CN1091448C - 20(S)－人参皂甙－Rh2的制备 - Google Patents

Abstract

本发明提供了以人参属植物的总皂甙或原人参二醇组皂甙为原料，转化、分离和提取20(S)-原人参皂甙-Rh₂的方法，本发明还提供了含有所说人参单体皂甙的药物组合物，及该组合物在预防和治疗恶性疾病中的应用。其中所说的制备方法包括将原人参二醇组分皂甙的水溶液与碱金属低醇化物或金属氢氧化物的醇溶液混合，或将原人参二醇组分皂甙的低级醇溶液与碱金属醇化物的低级醇溶液混合，于高温、高压下反应后再用低级醇萃取。

Description

20(S)-人参皂甙-Rh2的制备

本发明涉及以人参属植物的总皂甙或原人参二醇组皂甙为原料，转化、分离和提取20(S)-原人参皂甙-Rh₂的方法，本发明还涉及含有所说人参单体皂甙的药物组合物，及该组合物在预防和治疗恶性疾病中的应用。

人参(panax ginseng)、西洋参(panax quinguefol)和三七(panax notoginseng)等均属于五加科人参属植物，这些植物的几乎所有部分，如根、根茎、花、果实和茎叶都含有多种人参皂甙。近十多年来，人们发现这些植物的皂甙，特别是达玛烷型皂甙具有广泛的生物学活性，并已对其单体成分进行了深入的研究。

按照皂甙单体的极性不同，可将其分为两个不同的组分。一般说来，基于薄层层析分析，其中Rf值在相应Re(人参皂甙单体中的一种)以下的为极性较大的组分，定名为组分I；Rf值在Re处及其以上的组分为极性较小的组分，定名为组分II。总皂甙中不同组分的生理活性不尽相同，有的甚至作用相反。因此，将总皂甙分离成不同的组分，将有利于对不同组分的研究与合理开发和利用，而且便于进一步分离和纯化单体皂甙。

基于原料总皂甙的单体成分，人参属植物总皂甙的组分I主要是皂甙-Ro、-Rb、-Rb₂、-Rb₃、-Rc、-Rd中的几种或所有单体的混合物。组分II主要是人参皂甙-Re、-Rg₂、-Rg₃、-F₂、-Rf、-RF₁₁、-RT₅、-Rh₁、Rh₂中的几种或所有单体的混合物。如果以人参或西洋参总皂甙为原料制备上述组分I，也就是人参的所谓二醇组皂甙，可得到在人参皂甙的四环三萜醇配糖体上具有3β和12β两个羟基的组分，其中包括-Ra₁、-Ra₂、-Ra₃、-Rb₁、-Rb₂、-Rb₃、Rc和Rd等。如以同样原料制备上述组分II，则得到人参的所谓三醇组皂甙，也就是在所述配糖体上具有3β、6β和12β三个羟基的组分，其中包括体-Re、-Rf、-Rg₁、-Rg₂、和-Rh₁等。

然而，近年来对原人参二醇与原人参三醇的结构分析进一步证实，原来认为人参二醇和人参三醇是人参皂甙的原始配基是不正确的。实际上，未环化的结构才是人参皂甙的真正配基。未环化结构的人参皂甙配基，一类具有3β、6β和20(S)三个游离羟基；另一类具有3β、6α、12β和20(R & S)四个游离羟基。因此本应命名为人参三醇和人参四醇，但为了保留原来人参二醇与人参三醇的名称，且与之相区别，特在原名称前分别加上“原”字，即现在习惯上所称的“原人参二醇”(propopanacaxadiol)(PDS)和“原人参三醇”(protopanaxatriol)(PTS)，它们的结构分别如下所示：

人们习惯所说的人参皂甙-Rh₂为20(S)-原人参二醇-3β-D-吡喃葡萄糖甙：人参皂甙-Rh₁为20(S)-原人参三醇-6β-D-吡喃葡萄糖甙。因此，人参皂甙-Rh₂属于四环三萜达玛烯原人参二醇的具单糖链结构的配糖体；人参皂甙-Rh₁则属于原人参三醇的配糖体。其中人参皂甙-Rh₂基于C₂₀手性碳原子的构型不同，又分为20(S)-人参皂甙-Rh₂和20(R)-人参皂甙-Rh₂，两者互为差向异构体，除旋性外具有完全相同的理化性质。

北川勋等人(药志(日)1983，103：612)首先从红参的原人参二醇组皂甙中发现并以极低的收率(0.001％)分离了20(S)-人参皂甙-Rh₂。小田岛肃夫(药用人参85，共立出版株式会社，1985，88)经体外抑瘤试验证明，人参皂甙-Rh₂对培养的小鼠肺癌细胞、大鼠Morris肝癌细胞及小鼠B16黑色素瘤细胞具有明显的特异性抑瘤作用，并进一步证实-Rh₂可诱导肿瘤细胞的逆向转化，从而使增殖的癌细胞逆转为正常细胞。然而，在相同条件下，20(S)-人参皂甙-Rh₁则无此作用，-Rh₁和-Rh₂这种结构上的差异；特别是-β-D-葡萄糖基在四环结构上结合位点的不同，导致了它们的生物学活性的显著差异。小田岛肃夫的这一发现强有力地表明了分子构效关系的研究在开发生物药品中的重要性。因此，进一步改进人参皂甙-Rh₂的制备方法，大幅度提高所需产物的回收率，对于深入研究其药效学、毒理学，并最终将所说的人参皂甙-Rh₂开发成可广泛使用的低毒性抗肿瘤天然药物，将具有很大实用价值。

然而，由于天然人参植物材料中所含人参皂甙-Rh₂含量极低(0.0015-0.006％)，所以，直接从这些天然材料中提取人参皂甙-Rh₂显然没有实际应用意义。为此，近年来人们一直在努力探索利用具有达玛烷型结构的各种人参皂甙单体化学转化为人参皂甙-Rh₁或Rh₂的方法。

陈英杰等人(沈阳药学院学报，5(2)：149，1988)从100kg鲜人参中分离并纯化出约60mg人参皂甙-Rh₂，并用金属钠和氢氧化钠水解法由人参皂甙-Rg₂转化得到人参皂甙-Rh₁。宋长春等人(中国药学杂志，27(1)：6，1992)报导了利用西洋参茎叶总皂甙(10g)为起始材料，经用20％NaOH水解并用乙酸乙酯提取得到人参皂甙二醇组分，然后将此粗制品经低压硅胶层析分离并用MeOH-H₂O重结晶，制得给142mg20(S)-人参皂甙-Rh₂(回收率1.42％)。这些研究工作证明，可利用人参总皂甙或其原人参二醇组分，经在碱性条件下温和水解制得人参皂甙-Rh₂，特别是可从人参和西洋参茎叶皂甙制得人参皂甙-Rh₂。

韩国人参烟草研究所公开了一种从人参成分中制备20(R)-人参皂甙-Rh₂的方法，其特征在于首先用酸水解人参皂甙原人参二醇组分，再经乙酰化及水解处理得到20(R&S)-人参皂甙-Rg₃，然后用碱的正丁醇溶液进行碱水解得到20(R&S)-人参皂甙-Rh₂，最后经硅胶柱层析分离立体异构体得到20(R&S)-人参皂甙-Rh₂，和20(R&S)-人参皂甙-Rh₂，(见韩国专利申请公告94-8291)。另外，韩国专利申请公告94-4060和95-7250还分别公开了用酸水解原人参二醇组分(系列)单体皂甙制得Rg₃，然后经乙酰处理并以半制备性HPLC法分离得到20(R)-人参皂甙-Rh₂，的方法，和首先用强碱的醇溶液水解人参叶和/或根茎的干燥粉末，得到20(S)-Rg₂甙元，然后再在碳酸银等催化剂存在在下与葡萄糖缩合以制备20(S)-Rg₂的方法。

然而，上述这些方法主要缺陷在于产物的起始材料为原人参二醇组系列单体皂甙，从而增加了单体皂甙分离纯化步骤，导致溶剂(正丁醇、乙酰乙酯等)和吸附剂用量的增加和操作上的麻烦。另外，这些方法中，特别是原人参皂甙二醇组分转化为20(S)-人参皂甙-Rh₂的过程中，使用了包括20(R&S)-人参皂甙-Rg₃的制备、乙酰化、催化水解或缩合反应等繁复的反应步骤，从而导致成分增加，而且难以提高产率。因此，从工业化大规模生产角度看，仍需要进一步改善从人参属植物中提取原人参二醇皂甙组分，以及以所说的原人参二醇组分为起始材料，进一步经化学修饰以高产率转化得到20(S)-人参皂甙-Rh₂的方法。

钟国赣等人(中国药理学报12(3)：256-260，1991)观察并比较了原人参二醇与三醇组皂甙对培养的正常心肌细胞与自由基损伤的心肌细胞动作电位的影响，表明二醇和三醇两个组分的人参皂甙混合物均具有对抗心肌自由基损伤、保护心肌细胞膜完整性的功能，而且PDS的作用的明显大于PTS。这一结果与已报导的PDS可提高超氧化物歧化酶活性、减少缺血心肌超氧阴离子自由基的研究结果相符。

马文彬等人(白求恩医科大学学报17(6)：551-554，1993)利用S₁₈₀肉瘤小鼠为模型所作的试验表明，带瘤小鼠腹腔注射20(S)-人参皂甙-Rh₁和-Rh₂(50mg/kg/天)7天后，人参皂甙-Rh₂可使瘤细胞的生长停止在S期，具有使瘤细胞增殖停滞并阻断S期细胞向G₂其转化；而且发现-Rh₂的这种抑瘤作用显著大于-Rh₁。另外，陶丽华等人(人参研究4：39-46，1995)介绍了从原人参二醇组皂甙中分离并转化得到的20(R)-人参皂甙-Rh₂和高含人参皂甙Rg组分，与某些其他中草药提取物混合制成的抗肿瘤药物组合物，及其对小鼠黑色素B₁₆细胞、小鼠S-180A细胞及腹水癌细胞的分化诱导作用。再者，太田隆英等人(Tadahide Ota etal.，J.of Phmaceutical Science 80(12)：1141-1143，1991)的研究工作还表明，原人参二醇和人参皂甙-Rh₂均对黑色素瘤具有抑瘤活性，而且原人参二醇的作用比人参皂甙-Rh₂单体更强。

上述这些实验室研究成果，为进一步提高工业化生产原人参二醇组皂甙和20(S)-人参皂甙-Rh₂的产率，并将其开发成可在临床上使用的抗肿瘤及改善心肌和代谢功能的药物提供了必要的基础研究依据。

本发明的一个目的是提供一种以原人参二醇组皂甙为起始材料制备20(S)-人参皂甙-Rh₂的方法，该方法包括将原人参二醇组分皂甙的水溶液与碱金属低醇化物或金属氢氧化物的醇溶液混合，或将原人参二醇组分皂甙的低级醇溶液与碱金属醇化物的低级醇溶液混合，于高温、高压下反应后再用低级醇萃取。

根据本发明的这一目的，所说的制备方法进一步包括对低级醇萃取物进行硅胶层析和重结晶纯化的步骤。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的碱水解步骤在0.1-4MPa、100-300℃温度下进行的。其中所说的碱金属包括金属钠和钾。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的碱金属醇化物或碱金属氢氧化物的浓度为5％至50％(W/V)。

根据本发明这一目的的另一个优选实施方案，其中所说的碱水解反应是用高浓度碱金属醇化物或氢氧化物的醇溶液在高压釜中进行的。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的碱金属氢氧化物包括金属钠和钾的氢氧化物，并且其中所说的低级醇包括含有1-5个碳原子的一元醇。

本发明的另一个目的是提供一种按本发明所述方法制备的20(S)-人参皂甙-Rh₂。

本发明的再一个目的是提供一种抗肿瘤药物组合物，特征在于该组合物含有按本发明所述方法制备的20(S)-人参皂甙-Rh₂和一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂。

根据本发明这一目的的一个方面，本发明的抗肿瘤药物组合物除含有作为抗肿瘤活性成分的20(S)-人参皂甙-Rh₂外，还含有一种或多种天然或合成的抗肿瘤药物成分或其混合物。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的药物组合物是胃肠道外给药制剂，特别是用于静脉内或肌肉给药的注射液。

如前所述，从人参属植物的适用部分提取的原人参二醇组皂甙具有很强而且较为广泛的生物学活性。人参皂甙-Rh₂属于人参二醇组皂甙的组成成分之一，其结构基本上与-Rb₂、-Rb₃、-Rd和-F₂配基相同，因此可基于其环结构上所连接的糖的种类和数目的不同，在适当的温度和压力条件下，以适当的碱溶液水解处理，除去多余的糖链部分，将原人参二醇组皂甙的大部分成员化学转化或修饰成C₂₀基团呈S构型的人参皂甙-Rh₂，从而得到基本上纯的20(S)-人参皂甙-Rh₂。

因此，本发明涉及一种以原人参二醇组皂甙为原始材料，制备基本上纯的20(S)-人参皂甙的方法，该方法包括将原人参二醇组皂甙的水溶液与饱和碱金属氢氧化物溶液相混合，于高温、高压下回流，然后用低级醇萃取。另外，该方法还包括对低级醇萃取物进行硅胶柱层析和重结晶纯化的步骤。

为此，可以首先以人参、西洋参、三七的可利用部分，例如以选自根、根茎、茎叶、花或果实的一个或多个植物部分为原料，按本领域技术人员已知的方法，制备具有下列结构通式(1)的四环三萜化合物：

其中C₃和C₂₀位上的R₁和R₂各自为不同的糖基。

然后，以式(1)的化合物为起始材料，在高浓度强碱，如碱金属或碱金属氢氧化物的水或醇溶液中，将具有上述结构式的三萜化合物水解并转化成具有下列结构式的、特征在于C₃位上连接1分子葡萄糖的，带单一糖链配糖体的三萜化合物，即人参皂甙-Rh₂：

为了以高产率得到式(2)的人参皂甙-Rh₂单体，适当地提高碱水解的反应温度，对于加快反应速度将是十分关键的。然而，如果单纯在常压下提高温度，必然在温度达到溶剂的沸点后使溶剂迅速蒸发，而使反应难以继续进行。经过反复试验探索，本发明人利用高压釜，使用人参二醇组皂甙的单体混合物，即共同待批中国专利申请No9810中所说的人参皂甙组分I作为原料，与醇碱水解剂于高温、高压下进行水解反应，以较高产率直接经化学转化制备得到20(S)-人参皂甙-Rh₂。

为此，首先将具有式(1)结构的四环三萜化合物，即所谓的人参二醇组皂甙混合物溶解于碱金属醇化物中，然后将此混合物置于高压釜，在持续搅拌下缓缓加热，当压力达到0.5至4Mpa，较好2至3Mpa时，使反应于100至300℃，较好于150至250℃的温度下进行1至1.5小时。

另外，作为一种可代替的方法，也可以将具有式(1)结构的四环三萜化合物，即人参二醇组皂甙混合物溶解于高浓度的碱水溶液中，然后将所得混合物置于高压釜内，在持续搅拌下缓慢加热，当压力达到0.5至5Mpa，较好2-4kpa时，使反应于100-300℃，较好100至200℃的温度下进行约1至1.5小时。

反应完成后，使反应混合物自然冷却至室温。取出反应混合物用蒸馏水适当地稀释，然后用低级醇，如正丁醇提取1-3次。分离并合并有机相，用水洗至中性，回收有机溶剂，所得残留物即为人参皂甙-Rh₂的粗提取物。用低压硅胶层析法进一步纯化所得到的粗提取物，然后用甲醇/水中重结晶，即得到基本上纯的20(S)-人参皂甙-Rh₂。

根据本发明的一个优选实施方案，用于水解反应的水解剂是碱金属的醇化物或高浓度碱金属氢氧化物的水溶液。其中所说的碱金属是金属钠或钾，所说的碱金属醇化物一般是碱金属(钠或钾)与含有1-5个碳原子的低级醇，较好是乙醇反应生成的醇化钠或醇化钾。根据本发明的另一个优选实施方案，用于水解反应的水解剂是碱金属氢氧化物的水溶液，较好是NaOH或KOH的高浓度水溶液。所说的高浓度一般为5-50％(W/V)，较好为20-35％(W/V)。

用于纯化20(S)-人参皂甙-Rh₂的层析系统可以是制备型硅胶薄层层析(TLC)或硅胶柱层析系统。所用的洗脱剂较好为氯仿/甲醇/乙酸乙酯/水组成的下层洗脱剂，但也可以根据需要选用本领域技术人员已知其他洗脱剂。

如前所述，现有技术中制备20(R&S)-人参皂甙-Rh₂的方法，一般是首先从人参总皂甙中分离并纯化人参皂甙单体化合物，如人参皂甙-Rb₁、-Rb₂、-Rb₃、-Rc、-Rd、-Rg等，然后再经乙酰化、水解、催化缩合等步骤得到式(2)的化合物。这些方法反应步骤多、工艺相对比较复杂，而且反应中使用较多的具有易燃和腐蚀性的有机溶剂，因此不但成本较高，而且有一定的危险性，难以适应大规模工业化生产的要求。相反，本发明的方法省去了操作复杂、需要大量有机溶剂的分离纯化人参皂甙单体化合物的步骤，从而大大节约了生产费用，提高了操作的安全性。而且，与人参皂甙单体化学转化制备20(R&S)-或20(R)-人参皂甙-Rh₂的方法相比，由人参二醇组皂甙制备20(S)-人参皂甙-Rh₂的产物收率基本上相当于，甚至高于已知方法的收率水平。

本发明进一步涉及一种用于预防和治疗细胞恶性增生性疾病的药物组合物，该组合物含有作为活性成分的20(S)-人参皂甙-Rh₂，以及一种或多种医药上可接受的赋形剂和/或稀释剂及其他辅助成分。可以按照制药工业中已知的方法将按本发明方法制备的R(S)-人参皂甙-Rh₂与一种或多种医药上可接受的赋形剂或稀释剂按适当比例混合，制成本发明的药物组合物。可将所说的组合物配制成供静脉内、肌肉内、腔腹内、脑脊髓腔内注射给药的注射液，或者制成适于口服给药的片剂、粉剂、丸剂、溶液剂和悬浮剂，以及适于局部给药的喷雾剂、霜剂、软膏、酏剂和栓剂。

为了制备适于胃肠道外途径给药的溶液，例如可以使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠溶液或葡萄糖溶液，或者低浓度(例如1-100mM)磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为载体或稀释剂。可以在这些胃肠道外给药的制剂中加入一种或多种其他辅助成分或添加剂，例如可使用抗坏血酸作为抗氧剂，使用苯甲酸钠等作为防腐剂。

在制备适于口服给药的片剂、粉剂、胶囊剂或栓剂时，可以使用蔗糖、半乳糖、玉米淀粉、明胶、脂质、微晶纤维素等作为赋形剂或载体。并且，在这些剂型中，还可以含有其他适用的增溶剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、分散剂及吸收促进剂等。可以使用制药工业中已知的方法和辅助成分制备微胶囊或脂质体包裹剂。

在局部给药的情况下，可将按照本发明方法制备的20(R)-人参皂甙-Rh₂溶解于含水介质和/或其他适当的赋形剂或载体，如低浓度乙醇中，与上述各种适用的辅助成分，如超氧化物歧化酶(SOD)等自由基清除剂及适当的皮肤渗透剂如二甲基亚砜或卓月桂氮卓酮混合，制成喷雾剂。也可以将本发明的药物组合物加在化妆品工业中已知的基质中，制成乳剂、霜剂、洗剂、面膜、软膏等形式的皮肤保护剂。这样的皮肤保护剂除具有常规化妆品的功能外，还具有预防和/或治疗局部组织的自由基氧化损伤或放射损伤的功能，以及刺激皮肤局部(如面部)表皮细胞增殖、防止皮肤老化皱缩的功能，同时也是全身给药的另一种辅助给药途径。

根据使用目的的不同，本发明的药物组合物中除含有作为基本活性成分的上述20(R)-人参皂甙-Rh₂外，还可含有一种或多种其他具有相同或相似生物学活性，具有辅助或协同作用的天然或合成的药物成分或其混合物。例如当用于抗肿瘤目的时，可在本发明的药物组合物中加入一种或多种具有辅助或协同抗肿瘤作用的中草药提取物或合成的化学抗肿瘤药物或它们的混合物。

本发明药物组合物中20(S)一人参皂甙-Rh₂的含量将取决于待治疗的病症或病理状态的性质、严重程度、病人的年龄、体重、对所用药物的敏感性及给药方式等因素。一般来说，本发明药物组合物中活性化合物20(R)-人参皂甙-Rh₂的用药剂量为0.01至100mg/kg体重，较好为0.1至50mg，最好0.5-20mg/kg体重。

以下实施例旨者在进一步举例说明，而不是限制本发明。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的任何等同替代、改动和改变，对本领域技术人员来说都是显而易见的，并且都将落入本发明待批权利要求范围内。

制备实施例1

将5.0g具有式(I)所示结构通式的四环三萜长工混合物溶解约20ml正丁醇中。同时在玻璃容器内将5.0g金属钠缓慢溶解于200正丁醇中。冷却后，分别将金属钠的醇溶液和原人参二醇组皂甙混合物的醇溶液倒入高压釜内，于大约1.75MPa在压力下将反应混合物加热到约120℃，持续搅拌下使反应进行1.5小时。反应完成后，用水将反应混合物洗至中性，于减低的压力下回收正丁醇，得到约3g粗产物。将所得残留物溶于水中，以低压硅胶柱层析法(用CHCl/MeOH/EtOAc/H₂O(2∶2∶4∶1)洗脱，下层)层析纯化，收集洗脱物并从甲醇/水中重结晶，得到230mg白色针状体，收率4.6％，m.p.278-220℃。[α]₀ ²⁰+20.5(c＝0.53，MeOH)；IR(KBr)cm^-1：3420(OH)：1647(C＝C)：FAB-MS给出的M+Na峰为645；¹³C NMR光谱分析数据(C₅D₅H)与标准品完全相同。

制备实施例2

将20.0g固体氢氧化钠溶解于100ml 95％乙醇中，然后在此20％(W/V)氢氧化钠醇溶液内加入10.0g具有式(I)所示结构通式的四环三萜皂甙混合物。混匀后，缓慢加于高压釜内，于持续搅拌和升高的压力下，于大约150℃加热约2小时。反应完成后，将混合物自然冷却至室温，并于减低的压力下将其抽吸浓缩至原体积的大约1/3。用约500ml水稀释该混合物，并用0.1NHCl溶液将pH调到中性(约7.0)，然后用乙酸乙酯萃取三次(各用200ml乙酸乙酯)，合并萃取物并在其中加入无水硫酸钠(5.0g)放置过夜。于减压下回收乙酸乙酯，得到3.2g棕色固体物。将此固体物过硅胶G层析柱[用氯仿/甲醇/乙酸乙酯/水2∶2∶4∶1)下层洗脱]进行纯化。收集洗脱液并从甲醇/H₂O中重结晶，得到510mg白色针状晶体。收率5.1％，m.p.218-220℃。[α]₀ ²⁰+20.0(c＝0.85，MeOH)；IR(KBr)cm^-1：3430(OH)：1050(C＝C)：FAB-MS给出的M+Na峰为645；¹³C NMR数据与20(S)-人参皂甙-Rh₂标准品的检测值基本相同(略)。

制备实施例3

将10g氢氧化钠溶解于10ml水中，并将此氢氧化钠溶液加入200ml正丁醇中，同时将10.0g具有式(I)所示结构通式的三萜皂甙混合物溶解于100ml正丁醇中。然后将氢氧化钠正丁醇溶液与三萜皂甙的正丁醇溶液一同加入高压釜内，于大约2.0MPa压力下，将反应混合物于150℃加热1小时。反应完成后，将反应混合物室温下放置冷却，并依次用5％HCl溶液和水洗至中性。减低下回收溶剂，得到3.8g棕色固体物。将此粗产物过硅胶G层析柱[用CHCl₃/CH₃OH/EtOAc/H₂O(2∶2∶4∶1)下层洗脱]进行纯化。然后收集洗脱液并从MeOH-H₂O中重结晶，得到456mg白色针状晶体。收率4.56％，m.p.218-220℃。[α]₀ ²⁰+20.0(c＝0.93，MeOH)；IR(KBr)cm^-1：3430(OH)：1647(C＝C)：FAB-MS给出的M+Na峰为642；¹³C NMR数据与20(S)-人参皂甙-Rh₂标准品的检测值基本相同(略)。

制备实施例4

将10.0g金属钠小心溶解于200ml无水乙醇中，然后向所得到的乙醇钠溶液内加入具有式(I)所示结构的三萜皂甙(5.0g)。将所得混合物加入高压釜内，于升高的压力(约2.0MPa)和150℃下加热1小时。反应完成后，将反应混合物自然冷却至室温，加入约500ml水稀释后，用5％HCl(V/V)溶液将所得稀释液的pH调至中性，并用乙酸乙酯提取三次(每次各用200ml)。减压下回收有机溶剂，得到3.8g棕色残留物。将此残留物过预制备的硅胶层析柱[用CHCl₃/CH₃OH/EtOAc/H₂O(2∶2∶4∶1)下层洗脱]，并从MeOH中重结晶，得到280mg白色针状晶体。收率5.6％，m.p.218-220℃。[α]₀ ²⁰+20.5(c＝0.93，MeOH)；IR(KBr)cm^-1：3415(OH)：645(C＝C)：¹³CNMR数据与已报导的20(S)-人参皂甙-Rh₂标准品的NMR数据基本相同(略)。

实验实施例1

人参皂甙-Rh₂体外对小鼠黑色素瘤细胞的分化诱导作用

用培养的小鼠黑色素瘤细胞B₁₆作为靶细胞，观察按本发明方法制备的人参皂甙-Rh₂对瘤细胞的分化诱导及生长抑制作用。在24孔微量滴定板的各孔内分别加入10⁵个/50μl/孔小鼠黑色素瘤B₁₆细胞并于37℃孵箱内保温24小时。保温后，各孔内以一式三份各加入1μg，10μg，100μg，/50μg/孔本发明的人参皂甙-Rh₂，并用生理盐水作为对照于37℃培养48小时，然后用生理盐水将各孔的细胞悬浮洗3次，于显微镜下观察瘤细胞的细胞形态。

结果可见，在人参皂甙-Rh₂在10μg/μl的浓度下对B16细胞有明显的分化诱导作用，表现为黑色素生成能力明显增强，细胞向正常上皮样细胞分化，部分细胞出现网状结构，黑色素颗粒增多，且生长速度减慢。

用10μg/μl浓度的人参皂甙-Rh₂作用4天，细胞酪氨酸活性明显升高，并与细胞的黑色素生成能力成正比，表明人参皂甙可诱导B₁₆细胞向正常细胞分化。另外，细胞动力学研究结果进一步证实，在人参皂甙-Rh₂的作用下，B₁₆细胞的生长大多处于G₁，生长期，而S期细胞则明显减少。

实验实施例2

人参皂甙-Rh₂对小鼠S₁₈₀肉瘤细胞周期移行的影响

雄性昆明小鼠(体重20～24g)腹腔接种S₁₈₀肉瘤细胞，3天后以50mg/kg/天剂量腹腔注射人参皂甙-Rh₂，连续给药7天。对照组动物给予等体积生理盐水。停药后24小时处死动物，取腹水按Dean等的方法处理后，用FACS420荧光细胞激素器对给药后肿瘤细胞周期的变化进行FCM分析。结果表明，腹腔注射人参皂甙-Rh₂组肿瘤S期细胞明显增多，与对照组相比差异非常明显(p＜0.05)。表明人参皂甙-Rh₂可阻断S₁₈₀肉瘤细胞S期向G₂期的移行，造成S期细胞的堆积，从而抑制肿瘤细胞的生长。

Claims (6)

1.一种以原人参二醇组皂甙为起始材料制备20(S)-人参皂甙-Rh₂的方法，该方法包括将原人参二醇组分皂甙的水溶液与碱金属低醇化物或碱金属氢氧化物的醇溶液混合，或将原人参二醇组分皂甙的低级醇溶液与碱金属醇化物的低级醇溶液混合，于高温、高压下反应后再用低级醇萃取。

2.根据权利要求1的方法，所说的制备方法进一步包括对低级醇萃取物进行硅胶层析和重结晶纯化的步骤。

3.据权利要求1的方法，其中所说的碱水解步骤是在0.1-4MPa的压力和100-300℃温度下进行的。

4.根据权利要求1的方法，其中所说的碱金属醇化物或碱金属氢氧化物的浓度5％至50％(W/V)。

5.据权利要求1的方法，其中所说的碱水解反应是用高浓度碱金属醇化物氢氧化物的醇溶液在高压釜中进行的。

6.据权利要求1和4的方法，其中所说的碱金属氢氧化物包括金属钠和钾的氢氧化物，并且其中所说的低级醇包括含有1-5个碳原子的一元醇。