°C에서 1시간 동안 염색한 후, PBS로 3회 세척하였다. 세포를 confocal microscopy (TCS SP8 STED; Leica, Wetzlar, Germany)로 관찰하였다. Cellular ROS/superoxide detection assay kit (Abcam)를 사용하여 AGS 세포의 세포내 ROS 및 슈퍼옥사이드 생성을 확인하였다. AGS 세포를 샘플로 24시간 동안 처리하고, 세포내 ROS 및 Mito-Sox를 각각 0.4 μL의 환원 스트레스 검출 (Green) 및 슈퍼옥사이드 검출 (orange) 시약으로 염색하였다. 30분간 추가 인큐베이션한 후 LSM 510 및 510 META laser scanning microscope (Leica)를 사용하여 형광을 측정하였다.

면역형광 염색

AGS 세포 (1×10⁵ cells)를 6-웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 안정화시켰다. 배지를 라파마이신과 함께 또는 없이 CC-AuNP을 함유하는 새로운 배지로 교체하였다. 24시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 0.1% Triton X-100 용액을 사용하여 20분간 투과화시키고 PBS로 세척한 후 PBS 중의 2% 우혈청 알부민으로 1시간 동안 차단하였다. 마지막으로, LC3의 항체를 실온에서 3시간 정도 인큐베이션한 후 fluorescein isothiocyanate (FITC)-접합 이차 항체와 함께 30분간 추가 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 현미경 (Leica)을 사용하여 관찰하였다.

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)

AGS 세포를 세포 배양 접시에 접종하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지를 적절한 농도의 샘플을 함유한 새로운 배지로 교체하고 24시간 동안 더 인큐베이션하였다. PBS로 2회 세척한 후, 총 RNA를 Trizol lysis solution (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포로부터 추출하였다. first-strand synthesis kit (Invitrogen)를 사용하여 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. Quantitative real-time PCR (qPCR)을 SYBR® Green Sensimix plus Master Mix (Quantace, Watford, UK)를 사용하여 실시하였다. 모든 프라이머는 설계하여 Macrogen (Seoul, Republic of Korea)으로부터 공급받았고, 프라이머 서열은 표 2에 나타냈다. 각 반응에서, threshold cycle (Ct)은 식 2^-ΔΔCt로 계산하였다. β-액틴은 하우스-키핑 유전자로서 사용하였다.

웨스턴 블롯팅

AGS 세포를 세포 배양 접시에 접종하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지를 적정 농도의 샘플을 함유한 배지로 교체하고 24시간 동안 더 인큐베이션하였다. PBS로 2회 세척한 후, RIPA lysis buffer (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 세포로부터 총 단백질을 추출하였다. 동량 (50 μg)의 총 단백질을 10% SDS를 함유한 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)로 분리하고 protein gel electrophoresis chamber system (ThermoFisher Scientific)을 사용하여 PVDF (polyvinylidene fluoride membrane; ThermoFisher Scientific)로 옮겼다. 실온에서 2시간 동안 5% 탈지 분유 함유 PBS로 블롯을 차단하고 4℃에서 밤새 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 막을 0.1% tween 20 함유 Tris-buffered saline(TBST)으로 세척한 후 horse radish peroxidase (HRP)-접합 이차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 단백질 밴드를 Enhanced Chemiluminescence (ECL) 시약(ThermoFisher Scientific)으로 시각화시키고 Image J software를 사용하여 정량하였다.

통계 분석

결과는 삼중의 3회의 독립 실험의 평균 ± 표준 편차 (SD)로 나타냈다. 통계학적 계산은 GraphPad Prism 8 (San Diego, CA, USA)을 사용하여 실시하고, 및 유의차는 Student's T-test로 평가하였다. 모든 차이는 p<0.05에서 유의한 것으로 간주하였다.

결과

AGS 세포에서 CC-AuNP 처리에 의한 아폽토시스 시그널링의 증가

일반적으로, 포유동물 세포는 고유 경로 및 외적 경로와 같은 2개의 주요 경로의 아폽토시스를 갖는다. 고유 경로 아폽토시스는 Bcl-2 패밀리를 자극하고 Bax를 분비하여 미토콘드리아 외막 퍼텐셜의 감소를 도모한다. 카스파제 9 및 카스파제 3를 활성화하여 시토크롬을 분비한 후, 아폽토시스는 증가된 글루코스 농도 또는 성장 인자 박탈과 같은 세포 스트레스를 포함한다. 반면에, 외적 아폽토시스 경로는 카스파제 8을 활성화하여 세포내 사망 도메인에서 사망 도메인과 관련된 FAS 어뎁터를 조절하는 FAS와 같은 사망 수용체를 자극하여 발생한다. 블랙커민 또는 CC-AuNP에 의해 유도된 아폽토시스 AGS 세포가 아폽토시스 세포 검출을 위한 Hoechst 및 PI 염료를 사용한 형광 염색에서 관찰되었다. Hoechst- 및 PI-염색 AGS 세포의 현미경 이미지를 도 4A에 나타냈다. 대조 세포에서 일부 형광 변화가 나타났으나, 블랙커민 및 CC-AuNP에서는 투여량-독립적인 방식으로 형광 시그널이 상당히 증가하였으며, 이는 세포 군집에서 아폽토시스 세포가 증가함을 입증하는 것이다. 특히, 블랙커민만 처리한 세포에 비해 CC-AuNP-처리 세포에서 아폽토시스 세포의 상당한 증가가 관찰되었으며, 이는 합성된 CC-AuNP가 블랙커민에 비해 암 아폽토시스를 유도하는데 효과적임을 제시하는 것이다.

종양 억제제 및 아폽토시스 경로에서 중요 요소와 같은 p53의 여러 기능 중, 가장 중요한 역할은 아폽토시스를 유도하는 것이다. 스트레스 시그널로부터 유도된 p53의 활성화가 아폽토시스 및 종양 진행에 관련된 다수의 다운스트림 시그널을 시작하도록 한다는 사실이 널리 알려져 있다. 아폽토시스 유전자 중 하나인 Bcl2는 미토콘드리아 경로에서 프로아폽토시스 유전자 Bax의 불화성화에 따른 미토콘드리아 막 투과성의 조절을 통해 아폽토시스에서 조절 효과를 나타낼 수 있다. Bcl2의 하향조절 후 뒤이은 발현으로, 시토크롬 c가 분비되어 Bax 발현을 통한 미토콘드리아 막 투과성을 증가시킨다. 미토콘드리아에서 시토크롬 c의 분비는 또한 아폽토시스 활성제인 카스파제 9 및 3의 생산을 가능하게 하여, 프로그래밍된 세포사를 야기한다. 그러므로, 금 나노입자로 처리된 AGS 세포에서 아폽토시스-관련 유전자 발현을 확인하고 그 결과를 도 4B에 나타냈다. 결과들은 블랙커민 및 CC-AuNP 처리 둘 다 p53, Bax, 시토크롬 c, 카스파제 9, 및 카스파제 3을 비롯한 아폽토시스-자극 유전자를 상당히 상향 조절시키는 반면, 조절 유전자인 Bcl2는 투여량 의존적으로 하향조절함을 보였다. 이러한 경향은 또한 도 5A 및 5B에 도시된 단백질 수준과 일치한다. 종합하면, 이러한 결과들은 AGS 세포에 대한 블랙커민 및 CC-AuNP의 항증식 활성이 p53, Bax, Bcl2, 시토크롬 c, 카스파제 9, 및 카스파제 3과 관련된 아폽토시스 시그널 경로에 밀접히 연관되어 있음을 입증한다.

CC-AuNP 처리에 의한 미토콘드리아 손상-유도 아폽토시스

일반적으로, 미토콘드리아 손상은 아폽토시스를 비롯한 프로그래밍된 세포사의 초기 단계에서 중요한 역할을 한다. 특히, 미토콘드리아 막 포텐셜 (Δψm)이 감소하면, 상당한 미토콘드리아 기능 장애가 발생하고, 최종적으로 카스파제-유도 아폽토시스가 일어남이 잘 알려져 있다. 따라서, CC-AuNP-유도 세포독성이 미토콘드리아 변화와 관련되었는지를 AGS 세포에서의 형태 변화를 관찰하여 확인하였다. 도 6A는 대표적인 형태 및 이미지에 근거한 형광 강도의 정량 결과를 나타낸 것이다. 미토콘드리아 막 퍼텐셜에 의해 전기영동적으로 이동하는 미토콘드리아-특이 프로브 Mito-tracker를 미토콘드리아의 형태 변화를 관찰하기 위해 사용하였다. 정상 세포에 비해, 블랙커민 또는 CC-AuNP 처리 AGS 세포에서 상당히 증가된 형광 강도뿐만 아니라 분명한 형태 변화가 관찰되었으며, 이는 미토콘드리아의 변화를 제시하는 것이다. 과량의 ROS 생산은 기능성 단백질의 손상, 미토콘드리아의 기능부전, 최종적으로 아폽토시스에 의한 세포 죽음을 유도할 수 있다. 그러므로, 미토콘드리아의 기능 변화를 확인하기 위해 세포 ROS 및 미토콘드리아 ROS 생산을 평가하였다. 블랙커민이 처리된 세포는 정상 세포에 비해 세포 및 미토콘드리아 ROS 생산이 상당히 증가하였으며, CC-AuNP 처리된 세포는 세포 및 미토콘드리아 ROS 생산이 더 많이 증가하였는데, 이는 CC-AuNP가 미토콘드리아 손상 및 더 나아가 붕괴를 유도할 수 있음을 제시하는 것이다.

한편, 최근 연구에서 아폽토시스 및 자가포식이 프로세스에서 상당한 차이가 있지만 조절경로는 밀접히 연관되어 있으며, 뿐만 아니라 가끔 다른 프로세스에도 불구하고 동일한 조절제를 공유할 수도 있음이 밝혀졌다. 많은 시그널 경로 중에서, 외막 복합체인 PINK1/Parkin-매개 경로가 자가포식의 주요 경로 중 하나로 여겨지고 있다. 이전의 여러 연구에서 PINK1 및 Parkin의 상향조절이 미토콘드리아 손상 후 자가포식을 활성화하는데 주요 역할을 함이 입증되었다. mRNA 및 단백질의 발현 수준을 도 6B-6D에 나타냈으며, 이는 PINK1 및 Parkin이 배지(대조) 또는 블랙커민만 처리한 AGS 세포에 비해 CC-AuNP을 처리한 AGS 세포에서 상당히 상향조절됨을 입증한다. 이는 CC-AuNP-유도 세포독성이 미토콘드리아 손상 후 위암 세포의 자가포식 프로세스와 관련되어 있음을 제시하는 것이다.

AGS 세포에서 자가포식 플럭스의 저해를 통한 CC-AuNP-유도 아폽토시시 시그널링

진화론적으로 유지된 자가-소화 과정인 자가포식은 영양 결핍 동안 자가적으로 세포 생존 메커니즘으로서 인지되며, 비폴딩 단백질 및 세포 구성물의 처리를 촉진하여 세포 항상성을 유지하는데 중요하다. 자가포식의 저해는 여러 항암제에 의해 발생하는 아폽토시스를 용이하게 하는 능력이 있는 것으로 보고되었다. AGS 세포에 대한 세포독성에서의 CC-AuNP의 효과가 자가포식 경로와 관련되는지를 추가 연구하였다. 자가포식의 정확한 메커니즘이 아직 완전히 확인되지 않았지만, LC3 및 p62가 자가포식 플럭스를 측정하기 위해 가장 많이 연구되는 바이오마커이다. 한편, Beclin-1은 아폽토시스 및 자가포식 사이의 교차-조절에서 주요 역할을 한다. 특히 카스파제의 촉매 활성에 의해 Beclin-1 절단이 유도되는 환경은 세포성 Beclin-1 수준을 감소시키고, 세포의 자가포식 플럭스를 추가로 저해한다. 그러므로, 본 발명에서는 CC-AuNP가 처리된 AGS 세포에서 유전자 수준 및 단백질 발현으로 LC3b/a, Beclin-1, p62, 및 카스파제 8과 같은 자가포식 플럭스-관련 바이오마커의 활성화를 연구하였다. 도 7A 및 7B에서 볼 수 있는 바와 같이, 블랙커민 또는 CC-AuNP를 세포에 처리했을 때, 비처리 대조 세포에 비해 LC3b/a 및 Beclin-1의 유전자 및 단백질 발현 수준이 상당히 하향조절된 반면, p62 및 카스파제 8은 상당히 축적되었다. 이러한 결과는 CC-AuNP가 처리된 AGS 세포에서 자가포식 플럭스가 억제되고 자가포식의 성숙 상태를 더 진행할 수 없음을 제시한다. 본 발명의 결과는 결함이 있는 자가포식을 갖는 세포에서 여러 단백질, 주로 p62가 상향조절됨을 나타낸 이전 연구결과와 일치하는 것이다.

자가포식-자극 AGS 세포에서 CC-AuNP에 의한 아폽토시스 시그널링의 증가

아폽토시스 및 자가포식 둘 다 두 가지의 형태학적으로 상당히 독특한 모드의 프로그래밍된 세포사이다. 상기 결과에 근거하여, CC-AuNP는 아폽토시스 시그널링을 증가시킬 뿐만 아니라 자가포식을 억제하여 AGS 세포에 대한 세포독성을 자극하는 것으로 보인다. 이를 명확히 입증하기 위해, 세포의 자가포식을 활성화하는 잘 알려진 mTOR의 저해제인 라파마이신으로 자극한 자가포식-유도 AGS 세포에서 아폽토시스 및 자가포식 시그널링 경로 둘 다의 효과를 평가하였다. 우선, 면역조직화학 염색으로 LC3 발현 수준을 확인하였다 (도 8A). 결과는 LC3 수준이 비처리 대조 세포에 비해 라파마이신 처리 세포에서 더 많이 발현하는 반면, CC-AuNP 및 라파마이신이 처리된 세포는 라파마이신 단독 처리 세포에 비해 상당히 감소된 LC3 수준을 보임을 나타냈으며, 이는 CC-AuNP가 자가포식 플럭스에서 중요한 바이오마커인 LC3의 발현을 억제함을 제시한다 (도 8A). LC3b/a, Beclin-1, p62, 및 카스파제 8과 같은 자가포식-관련 바이오마커의 발현 수준은 유전자 및 단백질의 수준으로 평가하였다 (도 8B-8D). 대조 세포에 비해, 라파마이신 처리 세포에서 LC3b/a 및 Beclin-1의 상당히 증가된 mRNA 및 단백질 수준이 관찰된 반면, CC-AuNP 및 라파마이신으로 처리된 세포에서는 라파마이신 단독 처리 세포에 비해 상당히 감소된 mRNA 및 단백질 발현을 보였다. p62 및 카스파제 8의 경우, 이들 지시자의 발현 수준은 반대의 경향을 보였다. 즉, 라파마이신 단독 처리에 의해 자가포식이 유도된 세포에 비해 p62 및 카스파제 8의 상당한 상향조절이 CC-AuNP 및 라파마이신으로 공동 처리된 세포에서 관찰되었다. 뿐만 아니라, Bax, Bcl2, 시토크롬 c, 카스파제 9, 및 카스파제 3과 같은 아폽토시스-관련 바이오마커의 발현 수준을 평가하였다 (도 8E-8G). Bcl2을 제외한 모든 마커의 유전자 및 단백질 발현이 라파마이신 단독 처리에 의해 자가포식이 유도된 세포에 비해 라파마이신 및 CC-AuNP의 공동 자극에 의한 세포에서 상당히 상향조절되었다. 종합하면, 이러한 결과는 CC-AuNP의 처리가 아폽토시스 시그널링을 상향조절할 뿐만 아니라 자가포식-관련 시그널링 경로를 억제하여 항암제로 작용할 수 있음을 보인다.

본 발명은 신규한 균주 C. proimmune K3로부터 분리한 막 소포를 사용하여 미생물 생합성을 통해 블랙커민 씨앗 추출물 및 HAuCl_4·3H₂O으로 신규한 CC-AuNP을 합성하였다. 본 발명의 CC-AuNP는 정상 세포에는 독성 효과를 보이지 않으면서 AGS 위암 세포에는 세포독성 효과를 나타낼 수 있어, CC-AuNP가 안전하게 항암 표적 치료에 사용될 수 있는 가능성을 확인하였다. CC-AuNP의 항암 효과는 과량의 미토콘드리아 ROS 분비와 관련된, Bax/Bcl-2, 및 카스파제 9 및 3과 같은 세포 아폽토시스 경로에 기인한 것이다. 또한, CC-AuNP은 다른 유형의 프로그래밍된 세포사인 자가포식을 상당히 억제하였다. 본 발명은 CC-AuNP가 위암 치료를 위한 신규한 치료제가 될 수 있음을 입증하였다. 뿐만 아니라, 본 발명은 새로운 항암 후보물질을 개발하고 항암 메커니즘을 이해하기 위한 기본 데이터를 제공하고, CC-AuNP 기반의 대체 약물을 개발하는 좋은 시작점이 될 수 있을 것이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원 KCTC14591BP 20210601

Claims (12)

1. 기탁번호 KCTC 14591BP로 기탁된 인삼 유래 쿠르토박테리움 프로이뮨(Curtobacterium proimmune) K3 균주.
2. 인삼 유래 쿠르토박테리움(Curtobacterium) 균주로부터 분리된 막 소포 (membrane vesicle);
   MAuX₄ (여기서, M은 H, K 또는 Na이고, X는 Cl 또는 Br임)의 수용액; 및
   블랙커민 씨앗 추출물;
   을 반응시키는 것을 포함하는, 금 나노입자의 제조방법.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 쿠르토박테리움 균주는 쿠르토박테리움 프로이뮨(Curtobacterium proimmune) K3 (KCTC 14591BP)인 것인, 제조방법.
4. 제 2 항에 있어서,
   상기 쿠르토박테리움 균주의 농도는 1×10¹ 내지 1×10⁵ cells/mL이고, 상기 MAuX₄의 농도는 1 내지 5 mM이고, 상기 블랙커민 씨앗 추출물의 농도는 0.25 내지 2 mg/mL인 것인, 제조방법.
5. 제 2항에 있어서,
   상기 반응은 6.0 내지 10.0의 pH 하에서 12 내지 48시간 동안 실시하는 것인, 제조방법.
6. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 제조된 금 나노입자.
7. 제 7 항에 있어서,
   상기 금 나노입자는 20 내지 50 nm의 직경을 갖는 것인, 금 나노입자.
8. 제 6 항에 따른 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 암은 위암, 대장암, 유방암, 신장암, 폐암, 자궁경부암, 난소암, 방광암, 간암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약학 조성물.
10. 제 8 항에 있어서,
    상기 금 나노입자는 암 세포의 아폽토시스 세포를 증가시키고, 미토콘드리아 손상을 유도하며, 자가포식을 억제하는 것인, 약학 조성물.
11. 제 6 항에 따른 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
12. 제 8 항에 따른 조성물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 또는 치료방법.

Images