CN110237081A - 低极性稀有人参皂苷混合物δ(20-21)ppd/δ(20-22)ppd及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，涉及一种低极性稀有人参皂苷Δ(20‑21)PPD/Δ(20‑22)PPD混合物及在制备用于治疗和/或预防肿瘤和/或癌症的药物和/或保健品中的用途；以及其在制备用于免疫调节、改善微循环、提高生命质量的药物和/或保健品中的用途。本发明进一步提供了包含有低极性稀有人参皂苷Δ(20‑21)PPD/Δ(20‑22)PPD混合物的组合物及其用途。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一类低极性稀有人参皂苷混合 物及其用途，以及其在抗肿瘤方面的药理机制。
背景技术
癌症是残害人类生命的世界第二大疾病，死亡率仅次于心脑血 管疾病，是人类死亡的最主要因素之一。由世卫组织组织下属的的 官方癌症机构国际癌症研究中心(IARC)负责的最新版《世界癌症 报告》预测，全球癌症病例将呈现迅猛增殖态势，由2012年的1400万人，逐年迅增至2025年的1900万人，到2035年将达到 2400万人。报告还显示，2012年全球新增癌症病例有近一半出现在 亚洲，其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居首位。2012年中 国新增307万癌症患者并造成约220万人死亡，分別占全球总量的 21.9％和26.8％。世卫的数据略低于中国自己的统计。全国肿瘤登记 中心发布的2012年数据显示，中国每年新增癌症病例约350万，约 有250万人因此死亡。
现今癌症的常用治疗方法主要有三种模式：手术、放疗和药物 治疗，而选定哪个治疗方法则取决于肿瘤的位置、恶性程度、发展 程度以及病人身体状态。三种模式中，手术的治疗方法，常因为癌 细胞入侵蔓延到邻近组织或远端转移而效果有限；放疗的治疗方法，则受限于对体内其他正常组织造成的伤害；药物的治疗方法， 对于晚期弥散性和转移性恶性肿瘤是最基本的治疗方法。过去的几 十年里，着眼于直接杀伤肿瘤细胞的化疗虽有明显的发展和进步， 成为肿瘤药物治疗的中坚，但这一治疗模式对增殖缓慢的实体瘤效果差、药物选择性小、毒副反应多且严重的缺陷成为临床治疗中的 重要限制因素。继手术、放疗和化疗之后的第四种模式是肿瘤的生 物治疗，其主要是通过肿瘤宿主防御机制或生物制剂的作用来调节 机体自身的生物学反应，从而抑制或消除肿瘤；生物治疗虽然没有太大毒副作用，但由于技术要求严、工艺复杂，因此价格高，众多 癌症患者及家属难以承受，影响其在癌症治疗领域的普及。
由于存在上述各种限制，天然抗肿瘤药物的研发取得了越来越 多的关注。天然抗癌药物无论是在抑制或杀伤肿瘤细胞、调整机体 免疫功能、改善症状与特征和减轻放化疗毒副作用上，还是在肿瘤 的病后调理上，均具有重要作用。由此，天然植物新疗法将成为继手术、放疗、化疗和生物疗法之后的第五种模式。
五加科(araliaceae)人参属(Panax)植物，如人参(P. ginseng)、西洋参(P.quenquefolinus)、三七(P.notoginseng)、竹 节参(P.uaponicus)，葫芦科绞股蓝属植物绞股蓝(Gynostemma oentaphyllum Thrunb Mak)等均为中国名贵的传统药用植物，其主要有效成分为达玛烷型四环三萜人参皂苷系列化合物。目前已发现 五加科植物中的原型人参皂苷有60多种，命名为R1、Ral、Ra2、 Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、F等，皆由 甙元和糖组成，通常易溶于水，其疗效主要包括：免疫调节功能、 改善微循环作用、调节消化机能、增强记忆和学习能力、抗衰老、 安神等，但并没有表现出明显的抗肿瘤活性。
低极性稀有人参皂苷在原人参属植物中含量甚微，只存在于野 山参，或者红参、黑参和熟三七等炮制的人参和三七产品中，也仅 为万分之几，且难溶于水，通常只溶解在乙醇或乙酸乙酯等低极性 有机溶剂中，被称为低极性稀有人参皂苷，主要包括：Rg3、Rh2、Rk1、Rg5、Rk2、Rh3、Rk3、Rh4、Δ(20-21)PPD、Δ(20-21)PPT 等。低极性稀有人参皂苷除了具有普通原型人参皂苷原有的生物活 性之外，还表现出原型皂苷不具有的抗肿瘤、抗病毒等全新的药物 活性，具有极高的药用价值和应用前景。
上述两种低极性稀有人参皂苷在其广谱的抗癌活性以及有效性 方面仍未体现出绝对的优势，对于它们联合抗癌的研究意义重大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有广谱的高抗癌有效性 的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD，本发明 提供了工业化制造高含量的所述低极性稀有人参皂苷混合物的组成 单体Δ(20-21)PPD和Δ(20-22)PPD方法，以及混合物Δ(20- 21)PPD/Δ(20-22)PPD在用于制备治疗和/或预防肿瘤和/或癌症的 药物中的用途，和在用于制备免疫调节、改善微循环、提高生命质 量的保健品中的用途。本发明进一步提供了混合物Δ(20-21)PPD/Δ (20-22)PPD在抗癌用途中的部分药理作用机制。本发明最后提供了 包含有低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD的 组合物及其用途。
本发明一方面提供了所述的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20- 21)PPD/Δ(20-22)PPD，其由具有如下结构式的
低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-21)PPD和具有下列结构式
的低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-22)PPD混合而成，Δ(20- 21)PPD和Δ(20-22)PPD在化学结构上属于同分异构体。
所述低极性人参皂苷单体Δ(20-21)PPD与低极性人参皂苷Δ(20- 22)PPD的重量比为1:5～7:1,优选为1:2～1:5，进一步优选为1:3。 我们在实验中令人惊奇地发现：两种同分异构体的结合在药效上产 生了显著的协同增效作用，抗癌抑癌效果显著地优于Δ(20-21)PPD 和Δ(20-22)PPD单体。
本发明第二方面提供了该低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20- 21)PPD/Δ(20-22)PPD在制备用于治疗和/或预防肿瘤和/或癌症的 药物中的用途。
其中所述的肿瘤和/或癌症选自：
恶性肿瘤，包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝 癌、肺癌、头和颈癌、食管癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、 子宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和/或皮肤癌；
淋巴系统的造血肿瘤，包括但不限于白血病、急性淋巴细胞白血 病、急性成淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴癌、T-细胞淋巴癌、霍奇 金淋巴癌、非-霍奇金淋巴癌、毛细胞淋巴癌、外套细胞淋巴瘤、骨 髓瘤和/或Burkett氏淋巴癌；
骨髓系统的造血肿瘤，包括但不限于急性和慢性髓细胞性白血 病、骨髓增生异常综合征和/或前髓细胞性白血病；
间质成因的肿瘤，包括但不限于纤维肉瘤和/或横纹肌肉瘤；
中枢和周围神经系统的肿瘤，包括但不限于星形细胞瘤、成纤维 神经瘤、神经胶质瘤和/或神经鞘瘤；以及
黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、外生性色素颈瘤、甲状 腺滤囊癌和/或卡波氏肉瘤。
本发明第三方面提供了低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20- 21)PPD/Δ(20-22)PPD在抗癌用途中的部分药理作用机制，为其在 临床运用中提供更为确切和深入的理论基础。
本发明第四方面提供了低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20- 21)PPT/Δ(20-22)PPT的另一个用途中，表现在制备用于免疫调节、 改善微循环、提高生命质量的保健品中的用途。
本发明第五方面提供了一种组合物，包括所述低极性稀有人参 皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD。
在一优选例中，所述组合物为药物制剂，所述药物制剂还包括 药学可接受的稀释剂、载体、赋形剂、辅料或媒介物。
在一优选例中，所述药物制剂的剂型为口服剂型、注射剂型或 局部用药剂型。
在一优选例中，所述口服剂型为片剂、粉剂、悬浊液、乳浊 液、胶囊、颗粒剂、糖衣片、药丸、液体、醑剂、糖浆或柠檬水 剂。
在一优选例中，所述注射剂型包括水剂、悬浊液或溶液。
在一优选例中，所述局部用药剂型包括软膏、固体、悬浊液、 水剂、醑剂、粉剂、糊剂、栓剂、气溶胶、泥敷剂、涂抹剂、洗 剂、灌肠剂或乳剂。
在一优选例中，所述组合物用于治疗和/或预防肿瘤和/或癌 症；
其中所述的肿瘤和/或癌症选自：
恶性肿瘤，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺 癌、头和颈癌、食管癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈 癌、甲状腺癌、前列腺癌和皮肤癌；
淋巴系统的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急 性成淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴癌、T-细胞淋巴癌、霍奇金淋巴 癌、非-霍奇金淋巴癌、毛细胞淋巴癌、外套细胞淋巴瘤、骨髓瘤和 Burkett′s氏淋巴癌；
骨髓系统的造血肿瘤，包括急性和慢性髓细胞性白血病、骨髓 增生异常综合征和前髓细胞性白血病；
间质成因的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；
中枢和周围神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成纤维神经 瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；以及
其他肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、外生 性色素颈瘤、甲状腺滤囊癌和卡波氏肉瘤。
在一优选例中，所述组合物为保健品，还包括任选的保健品中可接 受的载体。
在一优选例中，所述组合物用于免疫调节、改善微循环和/或提 高生命质量。
本发明使用的术语具有以下定义，除非另有描述：
本文所用的术语“低极性”，是指相对于普通人参皂苷而言，含 量稀少的Rg3、Rh2、Rk2、Rh3、Δ(20-21)PPD、Δ(20-22)PPD等 难溶于水，只能溶解在低极性有机溶剂中。
本文所用的术语“组合物”意指包括包含指定量的各指定成分的 产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产 品。所述局部用药剂型包括软膏、固体、悬浊液、水剂、醑剂、粉 剂、糊剂、栓剂、气溶胶、泥敷剂、涂抹剂、洗剂、灌肠剂或乳 剂。在无菌条件下将活性化合物与药学可接受的载体和任何所需的 防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。眼用制剂、眼软膏剂、散剂和溶液 剂也被考虑在本发明范围内。
当用于上述治疗或其他治疗时，治疗和/或预防有效量的一种本 发明化合物可以以纯形式应用，或者以药学可接受的盐、酯或前药 形式(在存在这些形式的情况下)应用。或者，所述化合物可以以 含有该目的化合物与一种或多种药学可接受的赋形剂的药物组合物 给药。词语“治疗和/或预防有效量”的本发明化合物指以适用于任 何医学治疗的合理效果/风险比治疗障碍的足够量的化合物。但应 认识到，本发明化合物和组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的 医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗和/ 或预防有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的 障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的 具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所 采用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领 域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，化合物的剂量从低于 为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到 所需的效果。
本发明还提供包含任选地与一种或多种无毒药学可接受的稀释 剂、载体、赋形剂、辅料或媒介物配制在一起的本发明化合物的药 物制剂。所述药物制剂可特别专门配制成以固体或液体形式供口服 给药、供胃肠外注射或供直肠给药。
本发明的药物组合物可通过口服、直肠、胃肠外、池内、阴道 内、腹膜内、局部(如通过散剂、软膏剂或滴剂)、口颊给予人类和 其他哺乳动物，或者作为口腔喷雾剂或鼻腔喷雾剂给予。本文所用 术语“胃肠外”指包括静脉
内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输液的给 药方式。
在另一个方面，本发明提供包含本发明成分和生理可耐受稀释 剂的药物组合物。本发明包括一种或多种上述化合物，其与一种或 多种无毒生理可耐受或可接受的稀释剂、载体、辅料或媒介物(本 文将它们统称为稀释剂)一起配制成组合物，以供胃肠外注射、鼻内传递、以固体或液体形式口服给药、直肠或局部给药等等。
适合于胃肠外注射的组合物可包括生理上可接受的无菌含水或 非水溶液剂、分散剂、混悬剂或乳剂，及供重构成无菌可注射溶液 剂或分散剂的无菌散剂。合适的含水或非水载体、稀释剂、溶剂或 媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、植物油(如橄榄油)、可注射有机酯如油酸乙酯及它们的合适 混合物。
这些组合物也可含有辅料，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散 剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金酯类、三氯叔丁 醇、苯酚、山梨酸等，可确保防止微生物的作用。还期望包括等渗 剂，例如糖类、氯化钠等。通过使用能延迟吸收的物质，例如单硬 脂酸铝和明胶，可达到可注射药物形式的延长吸收。
混悬剂中除活性化合物外还可含有悬浮剂，例如乙氧基化异十 八醇、聚氧乙烯山梨醇和聚氧乙烯失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、 偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶或者这些物质的混合物等。
在一些情况下，为延长药物的作用，期望减慢皮下或肌内注射 药物的吸收。这可通过使用水溶性差的晶体或无定形物质的液体混 悬剂来实现。这样，药物的吸收速度取决于其溶解速度，而溶解速 度又可取决于晶体大小和晶型。或者，胃肠外给药的药物形式的延 迟吸收通过将该药物溶解于或悬浮于油媒介物中来实现。
可注射贮库制剂形式可通过在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚 乙交酯(polylactide-polyglycolide)中形成药物的微胶囊基质来制 备。可根据药物与聚合物之比和所采用的具体聚合物的性质，对药 物释放速度加以控制。其他生物可降解聚合物的实例包括聚原酸酯 类(poly(orthoesters))和聚酐类(poly(anhydrides))。可注射贮库制剂也可通过将药物包埋于能与身体组织相容的脂质体或微乳中来制 备。
可注射制剂可例如通过用滤菌器过滤或通过掺入无菌固体组合 物形式的灭菌剂来灭菌，所述固体组合物可在临用前溶解或分散于 无菌水或其他无菌可注射介质。
供口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒 剂。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性的药学可接 受的赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下物质混合：a)填 充剂或增量剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖 和阿拉伯树胶；c)保湿剂如甘油；d)崩解剂如琼脂、碳酸钙、马铃 薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液阻滞剂如石 蜡；f)吸收加速剂如季铵化合物；g)湿润剂如鲸蜡醇和甘油单硬脂 酸酯；h)吸附剂如高岭土和膨润土以及i)润滑剂如滑石粉、硬脂 酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和它们的混合 物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型中也可包含缓冲 剂。
相似类型的固体组合物使用赋形剂例如乳糖及高分子量聚乙二 醇等，也可用作软胶囊和硬胶囊中的填充物。
片剂、糖衣丸剂(dragees)、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型 可与包衣和壳料如肠溶衣材和医药制剂领域公知的其他衣材一起制 备。这些固体剂型可任选含有遮光剂，且其组成还可使其只是或优 先地在肠道的某个部位任选以延迟方式释放活性成分。可以使用的 包埋组合物的实例包括高分子物质和蜡类。如果适合，活性化合物 也可与一种或多种上述赋形剂配成微囊形式。
供口服给药的液体剂型包括药学可接受的乳剂、溶液剂、混悬 剂、糖浆剂和酏剂。液体剂型除含有活性化合物外还可含有本领域 常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂例如乙 醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、 1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉 米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇(tetrahydrofurfuryl alcohol)、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯 及它们的混合物。口服组合物除包含惰性稀释剂外还可包含辅料， 例如湿润剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香味剂。
供直肠或阴道给药的组合物优选是栓剂。栓剂可通过将本发明 化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或栓 剂蜡混合来制备，它们在室温下为固体，但在体温下则为液体，因 此可在直肠腔或阴道腔内熔化而释放出活性化合物。
本发明化合物也可以脂质体形式给药。如本领域所公知，脂质 体通常用磷脂或其他脂类物质制得。脂质体由分散于含水介质中的 单层或多层水化液晶所形成。任何能够形成脂质体的无毒、生理上 可接受和可代谢的脂质均可使用。脂质体形式的本发明组合物除含 有本发明化合物外，还可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的 脂类是天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，它们可单独或者 一起使用。形成脂质体的方法是本领域公知的。
本文所用的术语“药学可接受的前药”代表本发明化合物的前 药，其在可靠的医学判断范围内适合用于与人类和低等动物的组织 接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，与合理的效果/风 险比相称且对其预定用途有效，在可能的情况下还代表本发明化合 物的两性离子形式。本发明的前药可例如通过在血液中水解而在体 内快速转化成上式的母体化合物。
本发明提供的本发明的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PP D/Δ(20-22)PPD具有抑制人肿瘤细胞(21种已测肿瘤细胞)及人脐静 脉内皮细胞增殖的抗肿瘤活性，其广谱高抗癌活性优于同类对照药低 极性稀有低极性稀有人参皂苷单体Rg3，其有效性优于同类对照药Rg 3和非同类对照药紫杉醇。且该人参皂苷混合物Δ(20-21)PPT/Δ(20 -22)PPT可在SK-HEP-1细胞中可通过降低细胞周期调控蛋白Cyclin D 1和CDK4而有效阻滞细胞生长于G1期；在纤维肉瘤细胞HT1080和非小 细胞肺癌细胞A549中亦可通过活化胱天蛋白酶3而不同程度的促进与 用药浓度成正比的肿瘤细胞自体凋亡。该低极性稀有人参皂苷混合物 Δ(20-21)PPT/Δ(20-22)PPT可以被制成用于治疗和/或预防不同癌 症和/或肿瘤的药物，以及用于免疫调节和/或改善微循环和/或提高 生命质量的保健品，重点应用于恶性肿瘤的治疗，具有广阔的应用前 景。
说明书附图说明
图1为Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)调节SK-HEP-1细胞周期实 验检测结果图。
图2为Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)调节SK-HEP-1细胞中Cycl in D1和CDK4蛋白表达水平检测结果图。
图3为Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)促进HT1080细胞凋亡实 验检测结果图。
图4为Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)促进A549细胞凋亡实验 检测结果图。
图5为Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)对HT1080细胞中胱天蛋 白酶3活性的影响检测结果图。
图6为Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)对A549细胞中胱天蛋白 酶3活性的影响检测结果图。
具体实施方式
除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般 含义。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这 些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例 中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或 条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商 者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD 及其制备方法
本实施例提供了一种低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20- 21)PPD/Δ(20-22)PPD，其由具有如下结构式的
低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-21)PPD和具有下列结构式
的低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-22)PPD以重量比1:3； 1:5；1:2和7:1的比例混合而成。
具体制备方法如下：
(1)称取8.75mg的低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-21)PPD(由 加拿大皇家植物药有限公司Canada Royal Enoch Phytomedicine Ltd 提供)和1.25mg的低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-22)PPD(由加拿 大皇家植物药有限公司Canada Royal EnochPhytomedicine Ltd提 供)，以重量比7:1的比例混合均匀，得到低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(7:1)。
(2)称取2.50mg的低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-21)PPD(由 加拿大皇家植物药有限公司Canada Royal Enoch Phytomedicine Ltd 提供)和7.50mg的低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-22)PPD(由加拿 大皇家植物药有限公司Canada Royal EnochPhytomedicine Ltd提 供)，以重量比3:1的比例混合均匀，得到低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPT/Δ(20-22)PPT(1:3)。
(3)称取1.67mg的低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-21)PPD(由加 拿大皇家植物药有限公司Canada Royal Enoch Phytomedicine Ltd提 供)和8.33mg的低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-22)PPD(由加拿大 皇家植物药有限公司Canada Royal EnochPhytomedicine Ltd提供)， 以重量比1:5的比例混合均匀，得到低极性稀有人参皂苷混合物 Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:5)。
(4)称取3.33mg的低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-21)PPD(由加 拿大皇家植物药有限公司Canada Royal Enoch Phytomedicine Ltd提 供)和6.67mg的低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-22)PPD(由加拿大 皇家植物药有限公司Canada Royal EnochPhytomedicine Ltd提供)， 以重量比1:2的比例混合均匀，得到低极性稀有人参皂苷Δ(20- 21)PPD/Δ(20-22)PPD混合物(1:2)。
实施例2：不同混合比例的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20- 21)PPD/Δ(20-22)PPD体外抑制多类肿瘤细胞增殖实验
实验样品：
测试药物：实施例1制备得到的三种比例的低极性稀有人参皂 苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD。
对照药物：紫杉醇(SELLECK；Cat.#S1150)；低极性稀有人 参皂苷单体Rg3(自上海源叶生物科技有限公司购买，商品货号为 B21059)；低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-21)PPD(由加拿大皇家植 物药有限公司Canada Royal Enoch Phytomedicine Ltd提供)；低极性 稀有人参皂苷单体Δ(20-22)PPD(由加拿大皇家植物药有限公司 Canada Royal EnochPhytomedicine Ltd提供)。
实验步骤：
以22种细胞系(包括21种肿瘤细胞系和1种人脐静脉内皮细 胞系)为实验用细胞系，取对数生长期细胞(3×104/mL至2.5 ×105/mL)，以每孔100μL接种在96孔板内，每个细胞系用一个96 孔板；然后，除对照药紫杉醇以外，以高浓度150μM至低浓度2 μM取7个对数递减浓度(每个浓度设两个复孔)，分别加入测试药 物溶液和对照药物溶液(测试药物溶液或对照药物溶液配制：分别 采用测试药物或对照药物溶于0.5％的DMSO溶液)500nL。紫杉醇 的加入浓度为由高浓度1μM至低浓度0.0014μM的7个三倍递减 浓度。经测试/对照药物溶液作用72小时后，用 (Promega；Cat.#G7573)发光细胞活力检测法求出各细胞系中的每 种药物的每个浓度对该系细胞的增殖抑制百分率，并绘制量效关系 图，最后根据图中曲线测算IC50和最高抑制百分率(Emax)，如表 1、表2所示。
表1：不同混合比例的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20- 21)PPD/Δ(20-22)PPD以及对照药Rg3、Δ(20-21)PPD和Δ(20-22)PPD抑 制细胞增殖活性检测结果
表2：不同混合比例的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20- 21)PPD/Δ(20-22)PPD以及对照药物紫杉醇、Rg3、Δ(20-21)PPD和 Δ(20-22)PPD抑制细胞增殖有效性检测结果
注:表1、表2及上下文出现的术语表达的含义如下：
Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(7:1)代表低极性稀有人参皂苷混合物 Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD中的Δ(20-21)PPD与Δ(20-22)PPD的重 量比为7:1，即实施例1得到的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21) PPD/Δ(20-22)PPD。
Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)代表低极性稀有人参皂苷混合 物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD中的Δ(20-21)PPD与Δ(20-22)PPD的 重量比为1：3，即实施例1得到的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20- 21)PPD/Δ(20-22)PPD。
Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:5)代表低极性稀有人参皂苷混合 物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD中的Δ(20-21)PPD与Δ(20-22)PPD的 重量比为1:5，即实施例3得到的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-2 1)PPD/Δ(20-22)PPD。
使用SPSS Statistics软件(提供者：IBM corporation,软件版本: XL fit 21)提供统计学分析。用重复测量变异数分析(Repeated me asure ANOVA)检测表1至表2中每组平均值之间的差异是否呈现统计 显著(P<0.05或P<0.01)，再用Bonferroni T tests事后检定进一 步探求每组平均数差异原因。
分析结果：
(1)表1显示，当不同混合比例的低极性稀有人参皂苷混合物Δ (20-21)PPD/Δ(20-22)PPD在22个细胞系中的平均IC50分别与对照药 物低极性稀有人参皂苷单体Rg3、Δ(20-21)PPD和Δ(20-22)PPD的平 均IC50比较时，低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22 )PPD(7:1)与对照药物低极性稀有人参皂苷单体Rg3、Δ(20-21)PPD 和Δ(20-22)PPD之间的差异呈现统计显著(P<0.01)；而低极性稀 有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)与三种对照药 物低极性稀有人参皂苷单体Rg3、Δ(20-21)PPD和Δ(20-22)PPD，以 及混合比例为1:5的低极性稀有人参皂苷混合物相比均有明显差异( P<0.01)；最后，低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20- 22)PPD(1:5)与对照药物低极性稀有人参皂苷单体Rg3、Δ(20-22)P PD，以及与低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD (1:3)的差异均呈现统计显著(P<0.01)。此外，对照药物之间除 Δ(20-21)PPD和Δ(20-22)PPD的组合无显著差异(P>0.05)外，其 余组合方式均有明显差异(P<0.01)。
(2)表2显示，当不同混合比例的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20 -21)PPD/Δ(20-22)PPD在22个细胞系中的平均最高抑制百分率分别 与对照药物紫杉醇、低极性稀有人参皂苷单体Rg3、Δ(20-21)PPD和 Δ(20-22)PPD比较时，低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ (20-22)PPD(7:1)与对照药物紫杉醇、低极性稀有人参皂苷单体 Rg3、Δ(20-22)PPD之间的差异呈现统计显著(P<0.01)，且其与另 外两种比例(1:3和1:5)的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PP D/Δ(20-22)PPD之间也有明显差异(Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(7 :1)比Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)的P<0.05；Δ(20-21)PP D/Δ(20-22)PPD(7:1)比Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:5)的P< 0.01)；而低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD( 1:3)与所有四种对照药物以及其余比例的低极性稀有人参皂苷混合 物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD之间的平均最高抑制百分率均有明显差异(Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)比Δ(20-21)PPD/Δ(20-2 2)PPD(7:1)的P<0.05；比其余任一药物的P<0.01)；低极性稀有人 参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:5)除与低极性稀有人 参皂苷单体Δ(20-21)PPD之间的平均最高抑制百分率无明显差异外，与其余任一药物之间都有统计性显著差异(P<0.01)。最后， 对照药物之间的任一组合方式均有明显差异(P<0.05和/或P<0.0 1)。
实验结论：
(1)不同比例的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ (20-22)PPD在所有22种所测细胞系中的抑制细胞增殖活性和有效 性均不同程度的高于非同类对照药物紫杉醇以及同类对照药物低极 性稀有人参皂苷单体Rg3和该低极性稀有人参皂苷混合物的单体Δ (20-21)PPD、Δ(20-22)PPD，表明两种同分异构体低极性稀有人参 皂苷单体Δ(20-21)PPD、Δ(20-22)PPD的结合在药效上产生了增效 作用。
(2)在所有被测细胞系中，当低极性稀有人参皂苷混合物Δ (20-21)PPD/Δ(20-22)PPD中的Δ(20-21)PPD和Δ(20-22)PPD以重 量比为1:3的比例混合时，其活性和有效性高于另外两种混合比例
(3)在所有被测细胞系中，低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20- 21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)在肝腺癌SK-HEP-1细胞系中具有最高抑 制细胞增殖活性(IC50<1μM)；抑制细胞增殖活性排在其次的细胞 系是人纤维肉瘤细胞HT1080(IC50＝10.51μM)。
(4)低极性稀有极性稀有人参皂苷单体Δ(20-21)PPD、Δ (20-22)PPD的有效性不同程度的高于非同类对照药紫杉醇和同类对 照药Rg3，且低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-21)PPD的有效性更进 一步高于Δ(20-22)PPD。此结果表明两种人参皂苷衍生物单体具有广泛的高抗癌有效性，且其在侧链上的细微差别对它们的抗癌效果 有一定影响。
(5)低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20- 22)PPD(1:3)对所有被测细胞系的最高抑制百分率(有效性)都非常 接近100％，这意味着它具有广泛的高抗癌有效性。而非同类对照药 紫杉醇和同类对照药物低极性稀有人参皂苷单体Rg3分别只对2种 和1种细胞系有近100％的抑制率。且该比例的低极性稀有人参皂苷 混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD的有效性也不同程度的高于其 单体Δ(20-21)PPD、Δ(20-22)PPD。
另外，将实施例1中第四种比例的低极性稀有人参皂苷Δ(20- 21)PPD/Δ(20-22)PPD混合物(1:2)进行上述体外抑制多类肿瘤细胞增 殖实验，发现其对所有18种所测细胞系中的抑制细胞增殖活性和有 效性均不同程度的高于非同类对照药物紫杉醇以及同类对照药物低 极性稀有人参皂苷单体Rg3和该低极性稀有人参皂苷混合物的单体 Δ(20-21)PPD、Δ(20-22)PPD，其活性和有效性高于单体Δ(20- 21)PPD、Δ(20-22)PPD为7:1的混合比例，与1:5的混合比例相 当，稍逊于两种单体为1:3的混合比例。
实施例3：Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)调节细胞周期分布实验
实验样品：
实施例1制备得到的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/ Δ(20-22)PPD(1:3)；
实验步骤：
以肝腺癌细胞SK-HEP-1作为实验用细胞系，在96孔板内每孔接 种5000个，放置在细胞培养箱中培养贴壁过夜；然后，对96孔板的 SK-HEP-1细胞，用Tecan D300e digitaldispenser加入板孔终浓 度为16μM,32μM,64μM，96μM(即Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD (1:3)作用于SK-HEP-1细胞72h后抑制该细胞增殖的IC50值的1 倍，2倍4倍及6倍浓度)的测试药物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD (1:3)。测试药物溶解于DMSO溶液中，每个浓度设两个复孔，96孔 板中DMSO每孔最终含量为0.5％，且只含0.5％的DMSO溶液为空白对 照孔。经测试药物/对照溶液作用48小时后，将待检测的96孔板中 细胞培养液移去，每孔加入100μL含80％乙醇的冷(-20℃)磷酸 盐溶液(PBS)放置于4℃冰箱。固定细胞30min后，每孔加入100μL磷酸盐冲洗两次，移除磷酸盐溶液后再加入100μL 0.2mg/ml 核糖核酸酶(RNase)的磷酸盐溶液,并在37℃环境中培养45分 钟。最后，吸去核糖核酸酶溶液并每孔加入100μL浓度为10μM 的碘化丙啶(Propidium iodide)，室温避光培养15分钟后，待测样 品用荧光微孔板细胞分析仪Acumen eX3检测荧光信号并定量分析各 细胞周期的百分比,如图1所示。
使用SPSS Statistics软件(提供者：IBM corporation,软件版本: XL fit 21)提供统计学分析。用独立样本检验(independent-sample T-test)来检测各细胞周期中，不同浓度的药物组与对照组之间平均 细胞周期百分比的差异是否呈现统计显著(P<0.05或P<0.01)。
如图1：Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)调节SK-HEP-1细 胞周期实验检测结果。数据用两次实验重复的平均值±标准差的形式 展示。柱状图表示SK-HEP-1细胞在对照溶液(只含0.5％的DMSO溶 液)和终浓度为16μM,32μM,64μM(即Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD (1:3)作用于SK-HEP-1细胞72h后抑制该细胞增殖的IC50值的1 倍，2倍及4倍浓度)的Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)溶液中 作用48小时后各细胞周期分布的百分比。(6倍浓度的Δ(20-21)PPD/ Δ(20-22)PPD(1:3)在作用48小时后的结果未显示，因为该浓度已经过高的抑制了SK-HEP-1细胞的增殖，导致剩余细胞数量不足以完 成Acumen eX3细胞周期分析)。柱状图上的误差线代表标准差。*或 **表示与所对应周期的对照相比P<0.05或P<0.01。
分析结果：
图1显示，当浓度为32μM和64μM的低极性稀有人参皂苷衍生物 Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)在SK-HEP-1细胞中作用48小时 后的细胞周期分布与无Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)加入的 对照组比较时，处于细胞周期G1期的细胞数量百分比,较对照明显增 加，且差异呈现统计显著(浓度为32μM时，P<0.05；浓度为64μ M时，P<0.01)；处于细胞周期G2/M期的细胞数量百分比,较对照明 显降低，且差异呈现统计显著(浓度为32μM时，P<0.05；浓度为6 4μM时，P<0.01)。处于细胞周期S期的细胞数量百分比,只在Δ(2 0-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)浓度为64μM时，较对照有统计性显 著的降低(P<0.01)。当Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)浓度 为16μM时，处于细胞周期G1,S，G2/M期的细胞数量百分比,较对照无 统计性显著差别。
实验结论：
低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1: 3)可在SK-HEP-1细胞中可产生与用药浓度成正比的G1期细胞数比例 的增加，以及S期和G2/M期的细胞数比例的减少。通常，细胞在G1期 会进行细胞生长，做分裂决定，并为下一步的DNA复制做准备。经G1 /S期检测点(DNA损伤检查)检测后细胞将进入S期(合成期)，进行 DNA和中心粒复制，染色质组装。之后，细胞经S/G2检查点(DNA复制 检查)检测后进入G2期，合成有丝分裂所需蛋白质，为下一步的分裂 做准备。最后，细胞经G2/M检查点(纺锤体组装和染色体分配检查)检测后进入M期(分裂期)。因为低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-2 1)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)可在SK-HEP-1细胞中上调G1期细胞数比 例，并下调S期和G2/M期的细胞数比例，这表示它可有效阻滞细胞于G 1期，从而阻滞细胞从G1到S期的过渡，最终阻滞细胞的周期循环分裂 进程。G1期阻滞可能是肿瘤细胞DNA受损后的自身应急表现，当阻滞 仍无法修复其损伤时，肿瘤细胞将进入自体凋亡。
实施例4：Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)调节肿瘤细胞相关周 期调控蛋白表达量实验
实验样品：
实施例1制备得到的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/ Δ(20-22)PPD(1:3)；
实验步骤：
以肝腺癌细胞SK-HEP-1作为实验用细胞系，接种1.5x106的细 胞于10cm培养皿内，放置在细胞培养箱中培养贴壁过夜；然后，对 培养皿中的SK-HEP-1细胞加入每皿终浓度为16μM,32μM,48μM (即Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)作用于SK-HEP-1细胞72h后抑制该细胞增殖的IC50值的1倍，2倍及3倍浓度)的测试药物Δ(20 -21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)。每个浓度设三个复皿，培养皿中DMS O每皿最终含量为0.5％，另设置三皿只含0.5％的DMSO的细胞为空白对 照。经测试化合物/空白对照作用12小时后，将每皿中的细胞由RIPA 和PI裂解，用BCA法进行蛋白定量和制备样品。最后，用西点法检测C yclin D1和CDK4蛋白在药物作用下在A549细胞的表达水平。结果如图 2所示。
如图2：Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)调节SK-HEP-1细胞 中Cyclin D1和CDK4蛋白表达水平检测结果。数据用三次实验重复的 平均值±标准差的形式展示。柱状图表示A549细胞在对照溶液(只含 0.5％的DMSO溶液)和终浓度为16μM,32μM,48μM(即Δ(20-21)PP D/Δ(20-22)PPD(1:3)作用于SK-HEP-1细胞72h后抑制该细胞增殖的 IC50值的1倍，2倍及3倍浓度)的Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1: 3)溶液中作用12小时后细胞中CyclinD1和CDK4蛋白表达水平。柱状 图上的误差线代表标准差。**表示与所对应蛋白表达水平的对照相比 P<0.01。
分析结果：
图2显示，当浓度为32μM和48μM的低极性稀有人参皂苷混合 物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)在SK-HEP-1细胞中作用12小 时后，Cyclin D1蛋白表达水平与无药物加入的对照组比较有明显降 低,且差异呈现统计显著(P<0.01)；而当Δ(20-21)PPD/Δ(20-22) PPD(1:3)浓度为16μM时，细胞中Cyclin D1蛋白表达水平较对照无 统计性显著差别。当浓度为16μM，32μM和48μM的低极性稀有人 参皂苷Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)在SK-HEP-1细胞中作用 12小时后，细胞中CDK4蛋白表达水平与无药物加入的对照组比较均不 同程度的呈现统计显著的明显降低(P<0.01)。
实验结论：
低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3) 在SK-HEP-1细胞中可不同程度的产生与用药浓度成正比的Cyclin D1 和CDK4蛋白表达水平的减少。CyclinD1是调控细胞周期G1期的关键 蛋白，已被公认为是一种原癌基因。Cyclin D1的过度表达与肿瘤和 癌症的发生有一定的联系，对细胞周期调控起着十分重要的作用。C yclin D1可以通过与CDK4分子结合并将其活化的方式共同驱使细胞 周期从一个时期进入下一个时期。因此，CDK4分子就像是控制细胞周 期的“引擎”，而cyclin D1则像是控制“引擎”的油门。研究发现这 两种蛋白的过度表达可促进肿瘤细胞的分裂和发展，而降低它们的表 达可有效抑制肿瘤细胞的生长。
实施例5：Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)促进肿瘤细胞凋亡实 验
实验样品：实施例1制备得到的Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1: 3)；
实验步骤：
以纤维肉瘤细胞HT1080和非小细胞肺癌细胞A549作为实验用细 胞系，在24孔板内每孔接种1mlHT1080细胞或者A549细胞，放置在细 胞培养箱中培养贴壁过夜；然后，更换细胞培养液，并对24孔板内的 HT1080细胞加入板孔终浓度为12μM,15μM,20μM(即Δ(20-21)PPD/ Δ(20-22)PPD(1:3)作用于HT1080细胞72h后抑制该细胞增殖的IC25, IC50和IC75浓度)的测试药物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)； 同时对24孔板内的A549细胞，加入板孔终浓度为17μM,26μM,40μM (即Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)作用于A549细胞72h后抑制 该细胞增殖的IC25,IC50和IC75浓度)的测试药物Δ(20-21)PPD/ Δ(20-22)PPD(1:3)；测试药物溶解于DMSO溶液中，每个浓度设两个 复孔，24孔板中DMSO每孔最终含量为0.2％。只含0.2％DMSO溶液的为 对照孔。经测试药物/对照溶液作用48小时后，每孔内的培养液(含 漂浮于培养液上的细胞)被提取，贴壁细胞用0.05％的胰蛋白酶分离 后，加入此提取的培养液重悬细胞并收集于离心管，2000rpm转速离 心5分钟。之后移除上清液，用PBS缓冲液重悬洗涤二次，最后根据膜 联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)和碘化丙啶(PI)染色试剂盒 (Invitrogen-V13242)说明书对细胞样品进行处理。未经药物处理 的细胞样品也被双重染色并用做对照。细胞样品处理后立即用FACS 流式细胞仪(BD FACS CantoII)进行双通道检测(FL1:530nm和 FL3:>575nm)，每个样品至少检测10000个细胞。结果如图3、图4所示。
使用SPSS Statistics软件(提供者：IBM corporation,软件 版本:XL fit 21)提供统计学分析。用独立样本检验(independent-sample T-test)来检测各细胞凋亡期中，不同浓度的药 物组与对照组之间的细胞凋亡百分比平均差异是否呈现统计显著(P <0.05或P<0.01)。
如图3：Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)促进HT1080细胞 凋亡实验检测结果。数据用两次实验重复的平均值±标准差的形式展 示。柱状图表示HT1080细胞在对照溶液(只含0.2％的DMSO溶液) 和终浓度为12μM,15μM,20μM(即Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)作用于HT1080细胞72h后抑制该细胞增殖的IC25,IC50和 IC75浓度)的Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)溶液中作用48小 时后处于各凋亡期阶段的细胞百分比。柱状图上的误差线代表标准 差。*或**表示与所对应凋亡期阶段的对照相比P<0.05或P<0.01。
如图4：Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)促进A549细胞凋 亡实验检测结果。数据用两次实验重复的平均值±标准差的形式展 示。柱状图表示A549细胞在对照溶液(只含0.2％的DMSO溶液)和 终浓度为17μM,26μM,40μM(即Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3) 作用于A549细胞72h后抑制该细胞增殖的IC25,IC50和IC75浓度) 的Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)溶液中作用48小时后处于各 凋亡期阶段的细胞百分比。柱状图上的误差线代表标准差。*或**表 示与所对应凋亡期阶段的对照相比P<0.05或P<0.01。
分析结果：
(1)图3显示，当三种浓度的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(2 0-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)在HT1080细胞中作用48小时后处于 各凋亡期阶段的细胞与无Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)加入的 对照组比较时，处于早期凋亡的细胞数量百分比,较对照明显增加， 且差异呈现统计显著(当Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)浓度为 12μM和15μM时，P<0.05；当Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3) 浓度为20μM时，P<0.01)；处于总凋亡期的细胞数量百分比,较对 照也明显增加，且差异呈现统计显著(P<0.01)。处于晚期凋亡的 细胞数量百分比，较对照无统计性显著差别。
(2)图4显示，当浓度为26μM和40μM的低极性稀有人参皂苷混合物 Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)在A549细胞中作用48小时后处 于各凋亡期阶段的细胞与无Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)加入 的对照组比较时，处于晚期凋亡和总凋亡期的细胞数量百分比,较对 照明显增加，且差异呈现统计显著(当Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD (1:3)浓度为26μM时，P<0.05；当Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD (1:3)浓度为40μM时，P<0.01)；处于早期凋亡的细胞数量百分 比,只在Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)浓度为40μM时，较对照有统计性显著的降低(P<0.01)。
实验结论：
低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3) 在纤维肉瘤细胞HT1080和非小细胞肺癌细胞A549中均可不同程度的 产生与用药浓度成正比的各凋亡期阶段细胞数量百分比的增加。这表 示Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)在两种肿瘤细胞中均可不同程 度的促进其自体凋亡。
另外，将实施例1中第四种比例的低极性稀有人参皂苷Δ(20-21)P PD/Δ(20-22)PPD混合物(1:2)进行上述体外抑制多类肿瘤细胞增殖实 验，发现其对所有18种所测细胞系中的抑制细胞增殖活性和有效性均 不同程度的高于非同类对照药物紫杉醇以及同类对照药物低极性稀 有人参皂苷单体Rg3和该低极性稀有人参皂苷混合物的单体Δ(20-21)PPD、Δ(20-22)PPD，其活性和有效性高于单体Δ(20-21)PPD、Δ(2 0-22)PPD为7:1和1:5的混合比例，稍逊于两种单体为1:3的混合比例。
实施例6：Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)增强胱天蛋白酶3(c aspase-3)活性实验
实验样品：实施例1制备得到的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(2 0-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)；
实验步骤：
以纤维肉瘤细胞HT1080和非小细胞肺癌细胞A549作为实验用细 胞系，在96孔板内每孔分别接种5000个HT1080细胞或者4000个A549 细胞，放置在细胞培养箱中培养贴壁过夜；然后，对96孔板内的HT1080 细胞，用Tecan D300e digital dispenser加入板孔终浓度为15μM,20 μM,50μM(即Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)作用于HT1080细 胞72h后抑制该细胞增殖的IC50,IC75和IC100浓度)的测试药物Δ (20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)；同时对96孔板内的A549细胞，加 入板孔终浓度为26μM,40μM,100μM(即Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)作用于A549细胞72h后抑制该细胞增殖的IC50, IC75和IC100浓度)的测试药物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)； 测试药物溶解于DMSO溶液中，每个浓度设两个复孔，96孔板中DMSO 每孔最终含量为0.2％。只含0.2％DMSO溶液的为空白对照孔。之后，摇匀Caspase-3/7缓冲液并冻干Caspase-3/7酶作用物至 室温，然后混合二者使酶作用物彻底溶解形成胱天蛋白酶检测试剂， 于4℃培养箱保存。经测试药物/对照溶液作用6小时、12小时和24小 时后，从培养箱中提取细胞测定板使其与室温平衡。然后添加100μl 胱天蛋白酶检测试剂到细胞测定板的各孔中，盖上密封板并摇动30 秒。最后，室温下培养30分钟后，用Envision检测相对光读数(RLU) 来测量待测样品中胱天蛋白酶3的活性。结果如图5、图6所示。
使用SPSS Statistics软件(提供者：IBM corporation,软件版本: XL fit 21)提供统计学分析。用独立样本检验(independent-sample T-test)来检测各时间点作用下，不同浓度的药物组与对照组之间的 平均相对光度数差异是否呈现统计显著(P<0.05或P<0.01)。并 用双向方差分析(Two-way ANOVA)检测测试时间点和药物浓度以及 它们的相互作用对每组平均相对光度数是否存在统计显著的影响(P <0.05或P<0.01)。
如图5：Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)对HT1080细胞中 胱天蛋白酶3活性的影响检测结果。数据用两次实验重复的平均值± 标准差的形式展示。柱状图表示HT1080细胞在对照溶液(只含0.2％ 的DMSO溶液)和终浓度为15μM,20μM,50μM(即Δ(20-21)PPD/ Δ(20-22)PPD(1:3)作用于HT1080细胞72h后抑制该细胞增殖的 IC50,IC75和IC100浓度)的Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3) 溶液中作用6小时，12小时，24小时后，细胞中胱天蛋白酶3活性 的相对光读数。柱状图上的误差线代表标准差。*或**表示与所对应 时间点的对照相比P<0.05或P<0.01。
如图6：Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)对A549细胞中胱 天蛋白酶3活性的影响检测结果。数据用两次实验重复的平均值±标 准差的形式展示。柱状图表示A549细胞在对照溶液(只含0.2％的DMSO 溶液)和终浓度为26μM,40μM,100μM(即Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)作用于A549细胞72h后抑制该细胞增殖的IC50, IC75和IC100浓度)的Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)溶液中 作用6小时，12小时，24小时后，细胞中胱天蛋白酶3活性的相对 光读数。柱状图上的误差线代表标准差。*或**表示与所对应时间点 的对照相比P<0.05或P<0.01。
分析结果：
(1)图5显示，当三种浓度的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(2 0-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)对HT1080细胞中胱天蛋白酶3的活性 的与无Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)加入的对照组比较时，用 药6小时后的胱天蛋白酶3活性较对照明显增加，且差异呈现统计显著 (当Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)浓度为20μM和50μM时，P <0.05)；用药12小时后的胱天蛋白酶3活性较对照也明显增加，且差 异呈现统计显著(当Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)浓度为15 μM和50μM时，P<0.01；当Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)浓度为20μM时，P<0.05)。用药24小时后的胱天蛋白酶3活性较对照 同样具有统计性显著提高(P<0.01)。双向方差分析结果(没有在 图上展示)显示测试时间点和药物浓度以及它们之间的相互作用均对 HT1080细胞中胱天蛋白酶3的活性有明显影响(P<0.01)。
(2)图6显示，当三种浓度的低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21) PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)对A549细胞中胱天蛋白酶3的活性的与无Δ (20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)加入的对照组比较时，用药6小时 后的胱天蛋白酶3活性较对照明显增加，且差异呈现统计显著(当Δ(2 0-22)PPD浓度为26μM和100μM时，P<0.01；当Δ(20-22)PPD浓度 为40μM时，P<0.05)；用药12小时后的胱天蛋白酶3活性较对照也 明显增加，且差异呈现统计显著(当Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1: 3)浓度为26μM和40μM时，P<0.01；当Δ(20-21)PPD/Δ(20-22) PPD(1:3)浓度为100μM时，P<0.05)。用药24小时后的胱天蛋白 酶3活性较对照同样具有统计性显著提高(P<0.01)。双向方差分析 结果(没有在图上展示)显示测试时间点和药物浓度以及它们之间的 相互作用均对A549细胞中胱天蛋白酶3的活性有明显影响(P<0.01)。
实验结论：
低极性稀有人参皂苷混合物Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3) 在纤维肉瘤细胞HT1080和非小细胞肺癌细胞A549中均可不同程度的 产生与测试时间点以及用药浓度成正比的胱天蛋白酶3活性的增加。 这表示Δ(20-21)PPD/Δ(20-22)PPD(1:3)在两种肿瘤细胞中导致其 自体凋亡的机制与胱天蛋白酶3的活化有关。胱天蛋白酶3被称为凋亡 蛋白酶，其在蛋白酶级联切割过程中处于核心位置。不同的蛋白酶分 别切割胱天蛋白酶3酶原,从而激活胱天蛋白酶3，活化的胱天蛋白酶3 又进一步切割不同的底物,导致蛋白酶级联切割放大,最终使细胞走 向凋亡。
Claims (10)
1.一种低极性稀有人参皂苷混合物，其特征在于，其由低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-21)PPD及低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-22)PPD混合而成。
2.如权利要求1所述的低极性稀有人参皂苷混合物，其特征在于，所述低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-21)PPD具有如下结构式：
所述低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-22)PPD具有如下结构式：
3.根据权利要求2所述的低极性稀有人参皂苷混合物，其特征在于，所述低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-21)PPD与低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-22)PPD的重量比为1:5～7:1。
4.根据权利要求2所述的低极性稀有人参皂苷混合物，其特征在于，所述低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-21)PPD与低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-22)PPD的重量比为1:2～1:5。
5.根据权利要求2所述的低极性稀有人参皂苷混合物，其特征在于，所述低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-21)PPD与低极性稀有人参皂苷单体Δ(20-22)PPD的重量比为1:3。
6.权利要求1～5中任一项所述的低极性稀有人参皂苷混合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
7.根据权利要求6的用途，其特征在于，其中所述的肿瘤和/或癌症选自：
恶性肿瘤，包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、头和颈癌、食管癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和/或皮肤癌；
淋巴系统的造血肿瘤，包括但不限于白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴癌、T-细胞淋巴癌、霍奇金淋巴癌、非-霍奇金淋巴癌、毛细胞淋巴癌、外套细胞淋巴瘤、骨髓瘤和/或Burkett氏淋巴癌；
骨髓系统的造血肿瘤，包括但不限于急性和慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和/或前髓细胞性白血病；
间质成因的肿瘤，包括但不限于纤维肉瘤和/或横纹肌肉瘤；
中枢和周围神经系统的肿瘤，包括但不限于星形细胞瘤、成纤维神经瘤、神经胶质瘤和/或神经鞘瘤；以及
黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、外生性色素颈瘤、甲状腺滤囊癌和/或卡波氏肉瘤。
8.权利要求1～5中任一项所述的低极性稀有人参皂苷混合物在制备用于免疫调节、改善微循环和/或提高生命质量的保健品中的用途。
9.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1-5中任一项所述低极性稀有人参皂苷混合物。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物为药物制剂，其包含治疗和/或预防有效量的权利要求1～5中任一项所述的低极性稀有人参皂苷混合物以及任选的药学可接受的稀释剂、载体、赋形剂、辅料或媒介物。
所述药物制剂的剂型为口服剂型、注射剂型或局部用药剂型中的任何一种。
所述口服剂型为片剂、粉剂、悬浊液、乳浊液、胶囊、颗粒剂、糖衣片、药丸、液体、醑剂、糖浆或柠檬水剂；
所述注射剂型包括水剂、悬浊液或溶液；
所述局部用药剂型包括软膏、固体、悬浊液、水剂、醑剂、粉剂、糊剂、栓剂、气溶胶、泥敷剂、涂抹剂、洗剂、灌肠剂或乳剂。
或者，
所述组合物为保健品，其包含如权利要求1-5中任一项所述低极性稀有人参皂苷混合物以及保健品中可接受的载体。
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