CN1508148A - 新型抗肿瘤人参皂苷苷元衍生物的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种从低极性人参皂苷及其真苷元制备人参皂苷苷元衍生物Δ²⁰⁽²¹⁾－PPD、Δ²⁰⁽²²⁾－PPD、Δ²⁰⁽²¹⁾－PPT和Δ²⁰⁽²²⁾－PPT的方法，包括除去糖基、选择性脱水和产物分离纯化步骤。本发明所提供的方法由催化热解、选择性脱水、酸解、碱解和分离纯化等基本操作单元，根据目的产物、起始原料的不同组合单元操作，形成不同的工艺路线。本发明避免了现存方法难制备或无法制备的缺陷，提供了简单、可靠、方便、原料转化率高、苷元回收率大、质量可控的方法，在医药、化妆和食品等领域中应用价值和开发潜力极大。

Description

新型抗肿瘤人参皂苷苷元衍生物的制备方法

技术领域：

本发明涉及由多种人参皂苷制备人参皂苷苷元衍生物3β，12β-二羟-20(22)，24(25)-二烯-达玛烷[dammar-3β，12β-dihydroxyl-20(22)，24(25)-diene，简称

和3β，12β-二羟-20(21)，24(25)-二烯-达玛烷[dammar-3β，12β-dihydroxyl-20(21)，24(25)-diene，简称

6α，12β-三羟-20(22)，24(25)-二烯-达玛烷[dammar-3β，6α，12β-trihydroxyl-20(22)，24(25)-diene，简称

和3β，6α，12β-三羟-20(21)，24(25)-二烯-达玛烷[dammar-3β，6α，12β-trihydroxyl-20(21)，24(25)-diene，简称

的方法，特别是涉及以3位、6位或20位羟基游离的低极性人参皂苷及其苷元为原料或中间产物的制备方法。

背景技术：

对于晚期弥散性和转移性恶性肿瘤，药物治疗是必备疗法。过去的几十年里，细胞毒药物疗法即化疗有明显的发展和进步，成为肿瘤药物治疗的中坚。但目前临床中的化疗药物有以下缺陷：1、内因性耐药；2、获得性耐药，具体表现为对结构和作用机制完全不同的药物产生耐药，称多药耐药(multidrugresistance，简称MDR)。目前，临床上可使用的耐药逆转剂有维拉帕米(Verapamil)和环胞菌素A(Cyclosporin A)，相关的研究表明，它们确有逆转MDR和增加化疗药物敏感性的作用，但令人遗憾的是由于严重的毒副作用，这些药物的临床使用受到严重限制。因此，发现和开发低毒或无毒的抗肿瘤药物或其增敏剂迫在眉睫。

天然人参皂甙较难吸收，但由天然皂甙转化而来的低极性皂甙、甙元或两者的衍生物是天然人参皂甙发挥其药效的原形。近来，低极性皂甙及其衍生物的抗肿瘤研究非常活跃，已发现它们在具有多种抗肿瘤作用的同时，基本无毒副作用。其中，人参皂苷苷元衍生物

和

具有显著逆转肿瘤MDR，其作用机制有别于目前研究中的抗MDR药物。

长谷川秀夫(日本公开特许8-291194)报道的制备方法为：酸水解天然或3位羟基游离的人参皂苷，水解产物经常规和色谱分离后仅获得

和

单品。应用该法时，

和

仅是微量副产物，产物收率极低、分离纯化难度极高，不适应工业生产。

本发明人发现了一种新化合物

和

结构式分别如下：

            结构式I

            结构式II

它们同样具有诱导肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长、逆转肿瘤多药耐药性、抑制肿瘤新生血管生成、抑制肿瘤的浸润和转移、增强机体免疫力和降低化疗药物毒副作用等抗肿瘤活性。

发明的技术内容：

本发明的目的是提供一种制备

和

的方法，该方法简单、可靠、方便，并可大批量生产。

本发明所提供的方法中，原料可以是下列任何一种皂苷单体，或多种单体皂苷的混合物：

天然人参皂苷：Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc、Rd、Rg₁、Re和Rf等；

3位羟基游离的二醇型人参皂苷：3位羟基游离的低极性人参皂苷，如20-O-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，简称C-K]、20-O-α-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-α-L-arabinopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl20(S)-protopanaxadiol，简称C-Y]和20-O-α-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-α-L-arabinofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl20(S)-protopanaxadiol，简称Mc]、20-O-β-D-木糖-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，简称Mx]；

6位羟基游离的三醇型人参皂苷：20-O-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol，简称F₁]；

20位羟基游离的人参皂苷：人参皂苷20-(R,S)-Rg₃、20-(R，S)-Rh₂、20-(R,S)-Rg₂和20-(R,S)-Rh₁；

20位为烯键的人参皂苷：人参皂苷Rk₁、Rk₂、Rs₅；Rg₅、Rh₃、Rs₄；Rg₆、Rk₃、Rs₇；F₄、Rb₄、Rs₆。

本发明所提供的方法中，制备目标产物涉及原料的除去糖基、选择性脱水和产物分离纯化等步骤。除去糖基的方法有催化热解、酸解和碱解。

本发明所提供的方法中，催化热解按中国专利《一种新型制备低极性人参皂苷及其苷元的方法》(申请中)进行。催化热解的转化率＞95％，主要用于除去20位O糖基。可以为20位烯键或非烯键的产物，其比例大致均衡如二醇型皂苷的主要产物为20-(R)-Rg₃、20-(S)-Rg₃、Rk₁和Rg₅且基本上各占1/4。

本发明所提供的方法中，酸解所用的酸为无机酸或有机酸(如硫酸、盐酸、磷酸、三氟乙酸等)；酸解在有机溶剂(如甲醇、乙醇、二氧六环、二甲亚砜等)水溶液中进行，酸浓度为3％～10％，原料量为有机溶剂水溶液的1％～10％；酸解温度为40～90℃；酸解在无氧、具有搅拌装置的密闭容器中进行。酸解有两种使用方法：(1)低温低浓度酸解(20～40℃，15～20小时)，用于除去20位O糖基。水解二醇型天然人参皂苷时，四个主要产物为20-(R，S)-Rg₃、Rk₁和Rg₅，但是，产物苷元总收率低于催化热解(约为60％)。该法条件温和，不能除去3位O或6位O糖基。(2)高温低浓度酸解(60～80℃，6～8小时)，用于除去

人参皂苷上的3位O或6位O糖基。因在该法条件下，侧链环化生成人参二醇或人参三醇，该法不能用于除去3位羟基和6位羟基游离的人参皂苷上的20位O糖基。

本发明所提供的方法中，碱解所用的碱为碱金属(如金属钠、金属钾)、碱金属醇化物(如乙醇钠、特丁醇钾)或碱金属氢氧化物(如氢氧化钠、氢氧化钾)；碱解在低碳醇(如乙醇、正丁醇、特丁醇等)中进行，碱浓度为5％～50％，原料量为低碳醇的1％～10％；碱解压力为0.1～3KPa，碱解温度为100～300℃；碱解在无氧、具有搅拌装置的密闭容器中进行。20位O糖苷键对碱解的反应活性高于3位O和6位O糖苷键，碱解过程中保持20位的构型不变。碱解主要用于除去3位羟基和6位羟基游离的人参皂苷上的20位O糖基，用于除去3位O和6位O糖苷键时，反应条件剧烈，原料转化率低(＜30％)，皂苷破坏严重。

本发明所提供的方法中，选择性脱水指仅脱去20位羟基而不影响3位、6位和12位羟基的脱水反应；反应物可用温和脱水剂直接脱水(如人参皂苷Rg₃在二甲亚砜中180℃脱水，或在二氯甲烷中用三乙胺+4-二甲胺吡啶+甲硫酰氯)，也可保护3位、6位和12位羟基后用更为强烈的脱水剂脱水(如人参皂苷Rg₃乙酰化后，在吡啶用三氯氧磷或亚硫酰氯脱水，脱水后再除去保护基)。

本发明所提供的方法，包括催化热解、选择性脱水、酸解、碱解和分离纯化等基本单元操作，通过组合单元操作的多少和顺序组成不同的工艺路线；根据目的产物的需要，相同原料或不同原料均可使用不同种工艺路线；起始原料和工艺路线的选择取决于原料分离制备与产物分离纯化的相对难易，以及工艺路线的简便性。

本发明所提供的方法中，天然人参皂苷可有两条途径进入流程：酶解为3位羟基或6位羟基游离的皂苷；催化热解或酸解为20位羟基游离的皂苷、 和

低极性人参皂苷。

本发明所提供的方法中，3位羟基游离的二醇型皂苷经催化热解或低温酸解的产物为混合物I[20-(R)-PPD、20-(S)-PPD、

和

混合物I经选择性脱水后生成混合物 和

混合物II经色谱和常规分离后获

和

纯品；6位羟基游离的三醇型皂苷经同方法处理获

和

纯品。

本发明所提供的方法中，3位羟基游离的二醇型人参皂苷经碱解的产物为原料皂苷苷元20-(S)-PPD，20-(R)-PPD经选择性脱水后生成

和

的混合物，经色谱和常规分离后获

和 纯品；6位羟基游离的三醇型皂苷经同样方法处理获 和

纯品。

本发明所提供的方法中，20位羟基游离的人参皂苷转化为

和

或

和 有两种选择：(1)先脱水后除去糖基；(2先除去糖基后脱水。除去糖基有酸解法和碱解法，选择先除去糖基后脱水的路线时不宜用酸解法，以避免侧链环化；选择先脱水后除去糖基路线时，宜用酸解法，因酸解条件温和，反应速度快，以避免碱解苛刻的反应条件和低转化率。脱水产物为

和

苷元，或 和

苷元的混合物。脱水除去糖基后，

和 苷元混合物经色谱和常规分离后获

和

纯品。

本发明所提供的方法中，20位为烯键的人参皂苷经酸水解或碱水解后的产物为 和 或

和

混合物，经色谱和常规分离后获

和

纯品。

本发明所提供的方法，同样适用于自除人参皂苷以外的其它三萜皂苷或苷元[如三七皂苷(Notoginsenosides)、绞股蓝皂苷(Gypenosides)、越南人参皂苷(Vietnamese ginsenosides)、桦叶烯四醇(Betulafolientetraol)、桦叶烯四醇A(Betulafolientetraol A)、桦叶烯五醇(Betulafolienpentaol)、达玛烯二醇(Dammarenediol)、达玛-24-烯-3β，20-二醇-3-乙酸酯(Dammar-24-ene-3β，20-diol-3-acetate)、羟基达玛烯酮(Hydroxyldammarenone)、奥寇梯木酮(Octillone)、龙脑香环氧二醇(Kapurol)、龙脑香环氧醇酮(Kapurone)、龙脑香二醇酮(Dryobalanone)、龙脑香醇酮酸(Dryobalanonoloic acid)等]制备相应的 或和

三萜苷元。

本发明克服了低浓度酸解人参皂苷侧链易环化，浓盐酸和碱水解制备真苷元制备条件剧烈、苛刻，苷元收率低等缺陷，完成了 和

大量制备的难题，提供了一种简单、可靠、方便的方法。使用本发明所提供的方法，原料转化率高(原料苷元转化率≥96％)、苷元回收率高于现有方法(单品≥40％，总收率≥80％)、质量可控，开发和应用价值极大。

具体实施方式：

实施例1：酶解与催化热解或酸解或碱解制备

二醇型三七叶苷(100g)与蜗牛酶(8.4g)溶于磷酸-柠檬酸缓冲液3.2L(pH4.5，离子强度为0.001mol/L，含10％的乙醇)中，于40℃水浴中水解1天；离心反应液，收集沉淀，用水将沉淀物制成悬浊液，乙酸乙酯萃取(10mL×5)，合并乙酸乙酯相，减压除乙酸乙酯后，获残余物(46g，经HPLC检测，为C-K和Mx的混合物)，并按下列操作。

a)、残余物(46g)经催化热解后，热解产物溶于300mL二甲亚砜中180℃脱水9小时，将脱水反应物用水稀释，收集沉淀；沉淀经硅胶层析(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯＝8/1)分离纯化获得 和

b)、残余物(46g)溶于2mol·L^-1HCl的60％乙醇中(500mL)，40℃搅拌反应15小时；收集沉淀，沉淀经0.5％NaHCO₃和水洗至中性；沉淀经干燥后溶于二氯甲烷中(300mL)，搅拌下加入三乙胺(35mL)和4-二甲胺吡啶(400mg)，将反应液冷却到0℃，滴加甲硫酰氯(96mL)；室温搅拌1小时后，加入碎冰再搅拌1小时；二氯甲烷萃取反应液(300mL×10)，二氯甲烷相经水洗和无水硫酸钠干燥，减压除二氯甲烷后，残余物经硅胶层析(洗脱剂为正己烷/乙酸乙酯＝4/1)分离纯化获

和

c)、残余物(46g)溶于2mol·L^-1HCl的90％乙醇中(500mL)，40℃搅拌处理15小时；NaOH中和反应液，减压除乙醇，收集沉淀，沉淀经水洗后经硅胶层析(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯＝8/1)分离纯化获

和

d)、残余物(46g)溶于正丁醇(100mL)中获A液。5g金属钠溶于正丁醇(200mL)中冷却后，获B液。将A液和B两液混合于高压釜中，120℃搅拌反应1小时。中止反应后经水洗反应液至中性，减压除正丁醇；获残余物。残余物按b)例的方法脱水后经硅胶层析(洗脱剂为正己烷/乙酸乙酯＝4/1)分离纯化获得

和

实施例2：

二醇型人参皂苷(100g)，催化热解吸附树脂纯化后获白色固体(48g)，经HPLC检测，残余物主要为20-(R)-Rg₃、20-(S)-Rg₃、Rg₅和Rk₁。

a)、上述白色固体(48g)中加入乙酸酐(100mL)、吡啶(500mL)，室温下反应22小时后加入三氯氧磷脱水；反应液倒入冰水稀释后，用乙醚萃取；乙醚相经反复水洗后浓缩至干；残余物溶于含7％H₂SO₄的60％乙醇中(300mL)，70℃搅拌反应6小时；反应物用水稀释，收集沉淀；沉淀经0.5％NaHCO₃和水洗至中性后硅胶层析(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯＝8/1)分离纯化获

和

b)、上述白色固体(48g)溶于2mol·L^-1HCl的90％乙醇中(500mL)，40℃搅拌反应72小时；NaOH中和反应液，减压除乙醇，收集沉淀，沉淀水洗至中性后经硅胶层析(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯＝8/1)分离纯化，获

和

c)、上述白色固体(48g)溶于含7％H₂SO₄的80％乙醇中(300mL)，70℃搅拌处理6小时；反应物用水稀释，收集沉淀；沉淀经0.5％NaHCO₃和水洗至中性后经硅胶层析(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯＝8/1)分离纯化，获 和

实施例3

三醇型人参皂苷(100g)

按实施例1a)方法处理获 和

按实施例1b)方法处理获 和

按实施例1c)方法处理获

和

按实施例1d)方法处理获 和

实施例4

三醇型人参皂苷(100g)

按实施例2a)方法处理获

和

按实施例2b)方法处理获

和

按实施例2c)方法处理获

和

Claims (12)

1、一种从低极性人参皂苷及其真苷元制备人参皂苷苷元衍生物3β，12β-二羟-20(21)，24(25)-二烯-达玛烷[dammar-3β，12β-dihydroxyl-20(21)，24(25)-diene，简称

]、3β，12β-二羟-20(22)，24(25)-二烯-达玛烷[dammar-3β，12β-dihydroxyl-20(22)，24(25)-diene，简称

]、3β，6α，12β-三羟-20(21)，24(25)-二烯-达玛烷[dammar-3β，6α，12β-trihydroxyl-20(21)，24(25)-diene，简称

]、3β，6α，12β-三羟-20(22)，24(25)-二烯-达玛烷[dammar-3β，6α，12β-trihydroxyl-20(22)，24(25)-diene，简称

]的方法，包括除去糖基、选择性脱水和产物分离纯化步骤。

2、按照权利要求1所述从低极性人参皂苷及其真苷元制备人参皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于所用的原料为下述低极性人参皂苷中的任何一种皂苷单体，或多种皂苷的混合物：

(1)3位羟基游离的二醇型人参皂苷

20-O-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，简称C-K]、

20-O-α-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-α-L-arabinopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol，简称C-Y]、

20-O-α-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-α-L-arabinofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol，简称Mc]、

20-O-β-D-木糖-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，简称Mx]；

(2)6位羟基游离的三醇型人参皂苷

20-O-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol，简称F₁]；

(3)20位羟基游离的二醇型人参皂苷

人参皂苷20-(R)-Rg₃、20-(S)-Rg₃、20-(R)-Rh₂和20-(S)-Rh₂；

(4)20位羟基游离的三醇型人参皂苷

人参皂苷20-(R)-Rg₂、20-(S)-Rg₂、20-(R)-Rh₁和20-(S)-Rh₁；

(5)20位烯键的二醇型人参皂苷

-二醇型人参皂苷Rk₁、Rk₂、Rs₅，

-二醇型人参皂苷Rg₅、Rh₃、Rs₄；

(6)20位烯键的三醇型人参皂苷

-三醇型人参皂苷Rg₆、Rk₃、Rs₇，

-三醇型人参皂苷F₄、Rh₄、Rs₆；

(7)二醇型人参皂苷苷元

原人参二醇(protopanaxadiol，PPD)；

(8)三醇型人参皂苷苷元

原人参三醇(protopanaxadiol，PPT)。

3、按照权利要求1所述从低极性人参皂苷及其真苷元制备人参皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于：选择性脱水指仅脱去20位羟基而不影响3位、6位和12的位羟基；反应物用温和脱水剂直接脱水，或者保护3位、6位和12位羟基后用更为强烈的脱水剂脱水。

4、按照权利要求1所述从低极性人参皂苷及其真苷元制备人参皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于：除去糖基的方法有催化热解、酸解或碱解。

5、按照权利要求4所述从低极性人参皂苷及其真苷元制备人参皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于催化热解指原料人参皂苷以酸为催化剂，经110～180℃高温蒸制0.5～10小时。

6、按照权利要求4所述从低极性人参皂苷及其真苷元制备人参皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于：酸解所用的酸为无机酸或有机酸；酸解在有机溶剂水溶液中进行，酸浓度为3％～10％，原料量为有机溶剂水溶液的1％～10％；酸解温度为40～90℃；酸解在无氧、具有搅拌装置的密闭容器中进行。

7、按照权利要求4所述从低极性人参皂苷及其真苷元制备人参皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于：碱解所用的碱为碱金属、碱金属醇化物或碱金属氢氧化物；碱解在低碳醇中进行，碱浓度为5％～50％，原料量为低碳醇的1％～10％；碱解压力为0.1～3KPa，碱解温度为100～300℃；碱解在无氧、具有搅拌装置的密闭容器中进行。

8、按照权利要求1所述从低极性人参皂苷及其真苷元制备人参皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于：3位羟基游离的二醇型皂苷经催化热解或低温酸解的生成产物混合物I[20-(R)-PPD、20-(S)-PPD、 和

混合物I经选择性脱水后生成混合物II[

和

]，混合物II经常规分离和色谱分离后获

和

纯品；6位羟基游离的三醇型皂苷经同样处理后获 和 纯品。

9、按照权利要求1所述从低极性人参皂苷及其真苷元制备人参皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于：3位羟基游离的二醇型人参皂苷经碱解的产物为原料皂苷苷元20-(S)-PPD，20-(S)-PPD经选择性脱水后生成混合物[ 和]，混合物经常规分离和色谱分离后获

和

纯品；6位羟基游离的三醇型皂苷经同样处理后获 和

纯品。

10、按照权利要求1所述从低极性人参皂苷及其真苷元制备人参皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于：20位羟基游离的人参皂苷经碱解的产物为原料皂苷苷元PPD或PPT，碱水解不影响苷元20位碳原子的构型；PPD或PPT经选择性脱水后生成混合物[

和

或

和

混合物经常规分离和色谱分离后获

和 纯品。

11、按照权利要求1所述从低极性人参皂苷及其真苷元制备人参皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于：20位羟基游离的人参皂苷，经保护3位、6位和12位羟基的乙酰化选择性脱水，经除去20位O糖基酸水解，和去保护基的碱水解后的产物混合物

和

或和 和 混合物经常规分离和色谱分离后获

和

纯品。

12、按照权利要求1所述从低极性人参皂苷及其真苷元制备人参皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于：20位烯键的人参皂苷经酸水解或碱水解后的产物为原料皂苷苷元

和 或和

和 混合物，混合物经常规分离和色谱分离后获

和 纯品。