KR20170007637A - 감귤 콤부차 발효액을 유효성분으로 포함하는 방광암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감귤 콤부차 발효액을 유효성분으로 포함하는 방광암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 방광암 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 감귤 콤부차 발효액을 유효성분으로 포함하는 조성물은 정상세포에 대해서는 독성을 나타내지 않으면서, 방광암 세포, 특히 비근침윤성(표재성) 방광암 세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유발하여 초기 방광암 세포에 대해 우수한 사멸효과를 나타낸다. 그러므로 감귤액을 첨가하여 배양한 본 발명의 감귤 콤부차 발효액은 초기 방광암의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

감귤 콤부차 발효액을 유효성분으로 포함하는 방광암 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for preventing or treating bladder cancer comprising citrus fermentd broth with Kombucha as an active ingredient}

본 발명은 감귤 콤부차 발효액을 유효성분으로 포함하는 방광암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 방광암 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

전 세계적으로 암 발병률이 꾸준히 증가하고 있으며 2013년 통계청의 한국인 주요 사망원인 보고에 따르면 한국 3대 사망원인에 암, 뇌혈관 질환, 심장질환으로 보고되고 있다. 또한 세계 보건기구 산하 국제암연구소의 보고에 따르면 암 사망의 30%는 흡연에 의해, 30%는 식이요인에 의해, 18%는 만성감염에 기인한다고 하며, 그밖에 직업, 유전, 음주, 생식요인 및 호르몬, 방사선, 환경오염 등의 요인도 각각 1~5%정도 기여하고 있는 것으로 알려져 있다.

그 중 방광암은 우리나라에서 2012년 남성기준 10대 암 중 아홉 번째로 높은 암으로 꼽혔으며, 방광암 치료를 위한 수술, 약물요법, 항암치료의 부작용으로 소화기계, 비뇨기계 감염 및 혈액계, 감각계 합병증 및 골수억제, 백혈구 감소, 전신적인 부작용이 있다고 보고되고 있다.

방광암의 요인으로는 정확한 원인에 대해서는 알려져 있지 않지만 연령, 흡연, 화학 약품의 노출 감염 및 방광결석 등이 방광암의 위험 인자로 알려져 있으며 수술 후에도 재발 확률이 높은 것으로 알려져 있다(Vinod H. Nargund et al., 2012, Seminars in oncology, 39(5):559-572).

방광암의 진행단계는 방광 근육의 침범 범위에 따라 비근침윤성(표재성) 방광암과 근침윤성 방광암 그리고 전이방광암으로 구분되며, 비근침윤성 방광암의 형태는 방광 안쪽으로 튀어나온 형태로 방광암 중에서 가장 많이 진단받는 형태이다. 또한 전이가 쉽지 않지만 수술 시 60∼80%의 재발률을 보이며, 근침윤성 방광암으로 진행되기 때문에 비근침윤성(표재성) 방광암은 조기 진단과 적절한 치료 후에 추적 관찰과 치료가 중요하다고 보고되고 있다(변상권, 2006, 연세대학교 대학원 석사학위논문).

암세포가 방광의 근육층 이상을 침범한 근침윤성 방광암은 근육층을 뚫고 자라 주위 조직으로 침윤하여 전이되는 암으로 알려져 있으며, 마지막 단계인 전이암은 방광암 진단 시 이미 다른 장기로 퍼진 상태를 의미하는 암으로 이렇게 세단계로 방광암은 구분되어진다.

최근에는 항암, 항산화 등의 생리활성을 갖는 천연물에 대한 연구가 많이 진행되고 있으며, 천연물에서 발견한 화합물들이 암세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유도하여 항암 효과를 나타낸다는 연구 결과들이 보고되고 있다(OS Frankfurt et al., 2003, Anti - cancer Drugs, 14(7):555-561).

세포가 죽는 과정은 크게 두 가지 경로로 세포괴사(necrosis)와 세포자멸사(apoptosis)가 있다. 세포괴사는 세포에 자극을 주면 세포 밖에 수분이 유입되어 부풀어 오르다가 파괴되는 것으로 염증반응이 동반되며, 세포자멸사는 내부적 요인 또는 외부 자극에 의해 세포가 스스로 사멸함으로써 핵이 조각나고 세포가 조각나 식세포가 그 조각을 삼킴으로 염증 반응 없이 세포사가 진행된다(H Steller, 1995, Science, 267(5203):1445-1449).

세포자멸사(apoptosis)는 여러 유전자와 발현 단백질들에 의해 조절되어 일어나는 능동적인 사멸로 알려져 있으며, 위험요인을 가지고 있는 세포를 정상적인 세포들로부터 제거하여 조직의 항상성을 유지하게 하는 중요한 역할을 한다(WS Simonet et al., 1997, Cell, 89(2):309-319).

세포자멸사(apoptosis) 진행과정 중에 카스파제(caspase, Cysteine aspartate-specific protease)는 세포자살로 죽어가는 세포에서 많은 생화학 및 구조적인 변화에 영향을 미쳐, 세포자멸사에 중요한 조절인자로 작용한다. 개시 카스파제(initiator caspase)로 작용되는 종류는 카스파제-2(caspase-2), 카스파제-8(casapse-8), 카스파제-9(caspase-9), 카스파제-10(caspase-10)이 있으며, 작동 카스파제(effector caspase)로 작용되는 종류는 카스파제-3(caspase-3), 카스파제-6(caspase-6), 카스파제-7(caspase-7)이 있다. 또한 대표적인 카스파제-3의 기질 단백질에 해당되는 종양촉진복합단백질(PARP, poly-ADP ribose polymerase)은 정상세포의 DNA 수복이나 유전자 안정성 유지에 중요한 역할을 하는데, 세포자멸사 유발시 카스파제-3에 의해 분해가 일어나면서 이러한 회복기능은 상실되게 된다(V Schreiber et al., 2006, Nature Reviews Molecular Cell Biology 7:517-528).

세포자멸사(apoptosis) 기전은 세포의 수용체와 관련된 외인성 경로(extrinsic pathway)와 미토콘드리아와 관련된 내인성 경로(intrinsic pathway)로 나뉘며, 세포 사멸 수용체(death receptors), Bcl-2 패밀리(Bcl-2 family), 카스파제(caspase) 등의 상호작용에 의해서 세포자멸사가 조절된다(Z Jin et al., 2005, Cancer biology & therapy, 4(2):147-171). 또한 세포자멸사(apoptosis) 기전에서는 세포의 사멸을 억제하는 항세포사멸인자(anti-apoptotic factor)와 세포의 사멸을 유도하는 전세포사멸인자(pro-apoptotic factor)의 작용에 의해 세포자멸 세포 치사(apoptotic cell death)가 조절된다.

항세포사멸(Anti-apoptotic) 단백질인 Bcl-2(B-cell lymphoma-2)는 Bax(Bcl-2-associated X protein)와 결합하여 헤테로다이머(heterodimer)를 형성하여 Bax의 활성을 억제하여 세포자멸사(apoptosis)를 방해하거나 카스파제(caspase)에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다.

또한 전세포사멸(Pro-apoptotic) 단백질인 Bax는 미토콘드리아 막의 투과성(MOMP, mitochondrial outer membrane permeabilization)을 증가시키고, 사이토크롬 C(cytochrome c)의 방출을 증가시켜 Apaf-1(Apoptotic protease activating factor 1)과 결합하여 아폽토좀(apoptosome)을 형성하여 카스파제-9(caspase-9)을 활성화시켜 세포자멸사(apoptosis)를 유도한다(SN Farrow et al., 1996, Curr Opin Genet Dev, 6(1):45-49)

아울러, 근래 천연물에서 발견한 화합물인 플라보노이드(flavonoids)와 폴리페놀(polyphenol)과 같은 파이토케미컬(phytochemical)이 암세포 증식 억제 및 암세포 전이의 억제에 관련된 연구가 진행되고 있고, 파이토케미컬에 의한 암 치료와 더불어 주변에서 흔히 접할 수 있는 천연물 소재를 찾아 원료로 사용하여 새로운 용도 및 부가가치 향상을 위한 연구 개발이 요구되고 있다(OS Frankfurt et al., 2010, Febs Journal, 277(16):3437-3448; 황용주 et al., 2003, 한국식품영양과학 회지 32(2):217-222).

한방약이나 생약의 원료로 사용되고 있는 감귤에는 플라보노이드(flavonoid)류, 카로티노이드(carotenoid)류, 쿠마린(coumarin)류 등의 다양한 성분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 감귤 유래 주요 플라보노이드 화합물은 나린진(naringin)과 헤스페리딘(hesperidin) 그리고 이들의 아글리콘(aglycone) 형태인 나린제닌(naringenin)과 헤스페레틴(hesperetin)이며, 그 밖에도 루틴(rutin), 노빌레틴(nobiletin), 탄제레틴(tangeretin) 등이 있으며, 혈중 콜레스테롤 및 중성지질 억제작용에 의한 혈관계 질환 개선효과, 지방간을 비롯한 간질환 개선효과, 암세포 증식억제에 의한 항암작용, 노화 및 질병의 원인이 되는 생체 내 지질 과산화를 억제하는 항산화 작용, 항균작용, 항염증, 항알레르기, 면역증강 작용 등 다양한 생리기능 활성이 보고된 바 있다(차재영 et al, 2001, J. Korean Soc . Agric . Chem. Biotchnol., 44(2):122-128).

콤부차는 홍차 추출액에 균총을 넣어 발효시킨 러시아의 전통 발효음료로 알려진 음료 중 하나로, 독일, 프랑스 및 북아프리카 지역에는 세계 2차 대전 이후 널리 대중화 되었다(CW Hesseltine, 1983, Nutr Rev, 41(10):293-301). 미국에서는 콤부차가 갖고 있는 상쾌한 맛과 해독작용, 만성피로, 변비 등 건강증진 및 의학적 치료효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 국내에서는 홍차버섯이라고 알려진 발효음료로 해독작용과 항균활성 및 항산화 활성이 높다고 알려져 있다.

또한, 콤부차는 관절염의 통증 완화, 혈압 강하, T 세포의 증가, 변비 완화, 소화기나 대사성 질환에 효과가 있다고 보고된 바 있으며, 글루쿠론산(glucuronic acid), 비타민(vitamin) B1, B2, B6와 항균 활성이 있는 우스닌산(usnic acid) 등의 성분과 항산화 활성 등의 효능이 있다고 알려져 있다(K.H. Steinkraus et al., 1996, Acta Biotechnol, 16(2-3):199-205; R Srinivasan et al., 1997, Journal of general internal medicine, 12(10):643-645).

콤부차에서 관찰되는 아세토박터 속(Acetobacter sp.)으로는 아세포박터 자일리늄(Acetobacter Xylinum)이 대표적이며, 그 외에는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.), 자이고사카로미세스 속(Zygosaccharomyces sp.), Torulopsis 속(Torulopsis sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 브레타노미세스속(Brettanomyces sp.)과 같은 효모(yeast)들이 존재한다.

콤부차 발효에서 아세토박터 속(Acetobacter sp.)과 효모(yesat)는 서로 공생관계에 있으며, 이들 균주가 동시에 상호작용하며 발효가 진행되어 아세틱산(acetic acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아미노산(amino acids), 섬유소 피막(cellulose pellicle) 등을 생산하는 것으로 보고되었으며, 최근 콤부차 관련 연구에서는 전립선암 신생혈관 하향조절의 효과와 간세포에서의 독성물질 예방 등의 효과가 있다고 알려져 있다(SC Chu. et al., 2006, Food Chem, 98(3):502-507; T Srihari et al., 2013, Biomedicine & Preventive Nutrition, 3(1):53-58; S Bhattacharya et al., 2011, Indian Journal of Experimental Biology, 49:511-524).

콤부차를 배양할 때에는 대부분 홍차를 사용하고 있으나, 녹차는 홍차나 우롱차와 같은 발효차에 비해 차 카테킨 함량이 높으며, 차 카테킨(Tea Catechin)은 식품이 변질되는 것을 방지하기 위해 산화 방지제로 사용되고 체중, 허리둘레, 신체질량지수 등 혈중지질 성분이 저하된다고 보고되어, 최근 콤부차 배양 시 녹차 추출물을 이용하는 추세이다(MWL Koo et al., 2004, Eur J Pharmacol, 500(1-3):177-185; 대한민국 등록특허 제10-0482308호).

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 방광암에 대한 항암 효과를 나타내면서 부작용이 적은 천연물을 찾고자 연구 노력한 결과, 콤부차 배양 시 녹차 추출물을 이용하고 감귤액을 첨가한, 감귤 콤부차 발효액이 방광암 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-0482308호

Vinod H. Nargund et al., 2012, Seminars in oncology, 39(5):559-572 변상권, 2006, 연세대학교 대학원 석사학위논문 OS Frankfurt et al., 2003, Anti-cancer Drugs, 14(7):555-561 H Steller, 1995, Science, 267(5203):1445-1449 WS Simonet et al., 1997, Cell, 89(2):309-319 V Schreiber et al., 2006, Nature Reviews Molecular Cell Biology 7:517-528 Z Jin et al., 2005, Cancer biology & therapy, 4(2):147-171 SN Farrow et al., 1996, Curr Opin Genet Dev, 6(1):45-49 OS Frankfurt et al., 2010, Febs Journal, 277(16):3437-3448 황용주 et al., 2003, 한국식품영양과학회지 32(2):217-222) 차재영 et al, 2001, J. Korean Soc. Agric. Chem. Biotchnol., 44(2):122-128 CW Hesseltine, 1983, Nutr Rev, 41(10):293-301 K.H. Steinkraus et al., 1996, Acta Biotechnol, 16(2-3):199-205 R Srinivasan et al., 1997, Journal of general internal medicine, 12(10):643-645 SC Chu. et al., 2006, Food Chem, 98(3):502-507 T Srihari et al., 2013, Biomedicine & Preventive Nutrition, 3(1):53-58 S Bhattacharya et al., 2011, Indian Journal of Experimental Biology, 49:511-524 MWL Koo et al., 2004, Eur J Pharmacol, 500(1-3):177-185

본 발명의 목적은 감귤 콤부차 발효액을 유효성분으로 포함하는 방광암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 감귤 콤부차 발효액을 유효성분으로 포함하는 방광암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 감귤 콤부차 발효액을 유효성분으로 포함하는 방광암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "콤부차(Kombucha, K)"는 발효홍차 음료로 홍차 추출액에 tea fungus라 불리는 균총을 넣어 발효시킨 러시아의 전통 발효음료 중의 하나로, 국내에서는 홍차버섯이라고 알려진 발효 음료이며, 홍차 또는/및 녹차에 당을 첨가하고 발효시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 콤부차는 피막(pellicle)이 포함되어 있는 판매용 콤부차와 열수추출한 녹차 추출액과, 전체 조성물의 5 내지 15%(w/v)의 설탕을 첨가, 교반하여 전배양하고, 상기 전배양을 통해 얻은 콤부차(origin kombucha) 배양액을 전체 조성물의 5 내지 20%(v/v), 피막(pellicle)은 부피의 1/2 내지 1/16인 6.25 내지 50%(w/v)를 첨가하여 28 내지 35℃의 온도로 5 내지 10일간 정치배양하여 제조한 것일 수 있다(실시예 1-1, 도 1 및 도 3).

본 발명에서 용어 "감귤 콤부차(Citrus Kombucha, CK) 발효액"은 상기 콤부차 배양시 감귤액을 첨가하여 발효한 발효액이다.

상기 감귤 콤부차 발효액은, 1) 피막(pellicle)이 포함되어 있는 콤부차와 열수추출한 녹차 추출액 및 전체 조성물의 5 내지 15%(w/v)의 설탕을 첨가, 교반하여 전배양하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 전배양한 콤부차를 5 내지 15℃에서 냉각 추출하는 단계; 및 3) 전체 조성물 대비 상기 전배양을 통해 얻은 콤부차 배양액 5 내지 20%(v/v), 아세테이트 0.01 내지 0.5%(v/v), 피막(pellicle) 6.25 내지 50%(w/v) 및 감귤액 5 내지 50%(v/v)을 첨가하여 5 내지 10일간 정치배양하는 단계;를 포함하는 방법에 의해 제조한 것일 수 있다(실시예 1-1, 도 2 및 도 3).

본 발명에서 용어 "방광암(bladder cancer)"은 방광에 발생하는 악성 종양으로, 방광암은 크게 암이 방광 점막이나 점막 하층에만 국한되어 있어 경요도방광종양절제술로 종양의 완전 절제가 가능한 비근침윤성(표재성) 방광암과, 방광암이 근육층을 침범하여 종양의 완전 제거를 위해 방광적출술이 필요한 근침윤성 방광암, 그리고 전이성 방광암으로 나뉘어진다.

본 발명에서 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 방광암의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 방광암의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 방광암으로 바람직하게는 비근침윤성(표재성) 방광암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게, 상기 암의 예방 또는 치료는 본 발명에 따른 감귤 콤부차 발효액에 의해 유도되는 암세포의 세포자멸사(appotosis)에 의해 달성될 수 있다. 상기 "세포자멸사(apoptosis)"는 일종의 계획된 세포 죽음(programmed cell death; PCD)으로, 우리 몸 안에 입력되어 있는 생체 프로그램에 의해 비정상 세포, 손상된 세포, 노화된 세포가 스스로 자살해 사멸함으로써 전체적인 신체 건강을 유지하도록 하는 메커니즘이다. 이러한 세포자멸사는 화상, 타박, 독극물 등 자극에 의해 일어나는 세포의 죽음, 예컨대 세포의 사고사 또는 돌연사인 세포괴사(necrosis)와 구별된다. 즉, 세포자멸사는 특정한 유전자로부터 발현되는 단백질에 의해 조절되는 세포의 능동적인 죽음이다. 세포괴사는 무질서하게 일어나는 반면, 세포자멸사는 단시간에 질서있게 일어난다. 구체적으로 세포자멸사는 세포의 수축으로 시작되어 인접한 세포와의 사이에 틈새가 생기고, 죽는 과정에 있는 세포의 핵 안에서 유전물질인 DNA가 조각으로 규칙적으로 절단된다. 최종적으로 아폽토시스 소체라고 불리는 세포 전체도 조각나게 되고 주변에 있는 다른 세포에 먹혀버림으로 죽음에 이른다. 인체의 초기 발생 과정에서 인체를 형성하는데 관여하며, 성인에서는 정상적인 세포가 노화되었을 때 제거하거나, 이상이 생긴 세포를 제거하는 일을 담당한다. 상기 세포자멸사는 PCD 이외의 경우에도 발생한다는 점에서 PCD와 구별되며 암세포 사멸, 바이러스 감염, 약물 및 방사선 등에 의한 세포죽음과 관련이 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 본 발명의 조성물, 예컨대 감귤 콤부차가 정상세포(RAW 264.7)에 대해서는 세포독성을 나타내지 않았으나, 방광암 세포주(T24 및 5637)에 대해서는 사멸효과를 나타내는 것을 확인하였으며, 특히 비근침윤성(표재성) 방광암 세포주인 T24 세포에 대해 우수한 사멸효과를 나타냄을 확인하였다(도 4 및 도 5). 또한, 상기 조성물의 처리는 세포자멸사(apoptosis)를 유도하여 세포사멸을 유발하는 것을 확인하였으며, 특히 비근침윤성(표재성) 방광암 세포(T24)의 경우 감귤 콤부차 처리시 세포자멸사를 효과적으로 유발하여 뛰어난 항암활성을 나타냄을 추가적으로 확인하였다(도 11). 나아가, 암세포의 세포자멸사와 관련된 단백질의 발현을 확인함으로써, 본 발명의 조성물이 사멸 수용체(death receptor)를 통한 외부적 경로와 미토콘드리아에서 일어나는 내부적 경로를 통하여 암세포의 세포자멸사를 유도함을 다시 한번 확인할 수 있었다(도 13).

상기 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 감귤 콤부차 발효액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 암의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 조성물에 함유된 감귤 콤부차 발효액의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 본 발명의 감귤 콤부차는 고형분을 기준으로 1일 체중 kg 당 0.001 내지 100 mg, 바람직하게는 체중 kg 당 1 내지 10 mg, 보다 바람직하게는 1 내지 5 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 감귤 콤부차 발효액을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방광암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "개체"란, 상기 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 감귤 콤부차 발효액 이외에 공지된 항암제를 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다. 다른 치료에는 화학요법, 방사선치료, 호르몬 치료, 골수 이식, 줄기-세포 대체치료, 다른 생물학적 치료, 면역치료 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 항암제의 예시에는 DNA 알킬화제(DNA alkylating agents)로 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부칠(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부술판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin); 항암 항생제(anti-cancer antibiotics)로 닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토크산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신 C(mitomycin C) 및 블레오마이신(bleomycin); 및 식물 알카로이드(plant alkaloids)로 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan) 및 이리도테칸(iridotecan) 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 감귤 콤부차 발효액을 유효성분으로 포함하는 방광암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 상기 감귤 콤부차 발효액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 항암제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 감귤 콤부차 발효액을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 감귤 콤부차 발효액을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 감귤 콤부차 발효액은 천연 식물을 원료로 하므로 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 사용할 경우에도 일반적인 합성 화합물에 비하여 부작용이 덜할 수 있으므로, 안전하게 약학적 조성물 및 건강기능식품에 포함되어 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 감귤 콤부차 발효액을 유효성분으로 포함하는 조성물은 정상세포에 대해서는 독성을 나타내지 않으면서, 방광암 세포, 특히 비근침윤성(표재성) 방광암 세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유발하여 초기 방광암 세포에 대해 우수한 사멸효과를 나타낸다. 그러므로 감귤액을 첨가하여 배양한 본 발명의 감귤 콤부차 발효액은 초기 방광암의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 콤부차(Kombucha) 발효액의 제조 단계를 개략적으로 나타낸 흐름도(flow diagram)이다.
도 2는 본 발명의 감귤 콤부차(Citrus Kombucha) 발효액의 제조 단계를 개략적으로 나타낸 흐름도(flow diagram)이다.
도 3은 본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차의 발효 음료 샘플을 나타낸 사진이다.
도 4는 정상세포(RAW 264.7 cell)에 대한 본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차의 농도에 따른 세포 독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 비근침윤성(표재성) 방광암 세포(T24 cell)에 대한 본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차의 농도에 따른 세포 증식 억제 효과 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 고위험도 표재성 방광암 세포(5637 cell)에 대한 본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차의 농도에 따른 세포 증식 억제 효과 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 콤부차(A)와 감귤 콤부차(B)의 농도에 따른, 비근침윤성(표재성) 방광암 세포주 T24 세포의 형태학적 변화(morphological change)를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 8은 본 발명의 콤부차(A)와 감귤 콤부차(B)의 농도에 따른, 고위험도 표재성 방광암 세포주 5637 세포의 형태학적 변화(morphological change)를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 9는 상처 치유 분석(wound healing assay)을 통해, 본 발명의 콤부차(A)와 감귤 콤부차(B)의 농도에 따른, 비근침윤성(표재성) 방광암 세포주 T24 세포의 이동 정도를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 10은 상처 치유 분석(wound healing assay)을 통해, 본 발명의 콤부차(A)와 감귤 콤부차(B)의 농도에 따른, 고위험도 표재성 방광암 세포주 5637 세포의 이동 정도를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 11은 본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차의 농도에 따른 비근침윤성(표재성) 방광암 세포주 T24 세포의 세포자멸사(apoptosis)에 의한 세포사멸 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차의 농도에 따른 고위험도 표재성 방광암 세포주 5637 세포의 세포자멸사(apoptosis)에 의한 세포사멸 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차의 농도에 따른 비근침윤성(표재성) 방광암 세포주 T24 세포에 대한 세포자멸사(apoptosis) 관련 단백질의 발현조절능을 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차의 농도에 따른 고위험도 표재성 방광암 세포주 5637 세포에 대한 세포자멸사(apoptosis) 관련 단백질의 발현조절능을 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 콤부차 배양 및 시료 준비

실시예 1-1: 콤부차 배양

본 발명에서 사용한 콤부차는 국내생산용 콤부차(local domestic Kombucha)이며, 민간에서 분양하여 판매하는 것을 인터넷으로 구매하여 사용하였다(www.auction.co.kr).

콤부차는 도 1에 따라 상기 인터넷에서 구입한 피막(pellicle)이 포함되어 있는 콤부차를 녹차 추출액 900㎖와 설탕 90g을 첨가, 교반한 후 전배양을 하고, 전배양을 한 후 얻은 콤부차(origin kombucha) 배양액 100㎖와 상기 전배양 발효 시 생성된 피막(pellicle)은 부피의 1/4인 18g을 넣어 30℃ 조건으로 10일간 배양하였다. 또한, 감귤 콤부차는 도 2에 나타난 바와 같이 피막(pellicle)이 포함되어 있는 판매용 콤부차와 녹차 추출액 700㎖, 설탕 90g을 교반한 후 전배양을 하고, 상기 전배양을 통해 얻은 콤부차(origin kombucha) 배양액 100㎖과 피막(pellicle) 18g, 감귤액(citrus juice) 200㎖ 및 아세테이트(acetate) 500㎕를 첨가하여 상기 콤부차와 동일한 조건에서 배양하였다.

본 발명에 사용된 감귤액은 ㈜일해에서 생산된 것을 받아서 사용하였다.

실시예 1-2: 시료 준비

콤부차(Kombicha)와 감귤 콤부차(Citrus Kombucha) 시료는 항산화 및 총 폴리페놀 함량 측정용과 세포실험용으로 나누어 준비하였다.

구체적으로, 항산화 및 총 폴리페놀 함량 측정에는 12000 rpm에서 20분간 콤부차와 감귤 콤부차를 원심분리 후 얻은 각각의 상등액을 준비하여 사용하였으며, 세포실험에는 콤부차와 감귤 콤부차를 12000 rpm에 20분간 원심분리 후 얻은 각각의 상등액을 주사기용 필터유닛(Pore size 45㎛)을 이용하여 필터(filter) 한 후 배지(RPMI-1640)에 희석하여 사용하였다.

실시예 2: 세포주의 배양

본 발명에 사용한 비근침윤성(표재성) 방광암 세포주인 T24 세포와, 고위험도 표재성 방광암 세포주인 5637 세포는 한국세포주 은행에서 구입하였으며, 상기 T24 세포와 5637 세포는 37℃, 5% CO₂조건에서 10% 우태아혈청(FBS, Fetal bovine serum; GIBCO Inc.) 및 1% 페니실린(Penicillin; GIBCO Inc.)을 첨가한 RPMI-1640(Sigma-Aldrich) 배지를 사용하여 배양하였다.

또한, 본 발명에 사용한 RAW 264.7 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 분양받아 사용하였고, 10% 우태아혈청(Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), 2 mmol/L 글루타민(glutamine), 100 mg/L 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 첨가한 DMEM(Hyclone Laboratories) 배지를 사용하여 배양하였다.

실시예 3 : 콤부차와 감귤 콤부차의 항산화 활성 측정

콤부차(Kombucha, K)와 감귤 콤부차(Citrus Kombucha, CK)의 항산화 활성을 측정하기 위해, DPPH 라디컬(DPPH radical) 소거능과 ABTS 라디컬 양이온(ABTS radical cation) 소거능을 측정하였다. 또한, 시료의 항산화능을 직접적으로 측정하는 방법은 아니지만, 시료에 함유되어 있는 항산화능을 예측할 수 있으므로 항산화 연구에 폭넓게 이용되는 방법의 하나로서 총 폴리페놀 함량을 측정하였다.

실시예 3-1: DPPH 라디컬 소거능 측정

DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)는 짙은 보라색을 나타내는 유기 질소 자유 라디컬(ganic nitrogen free radical)로 에탄올 용액 상태에서 흡광도를 보이며, 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 빠른 속도로 수소 라디컬(hydrogen radical)의 전자를 받아들이면서 환원되어 안정한 화합물이 비가역적으로 전환되며 짙은 보라색이 엷어지는 특징을 가진다.

이에, 항산화능을 측정하기 위해 널리 사용되는 방법으로, 빠르고 간단한 유리 라디컬 소거능력 측정이 가능한 DPPH 어세이(DPPH assay)를 수행하였다. 이때 대조군으로는 우수한 항산화 효과가 검증된 비타민 C(ascorbic acid)를 사용하였다.

구체적으로, 콤부차와 감귤 콤부차 각각의 시료 1㎖에 에탄올(ethanol)로 용해한 0.2mM DPPH 용액 4㎖를 첨가하여 혼합한 후 상온에서 20분간 반응하였다. 그리고 ELISA 마이크로플레이트 리더(ELISA Microplate Reader; Versa Max, USA)를 사용하여 517nm 파장에서 흡광도 값을 측정한 후 하기 식을 이용하여 결과값을 나타내었다.

DPPH 라디컬 소거능(DPPH radical scavenging activity, (%))=[1-(콤부차 또는 감귤 콤부차 시료 첨가군(experiment)의 흡광도/시료를 첨가하지 않은 대조군(control)의 흡광도)]×100

그 결과, 콤부차 배양액과 감귤액을 첨가한 감귤 콤부차의 DPPH 라디컬 소거능 활성은 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 콤부차와 감귤 콤부차의 1㎎/㎖에 DPPH 라디컬 소거 활성은 각각 87.9%와 91.2%를 나타내었다.

이를 통하여, 대조군인 비타민 C와 유사하게 콤부차와 감귤 콤부차 둘 다 항산화 활성이 우수함을 알 수 있었으며, 특히 콤부차 대비 감귤액을 첨가한 감귤 콤부차의 유리 라디컬(free radical) 소거 활성이 높음을 확인함으로써, 감귤 콤부차의 항산화 활성이 콤부차보다 더 우수함을 알 수 있었다.

실시예 3-2: ABTS 라디컬 양이온 소거능 측정

ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)) 어세이(assay)는 양이온(ABTS·+)에 대한 항산화제의 소거능을 측정하는 방법으로, 과황산칼륨(potassium persulfate)과 반응하여 녹색의 ABTS 라디컬(radical)을 형성하고, 생성된 ABTS 라디컬은 항산화력을 가진 물질로부터 전자를 받아 무색의 물질로 환원된다.

이에, 상기와 같은 원리로 항산화능 측정이 가능한 ABTS 어세이를 수행하여 본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차의 ABTS 라디컬 양이온 소거능을 측정하였다. 이때 대조군으로는 우수한 항산화 효과가 검증된 비타민 C(ascorbic acid)를 사용하였다.

구체적으로, ABTS 라디컬 양이온 소거능 측정은 7.4mM ABTS와 과황산칼륨(potassium persulfate) 2.6mM을 하루 동안 암소에 방치하여 ABTS 양이온을 형성시킨 후 이 용액을 735nm 파장에서 흡광도 값이 1.4~1.5가 되도록 증류수로 희석하여 사용하였다.

콤부차와 감귤 콤부차 각각의 시료 100㎕와 ABTS 용액 900㎕를 첨가한 후 30분 방치 후 ELISA 리더(ELISA reader)를 사용하여 735nm 파장에서 측정한 후 하기 식을 이용하여 결과값을 나타내었다.

ABTS 라디컬 양이온 소거능(ABTS radical cation scavenging activity, (%))=[1-(콤부차 또는 감귤 콤부차 시료 첨가군(experiment)의 흡광도/시료를 첨가하지 않은 대조군(control)의 흡광도)]×100

그 결과, 콤부차 배양액과 감귤액을 첨가한 감귤 콤부차의 ABTS 라디컬 양이온 소거능 활성은 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 콤부차와 감귤 콤부차의 1㎎/㎖에 ABTS 라디컬 양이온 소거 활성은 각각 78.78%와 94.59%를 나타내었다.

이를 통하여, 콤부차 대비 감귤액을 첨가한 감귤 콤부차의 유리 라디컬(free radical) 소거 활성이 높음을 확인함으로써, 감귤 콤부차의 항산화 활성이 콤부차보다 더 우수함을 알 수 있었으며, 더욱이 감귤 콤부차의 경우 대조군인 비타민 C와 유사하게 매우 우수한 항산화 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3-3: 총 폴리페놀 함량(total polypenol content) 측정

폴리페놀 화합물의 벤젠 고리에 치환되어 있는 여러 개의 수산기가 유리 라디컬(free radical)과의 환원 반응에 참여함으로써 항산화 활성이 나타나므로, 일반적으로 시료에 포함되어 있는 총 폴리페놀 함량이 증가할수록 항산화 활성이 증가한다고 볼 수 있다(Y Park et al., 2008, Food Science and Biotechnology 17(2):251-256).

이에, 시료의 항산화능을 직접적으로 측정하는 방법은 아니지만, 시료에 함유되어 있는 항산화능을 예측할 수 있으므로 항산화 연구에 폭넓게 이용되는 방법으로서 총 폴리페놀 함량을 측정하였다.

구체적으로, 콤부차와 감귤 콤부차 각각의 시료 1㎖와 10% 폴린-시오칼토 페놀 시약(folin-ciocalteu's phenol regent) 1㎖ 및 2% 탄산나트륨(sodium carbonate) 용액 1㎖을 각각 혼합하여 1시간 동안 암소에서 방치 후 ELISA 리더(ELISA reader)를 이용하여 750nm 파장에서 흡광도를 측정 하였다.

총 페놀 함량 분석은 탄닌산(tannic acid)을 이용하여 작성한 표준곡선으로 함량을 계산한 후 총 폴리페놀 함량은 시료 중량 당 ㎍/㎖로 나타내었다.

그 결과, 하기 표 3에 나타난 바와 같이, 콤부차와 감귤 콤부차의 총 폴리페놀 함량은 ㎍당 탄닌산(tannic acid)의 등량값으로 나타낼 때 각각 17.82㎍/㎖와 28.62㎍/㎖를 나타내었다.

이를 통하여, 콤부차 대비 감귤액을 첨가한 감귤 콤부차의 총 폴리페놀 함량이 더 높음을 알 수 있었다.

상기 항산화 활성 측정 결과를 통하여, 콤부차 대비 감귤액을 첨가한 감귤 콤부차의 총 폴리페놀 함량이 높고 항산화 활성이 우수함을 알 수 있었으며, 이에, 세포막 파괴, 효소 불활성화, 지질산화, DNA 변성, 그리고 세포노화 등과 같은 잠재적인 세포 손상을 초래하여 암을 비롯한 동맥경화, 자가면역 질환 등의 심각한 병리적 장애를 일으키는 원인이 되는 활성산소종(ROS, reactive oxygen species)이 본 발명의 감귤 콤부차에 의해 효율적으로 제거될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4: 콤부차와 감귤 콤부차의 세포 독성 측정

콤부차(Kombucha, K)와 감귤 콤부차(Citrus Kombucha, CK) 처리에 따른 세포증식 억제 정도를 측정하기 위해, MTT assay(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay)를 수행하였다.

실시예 4-1: 정상세포(RAW 264.7)에 대한 콤부차와 감귤 콤부차의 세포 독성 측정

우선, 콤부차(Kombucha)와 감귤 콤부차(Citrus Kombucha)가 정상세포 RAW 264.7 세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다.

구체적으로, 96웰 플레이트(96 well plate)에 1×10⁴ 개/웰(well)의 세포수로 RAW 264.7 세포를 분주하고, 콤부차와 감귤 콤부차 시료를 각각 0, 1, 2, 4, 6, 8 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 5㎎/㎖ MTT 시약(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)을 각 웰(well)에 10㎕씩 처리하여 1시간 동안 배양하고, 배지를 제거하였다. 배지를 제거한 각 웰(well)에 DMSO(dimethyl sulfoxide) 100㎕씩 분주하여, 각 웰에 MTT 시약에 의해 생성된 포르마잔(formazan)을 모두 용해시킨 후 ELISA 리더(ELISA reader)로 560nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 세포 생존율은 콤부차와 감귤 콤부차 시료의 각각의 흡광도를 대조군(시료 무 처리군)의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

콤부차와 감귤 콤부차의 독성을 확인해 본 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 0, 1, 2, 4, 6㎎/㎖의 농도로 콤부차와 감귤 콤부차 시료를 각각 처리한 경우에는 생존율 100% 이상을 나타냈으며, 8㎎/㎖의 농도로 콤부차와 감귤 콤부차 시료를 각각 처리한 경우에는 생존율 80% 이상, 독성 약 20% 이하로 나타나 정상세포 RAW 264.7 세포의 세포 생존율에 큰 영향을 주지 않는 것으로 확인하였다.

실시예 4-2: 비근침윤성 (표재성) 방광암 세포(T24 cell)에 대한 콤부차와 감귤 콤부차의 세포 독성 측정

콤부차(Kombucha)와 감귤 콤부차(Citrus Kombucha) 처리에 따른, 비근침윤성(표재성) 방광암 세포(T24 cell)의 세포증식 억제 정도를 측정하기 위해, MTT assay를 수행하였다. 이때, 콤부차와 감귤 콤부차의 처리 농도는 상기 실시예 4-1에서 정상세포 RAW 264.7 세포의 세포 생존율에 큰 영향을 미치지 않는 농도인 0, 1, 2, 4, 6, 8 ㎎/㎖로 설정하여 수행하였다.

구체적으로, 96웰 플레이트(96 well plate)에 1×10⁴ 개/웰(well)의 세포수로 T24 세포를 분주하고, 콤부차와 감귤 콤부차 시료를 각각 0, 1, 2, 4, 6, 8 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 5㎎/㎖ MTT 시약을 각 웰(well)에 10㎕씩 처리하여 1시간 동안 배양하고, 배지를 제거하였다. 배지를 제거한 각 웰(well)에 DMSO(dimethyl sulfoxide) 100㎕씩 분주하고, 각 웰에 생성된 포르마잔(formazan)을 모두 녹인 후 ELISA 리더(ELISA reader)로 560nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 세포의 증식률은 대조군(시료 무 처리군)의 세포 생존율을 100% 기준으로 하여, 콤부차와 감귤 콤부차 시료를 각각 처리한 실험군의 농도별 세포 증식을 비교하였다.

비근침윤성(표재성) 방광암 세포인 T24 세포에 1, 2, 4, 6, 8㎎/㎖의 농도로 콤부차와 감귤 콤부차를 각각 처리한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 콤부차를 처리한 경우에는 각각 82.57%, 69.01%, 50.12%, 33.47%, 26.09%의 생존율을 보였고, 감귤 콤부차를 처리한 경우에는 각각 81.96%, 72.77%, 50.36%, 19.49%, 13.44%의 생존율을 나타냈다(p<0.05).

이를 통하여, 콤부차와 감귤 콤부차 둘 다 처리 농도가 높아짐에 따라 비근침윤성(표재성) 방광암 세포의 증식을 억제함을 알 수 있었으며, 특히 감귤 콤부차를 처리한 경우가 콤부차를 처리한 경우에 비해 비근침윤성(표재성) 방광암 세포의 증식을 현저하게 억제함을 알 수 있었다.

실시예 4-3: 고위험도 표재성 방광암 세포(5637 cell)에 대한 콤부차와 감귤 콤부차의 세포 독성 측정

콤부차(Kombucha)와 감귤 콤부차(Citrus Kombucha) 처리에 따른, 고위험도 표재성 방광암 세포(5637 cell)의 세포증식 억제 정도를 측정하기 위해, MTT assay를 수행하였다. 이때, 콤부차와 감귤 콤부차의 처리 농도는 상기 실시예 4-1에서 정상세포 RAW 264.7 세포의 세포 생존율에 큰 영향을 미치지 않는 농도인 0, 1, 2, 4, 6, 8 ㎎/㎖로 설정하여 수행하였다.

구체적으로, 96웰 플레이트(96 well plate)에 1×10⁴ 개/웰(well)의 세포수로 5637 세포를 분주하고, 콤부차와 감귤 콤부차 시료를 각각 0, 1, 2, 4, 6, 8 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 5㎎/㎖ MTT 시약을 각 웰(well)에 10㎕씩 처리하여 1시간 동안 배양하고, 배지를 제거하였다. 배지를 제거한 각 웰(well)에 DMSO(dimethyl sulfoxide) 100㎕씩 분주하고, 각 웰에 생성된 포르마잔(formazan)을 모두 녹인 후 ELISA 리더(ELISA reader)로 560nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 세포의 증식률은 대조군(시료 무 처리군)의 세포 생존율을 100% 기준으로 하여, 콤부차와 감귤 콤부차 시료를 각각 처리한 실험군의 농도별 세포 증식을 비교하였다.

고위험도 표재성 방광암 세포인 5637 세포에 1, 2, 4, 6, 8㎎/㎖의 농도로 콤부차와 감귤 콤부차를 각각 처리한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 콤부차를 처리한 경우에는 각각 84.22%, 84.71%, 85.63%, 80.63%, 68.22%의 생존율을 보였고, 감귤 콤부차를 처리한 경우에는 각각 82.5%, 74.24%, 76.03%, 65.71%, 35.87%의 생존율을 나타냈다(p<0.05).

이를 통하여, 콤부차와 감귤 콤부차 처리 농도에 따른 비근침윤성(표재성) 방광암 세포인 T24 세포의 세포 증식 억제효과와 마찬가지로, 농도 의존적으로 콤부차와 감귤 콤부차를 처리함에 따라 고위험도 표재성 방광암 세포인 5637 세포도 세포 증식이 억제됨을 알 수 있었다. 또한 콤부차를 처리한 경우보다 감귤 콤부차를 처리한 경우가 고위험도 표재성 방광암 세포의 증식을 현저하게 억제함을 알 수 있었다.

상기 콤부차와 감귤 콤부차의 세포 독성 측정 결과를 통하여, 콤부차와 감귤 콤부차 둘 다 정상세포에 대해서는 독성을 나타내지 않으면서, 비근침윤성(표재성) 방광암 세포인 T24 세포와 고위험도 표재성 방광암 세포인 5637 세포의 세포 증식은 억제함을 알 수 있었다. 또한, 상기 방광암 세포에 대해 콤부차 대비 감귤 콤부차가 세포 증식 억제율이 더 높음을 알 수 있었다.

아울러, 고위험도 표재성 방광암 세포인 5637 세포보다는 비근침윤성(표재성) 방광암 세포인 T24 세포에 대해서 콤부차와 감귤 콤부차의 세포 증식 억제율이 더 높았으며, 콤부차에 비해 감귤 콤부차의 세포 증식 억제율이 현저히 높음을 확인하였다. 이를 통해, 초기 방광암인 비근침윤성(표재성) 방광암 예방 또는 치료에 본 발명의 감귤 콤부차를 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5: 본 발명의 콤부차(Kombucha, K)와 감귤 콤부차(Citrus Kombucha, CK)에 따른 방광암의 세포 형태 변화 관찰

실시예 5-1: 본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차에 따른 비근침윤성 (표재성) 방광암 세포(T24 cell)의 세포 형태 변화 관찰

본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차의 농도에 따른 비근침윤성(표재성) 방광암 세포(T24 cell)의 세포 형태 변화를 확인하기 위하여, 6웰 플레이트(6-well plate)에 2×10⁵ 개/웰(well)의 세포수로 T24 세포를 분주하고, 콤부차와 감귤 콤부차 시료를 각각 0, 1, 2, 4, 6, 8 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 후, 도립 현미경(CK×40-CPG30, Olympus, Japan)을 사용하여 100×(0.25)PhP 배율로 관찰하였다.

그 결과, 도 7의 A에 나타난 바와 같이, 비근침윤성(표재성) 방광암 세포인 T24 세포에 8㎎/㎖의 농도로 콤부차를 처리한 경우 암세포 수가 줄어들었으나 형태적인 변화는 관찰되지 않았다. 반면, 도 7의 B에 나타난 바와 같이, 감귤 콤부차를 6 및 8㎎/㎖ 농도로 처리한 경우 암세포 수 감소를 비롯하여 형태가 변화됨을 관찰하였다.

실시예 5-2: 본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차에 따른 고위험도 표재성 방광암 세포(5637 cell)의 세포 형태 변화 관찰

본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차의 농도에 따른 고위험도 표재성 방광암 세포(5637 cell)의 세포 형태 변화를 확인하기 위하여, 6웰 플레이트(6-well plate)에 2×10⁵ 개/웰(well)의 세포수로 5637 세포를 분주하고, 콤부차와 감귤 콤부차 시료를 각각 0, 1, 2, 4, 6, 8 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 후, 도립 현미경(CK×40-CPG30, Olympus, Japan)을 사용하여 100×(0.25)PhP 배율로 관찰하였다.

그 결과, 도 8의 A에 나타난 바와 같이, 고위험도 표재성 방광암 세포인 5637 세포에 콤부차를 처리한 경우 농도 의존적으로 암세포 수가 줄어들었으나 큰 형태적인 변화는 관찰되지 않았다. 반면, 도 8의 B에 나타난 바와 같이, 감귤 콤부차를 8㎎/㎖ 농도로 처리한 경우 암세포 수 감소를 비롯하여 형태가 다소 변화됨을 관찰하였다.

상기 본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차에 따른 방광암의 세포 형태 변화 관찰 결과를 통하여, 고농도(6 및 8 ㎎/㎖)의 감귤 콤부차의 처리에 의해 암세포의 응축과 부착력이 상실되면서 배양액에 암세포가 부유한 모습이 관찰되었으며, 더불어 암세포의 형태적 변화를 동반함을 알 수 있었다.

실시예 6: 콤부차(Kombucha, K)와 감귤 콤부차(Citrus Kombucha, CK)의 방광암 세포 이동성에 미치는 영향 평가

실시예 6-1: 콤부차와 감귤 콤부차의 비근침윤성 (표재성) 방광암 세포(T24 cell) 이동성에 미치는 영향 평가

본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차의 농도에 따른 비근침윤성(표재성) 방광암 세포(T24 cell)의 이동성을 확인하기 위하여, 스크래치를 내어 세포를 제거한 내부로 점차적인 이동현상을 보이는 상처치유 분석(wound healing assay)을 수행하였다. 이때, 세포를 제거한 시점을 0시간으로 하였다.

구체적으로, 6웰 플레이트(6-well plate)에 2×10⁵ 개/웰(well)의 세포수로 T24 세포를 분주하고, 세포가 서브컨플루언스(Subconfluence) 상태에 도달할 때까지 배양하였다. 세포가 서브컨플루언스(Subconfluence) 상태에 도달하면, 200㎕ 피펫(pipet) 팁(tip) 끝으로 긁어 스크래치를 내어 세포를 제거하였다. 이후, 스크래치를 낸 T24 세포가 있는 웰로부터 상층의 배지를 제거하였다. 상층의 배지가 제거된 각 웰에 각각 0, 1, 2, 4, 6, 8 ㎎/㎖의 농도가 되도록 배지에 희석하여 준비한 콤부차와 감귤 콤부차 시료를 첨가하여 24시간 동안 처리하였다. 24시간 후 세포 이동성의 변화는 도립 현미경(CK×40-CPG30, Olympus, Japan)을 사용하여 세포가 스크래치 모서리 부분으로 자라 들어오는 정도를 40×(0.13)PhP 배율로 관찰하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 비근침윤성(표재성) 방광암 세포인 T24 세포에 대조군(시료 무첨가군, 콤부차 시료 처리 0㎎/㎖)으로서 배지만 처리한 경우, 24시간 후에 세포의 이주가 현저하게 증가하였으나, 콤부차 및 감귤 콤부차의 농도가 높아짐에 따라 세포의 이주가 억제됨을 확인할 수 있었다. 특히, 콤부차에 비해 감귤 콤부차를 4, 6, 8㎎/㎖의 농도로 처리한 경우에는 세포 이동성이 더 현저하게 억제됨을 확인할 수 있었다(도 9의 B).

실시예 6-2: 콤부차와 감귤 콤부차의 고위험도 표재성 방광암 세포(5637 cell) 이동성에 미치는 영향 평가

본 발명의 콤부차와 감귤 콤부차의 농도에 따른 고위험도 표재성 방광암 세포(5637 cell)의 이동성을 확인하기 위하여, 스크래치를 내어 세포를 제거한 내부로 점차적인 이동현상을 보이는 상처치유 분석(wound healing assay)을 수행하였다. 이때, 세포를 제거한 시점을 0시간으로 하였다.

구체적으로, 6웰 플레이트(6-well plate)에 2×10⁵ 개/웰(well)의 세포수로 5637 세포를 분주하고, 세포가 서브컨플루언스(Subconfluence) 상태에 도달할 때까지 배양하였다. 세포가 서브컨플루언스(Subconfluence) 상태에 도달하면, 200㎕ 피펫(pipet) 팁(tip) 끝으로 긁어 스크래치를 내어 세포를 제거하였다. 이후, 스크래치를 낸 5637 세포가 있는 웰로부터 상층의 배지를 제거하였다. 상층의 배지가 제거된 각 웰에 각각 0, 1, 2, 4, 6, 8 ㎎/㎖의 농도가 되도록 배지에 희석하여 준비한 콤부차와 감귤 콤부차 시료를 첨가하여 24시간 동안 처리하였다. 24시간 후 세포 이동성의 변화는 도립 현미경(CK×40-CPG30, Olympus, Japan)을 사용하여 세포가 스크래치 모서리 부분으로 자라 들어오는 정도를 40×(0.13)PhP 배율로 관찰하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 고위험도 표재성 방광암 세포인 5637 세포에 대조군(시료 무첨가군, 콤부차 시료 처리 0㎎/㎖)으로서 배지만 처리한 경우, 24시간 후에 세포의 이주가 현저하게 증가하였으나, 콤부차를 8㎎/㎖의 농도로 처리한 경우 세포의 이주가 억제됨을 확인할 수 있었다. 특히, 콤부차에 비해 감귤 콤부차를 처리한 경우에는 농도 의존적으로 세포 이동성이 더 현저하게 억제됨을 확인할 수 있었다(도 10의 B).

상기 콤부차와 감귤 콤부차의 방광암 세포 이동성에 미치는 영향을 평가한 결과를 통하여, 콤부차와 감귤 콤부차 둘 다 비근침윤성(표재성) 방광암 세포인 T24 세포와 고위험도 표재성 방광암 세포인 5637 세포의 세포 이동성을 억제함을 알 수 있었다. 또한, 상기 방광암 세포에 대해 콤부차 대비 감귤 콤부차가 세포 이동성을 더 현저하게 억제함을 알 수 있었다.

아울러, 고위험도 표재성 방광암 세포인 5637 세포보다는 비근침윤성(표재성) 방광암 세포인 T24 세포에 대해서 감귤 콤부차의 세포 이동성 억제 효과가 더 우수함을 확인하였다. 이를 통해, 초기 방광암인 비근침윤성(표재성) 방광암 예방 또는 치료에 본 발명의 감귤 콤부차를 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 7: 콤부차와 감귤 콤부차 처리에 의한 방광암 세포에 미치는 세포자멸사 (apoptosis) 효과 분석

콤부차(Kombucha, K)와 감귤 콤부차(Citrus Kombucha, CK) 처리에 의한 방광암 세포의 성장억제 및 세포 형태 변화가 세포자멸사(apoptosis)에 의한 것인지 확인하기 위하여, 비근침윤성(표재성) 방광암 세포인 T24 세포와 고위험도 표재성 방광암 세포인 5637 세포에 0, 4, 6, 8㎎/㎖ 농도의 콤부차와 감귤 콤부차를 24시간 동안 처리한 후 PE-Annexin V Kit를 이용하여 세포자멸사(apoptosis)에 의한 세포사멸의 유발 정도를 정량적으로 확인하였다.

Annexin V는 세포자멸사(apoptosis)가 발생하면 초기 단계에 막(membrane) 구조가 망가지게 되어 세포 내부에만 있던 포스파티딜 세린(Posphatidyl Serine, PS)과 같은 인지질이 세포 밖으로 노출되는데 Annexin V가 이것들과 결합하여 세포가 현재 세포자멸사(apoptosis) 초기 단계임을 확인해주는 원리로 Moxi flow cytometry로 측정하였다.

실시예 7-1: 콤부차와 감귤 콤부차 처리에 의한 비근침윤성 (표재성) 방광암 세포(T24 cell)에 미치는 세포자멸사 (apoptosis) 효과 분석

6웰 플레이트(6-well plate)에 2×10⁵ 개/웰(well)의 세포수로 T24 세포를 분주하고, 콤부차와 감귤 콤부차 시료를 각각 0, 4, 6, 8 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 후, 배지와 세포를 튜브(tube)에 옮겨 1000 rpm에서 2분간 원심분리 하였다. 분리된 세포를 차가운 인산완충식염수(cold PBS, phosphate buffer saline)로 세척하여 다시 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 상등액 제거 후, 1×콜드 바인딩 버퍼(cold binding buffer)를 첨가하여 세포수가 1×10⁵ 개가 되도록 희석하고, 여기에 5㎕의 PE-Annexin V를 넣은 후 약하게 볼텍스(vortex)하였다. 이후, 25℃에서 15분 동안 방치하고 1× 바인딩 버퍼(binding buffer) 400㎕를 넣은 후 FACS(Moxi flow cytometry, ORFLO, Cambridge, USA)로 세포자멸사(apoptosis) 유발 정도를 측정하였다.

비근침윤성(표재성) 방광암 세포인 T24 세포에 0, 4, 6, 8㎎/㎖ 농도로 콤부차와 감귤 콤부차를 각각 처리한 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 콤부차를 처리한 경우에는 각각 4.47%, 4.07%, 6.4%, 11.1% 정도로 세포자멸사(apoptosis)가 유발되었으며, 감귤 콤부차를 처리한 경우에는 각각 3.5%, 6.87%, 30.97%, 97.4% 정도의 세포자멸사(apoptosis)를 확인할 수 있었다. 특히, 8㎎/㎖ 농도로 감귤 콤부차를 처리한 경우 세포자멸성 세포 비율이 97.4%로, 세포자멸사(apoptosis)에 의한 세포사멸이 현저하게 증가됨을 확인할 수 있었다(p<0.05).

실시예 7-2: 콤부차와 감귤 콤부차 처리에 의한 고위험도 표재성 방광암 세포(5637 cell)에 미치는 세포자멸사 ( apoptosis ) 효과 분석

6웰 플레이트(6-well plate)에 2×10⁵ 개/웰(well)의 세포수로 5637 세포를 분주하고, 콤부차와 감귤 콤부차 시료를 각각 0, 4, 6, 8 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 후, 배지와 세포를 튜브(tube)에 옮겨 1000 rpm에서 2분간 원심분리 하였다. 분리된 세포를 차가운 인산완충식염수(cold PBS, phosphate buffer saline)로 세척하여 다시 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 상등액 제거 후, 1×콜드 바인딩 버퍼(cold binding buffer)를 첨가하여 세포수가 1×10⁵ 개가 되도록 희석하고, 여기에 5㎕의 PE-Annexin V를 넣은 후 약하게 볼텍스(vortex)하였다. 이후, 25℃에서 15분 동안 방치하고 1× 바인딩 버퍼(binding buffer) 400㎕를 넣은 후 FACS(Moxi flow cytometry, ORFLO, Cambridge, USA)로 세포자멸사(apoptosis) 유발 정도를 측정하였다.

고위험도 표재성 방광암 세포인 5637 세포에 0, 4, 6, 8㎎/㎖ 농도로 콤부차와 감귤 콤부차를 각각 처리한 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 콤부차를 처리한 경우 세포자멸사(apoptosis)에 의한 세포사멸의 비율이 각각 3.87%, 5.57%, 6.73%, 7.83%로 확인되었고, 감귤 콤부차를 처리한 경우에는 각각 3.87%, 6.27%, 7.3%, 15.73%로 확인되었다(p<0.05).

상기 콤부차와 감귤 콤부차 처리에 의한 방광암 세포에 미치는 세포자멸사(apoptosis) 효과 분석을 통하여, 비근침윤성(표재성) 방광암 세포인 T24 세포에 대한 콤부차의 세포사멸 비율이 처리 농도에 관계없이 모두 11% 이하임을 알 수 있었으며, 반면, 6 및 8㎎/㎖의 농도로 감귤 콤부차를 처리한 경우에는 세포자멸사(apoptosis)에 의한 세포사멸 유발 정도가 38%, 97%로 높음을 확인할 수 있었다. 한편, 고위험도 표재성 방광암 세포인 5637 세포에서는 콤부차와 감귤 콤부차 둘 다 처리 농도에 관계없이 세포자멸사로 인한 세포사멸의 비율이 모두 11% 이하임을확인할 수 있었다. 이를 통해, 초기 방광암인 비근침윤성(표재성) 방광암 예방 또는 치료에 본 발명의 감귤 콤부차를 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 8: 콤부차와 감귤 콤부차 처리에 따른 방광암 세포에 대한 세포자멸사 (apoptosis) 관련 단백질의 발현조절능 분석

콤부차(Kombucha, K)와 감귤 콤부차(Citrus Kombucha, CK)에 의한 방광암 세포의 세포자멸사(apoptosis) 관련 단백질 및 유전자를 살펴보기 위하여, 단백질을 크기별로 분리한 후 항원-항체 반응을 이용하여 전체 단백질에서 특정 단백질만을 탐지(detection) 하는 원리로 웨스턴 블롯 분석(western blot assay)을 실시하였다. 이때, 웨스턴 블롯 분석에 사용한 항체(Antibody) 종류는 하기 표 4와 같으며, β-액틴(β-Actin)은 콤부차와 감귤 콤부차를 농도별로 처리한 방광암 세포 T24 세포와 5637 세포에 대한 내부 대조군(internal control)으로 사용하였다.

구체적으로, 비근침윤성(표재성) 방광암 세포인 T24 세포와 고위험도 표재성 방광암 세포인 5637 세포를 각각 1×10⁶ 개/㎖의 세포수로 페트리 디쉬(Petri dish)에 분주하고, 콤부차와 감귤 콤부차 시료를 각각 0, 4, 6, 8 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 후, 각 농도별로 콤부차와 감귤 콤부차 시료를 처리한 각각의 세포를 스크레퍼(scraper)를 이용하여 회수하였다. 회수한 세포는 인산완충식염수(PBS, phosphate buffer saline)로 세척하였다. 세척 후, 각각의 세포 시료에 단백질 용해 버퍼(protein lysis buffer)를 첨가하여 세포를 파괴하고, 1000 rpm에서 2분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 얻은 각각의 상등액의 단백질을 BCA(Bicinchoninic acid)를 이용하여 정량하고 샘플(sample)로 사용하였다.

12% SDS-PAGE(12% gradient sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 겔(gel)에 상기에서 수득한 각각의 상등액의 단백질을 동량 로딩(loading)하고 3시간 동안 단백질을 분리하였다. 상기 분리한 단백질을 0.45 ㎛ 크기의 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인(polyvinyliden fluoride(PVDF) membrane)에 2시간 동안 트랜스퍼(transfer)한 후, 상기 멤브레인은 5%의 탈지분유(skim-milk)로 블로킹(blocking)하였다. 블로킹(blocking) 완료 후, TBS-T(Tris Buffered Saline-Tween 20)로 멤브레인을 세척하고, 4℃에서 1차 항체(antibody)를 오버나이트(overnight)로 반응시켰다. 오버나이트 반응 후, 멤브레인을 10분간 3회씩 TBS-T로 세척하고 2차 항체를 1시간 동안 반응시켰다. 2차 항체 반응 후, ECL 용액(ECL(enhanced chemiluminescent)-solution)과 반응시켜 단백질 ECL 화상분석 시스템(Fusion-FX7 Advance, VILBER, Europe)을 이용하여 콤부차와 감귤 콤부차 처리에 따른 방광암 세포에 대한 세포자멸사(apoptosis) 관련 단백질의 발현 정도를 측정하였다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 콤부차를 처리한 경우와 비교하여, 비근침윤성(표재성) 방광암 세포인 T24 세포에 6 및 8㎎/㎖ 농도의 감귤 콤부차를 처리한 경우, 항세포사멸(Anti-apoptotic) 단백질인 Bcl-2의 발현이 감소하였고, 전세포사멸(Pro-apoptotic) 단백질인 Bax의 발현은 유의적인 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 또한 활성형인 절단된 카스파제-3(Cleved caspase-3), 절단된 카스파제-8(Cleved caspase-8), 절단된 카스파제-9(Cleved caspase-9)의 발현은 농도 의존적으로 증가되었고, 비활성형인 프로 카스파제-3(Pro caspase-3), 프로 카스파제-8(Cleved caspase-8), 프로 카스파제-9(Cleved caspase-9)의 발현은 농도 의존적으로 감소되었으며, 카스파제-3(caspase-3)에 의해 종양촉진복합단백질(PARP, poly-ADP ribose polymerase)의 분해가 일어나 절단된 PARP(Cleaved PARP)의 발현량이 증가됨을 확인할 수 있었다. 반면, 상기 세포자멸사(apoptosis) 관련 단백질은 콤부차를 처리한 경우에는 농도별 발현 차이를 보이지 않았다.

한편, 도 14에 나타난 바와 같이 고위험도 표재성 방광암 세포인 5637 세포에 콤부차와 감귤 콤부차를 처리하고 상기 세포자멸사(apoptosis) 관련 단백질의 발현 정도를 비교해 본 결과, 5637 세포에 대해서는 콤부차와 감귤 콤부차 둘 다 농도별 발현 차이를 보이지 않았다.

이를 통하여, 콤부차 보다 감귤액을 첨가한 감귤 콤부차가 고위험도 표재성 방광암 세포인 5637 세포에 비해 악성도가 낮은 비근침윤성(표재성) 방광암 세포인 T24 세포에 카스파제(caspase)에 의한 세포자멸사(apoptosis)를 유도함을 확인함으로써, 초기 방광암인 비근침윤성(표재성) 방광암 예방 또는 치료에 본 발명의 감귤 콤부차를 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.

종합하면, 상기 일련의 결과들을 통하여, 특히 감귤액을 첨가하여 배양한 감귤 콤부차가 일반 콤부차보다 높은 항산화능 및 총 폴리페놀 함량을 확인할 수 있었으며, 비근침윤성(표재성) 방광암인 T24 세포의 성장 억제 및 세포자멸사(apoptosis) 유발 관련 단백질 발현을 조절함을 확인함으로써, 감귤 콤부차가 초기 방광암의 진행을 억제할 수 있고, 예방 및 치료에 효과적임을 알 수 있었다.

실시예 9: 통계처리

본 발명에서 수행한 실험은 독립적으로 3번 이상 반복 실험하였으며, 실험 결과는 통계분석용 프로그램 SPSS Version 18.0 package program을 이용하여 각 실험 군의 평균과 표준편차를 계산하고 t-test 분석, ANOVA 분석 후 Ｐ=0.05 수준에서 Dancan's multiple range test를 이용하여 처리군 간의 유의성을 검증하였다.

Claims (5)

1. 감귤 콤부차 발효액을 유효성분으로 포함하는 방광암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 방광암은 비근침윤성(표재성) 방광암인 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 방광암의 예방 또는 치료는 암세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유도함으로써 달성되는 것이 특징인 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 감귤 콤부차 발효액은 콤부차 배양시 감귤액을 첨가하여 발효 제조한 것이 특징인 약학적 조성물.
   
5. 감귤 콤부차 발효액을 유효성분으로 포함하는 방광암 예방 또는 개선용 식품 조성물.

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