CN101416970A - 阿江榄仁酸在制备糖苷酶抑制剂药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供阿江榄仁酸或其可药用的盐在制备α－葡萄糖苷酶抑制剂的药物中的应用。本发明从紫薇属植物中提取分离强效的α－葡萄糖苷酶抑制剂，植物来源丰富，提取方便，植物本身可多次循环利用，既提高了经济效益，又对环境友好，且该单体化合物产品稳定、易存放。药理实验证实阿江榄仁酸具有强效抑制α－葡萄糖苷酶的作用，其中，与α－糖苷酶引起或有关的生理改变或疾病包括但不限于II型糖尿病。可进一步发展成为临床治疗NIDDM的药物，具有较好的市场化前景。本发明所述的阿江榄仁酸化合物的结构式如上。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物化学领域，具体而言，本发明涉及从紫薇属植物中分离得到的一个五环三萜酸化合物阿江榄仁酸(arjunolic acid)用于制备抑制糖苷酶抑制剂药物的药物用途。该化合物，即2α，3β，23-三羟基-齐墩果-12-烯-28-酸具有强效抑制α-葡萄糖苷酶的生物活性，因此该化合物或其可药用的盐，以及与制剂允许的药物赋形剂或载体制备成的药物组合物可预期作为糖苷酶抑制剂药物尤其是防治II型糖尿病也即非胰岛素依赖型糖尿病药物之用途。
背景技术
糖尿病是临床常见的内分泌代谢性疾病。随着科技进步和生活水平的提高，在全球范围内，糖尿病的发病率正在提高。据统计，糖尿病发生在约3％的人身上，全世界患者总人数已超过一亿两千万，造成国民经济的重大损失。
西医认为糖尿病病人可分为两种：即I型糖尿病(或称胰岛素依赖型，IDDM)和II型糖尿病(或称非胰岛素依赖型，NIDDM)，其中II型糖尿病的发病率及患病率皆远高于I型糖尿病，因此危害更大。
文献报道，使用竞争性α-糖苷酶抑制剂，可以推迟淀粉、蔗糖等糖类化合物在消化道内的转化和吸收，减轻肾脏负担，控制饭后血糖急剧上升，使血糖浓度在一天内变化波动幅度减小。德国拜耳公司研制的α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖(acarbose)于1990年在德国首次上市，现已成为多个国家包括我国治疗II型糖尿病一线用药，其商品名为拜糖平。日本开发的α-糖苷酶抑制剂voglibose也已于1994年上市。正在临床试验的α-糖苷酶抑制剂还有miglitol，emigliate等。
中医常称糖尿病为消渴症。李时珍本草纲目中记录单味中药用于治疗糖尿病者有苦荞麦、苦瓜、三七、夏枯草等187种。但从中分离确定的以α-糖苷酶抑制剂为作用机制的活性先导物和药物鲜见报道。
千屈菜科紫薇属植物在我国大部分分布于云南省(全国有16个种，而在云南的有15种)，临床上该属植物有用于降糖的报道，因此，从中进行活性检测下的活性成分筛选具有开发出新的α-糖苷酶抑制剂之潜力。
发明内容
本发明的目的是提供阿江榄仁酸或其可药用的盐在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的药物中的应用，药理实验证实本发明提供的阿江榄仁酸具有强效抑制α-葡萄糖苷酶的作用，其中，与α-糖苷酶引起或有关的生理改变或疾病包括但不限于II型糖尿病。
本发明所述的阿江榄仁酸化合物，具体结构式如下：
式(1)
称为：2α，3β，23-三羟基-齐墩果-12-烯-28-酸。
阿江榄仁酸来源于千屈菜科紫薇属植物的各个部位，优选从云南省分布广泛的常见的紫薇种，例如绒毛紫薇(Lagerstroemia tomentosa Prezl)、西南紫薇(Lagerstroemia intermediate Koehne)、大叶紫薇(Lagerstroemia reginaeRoxb)、大果紫薇(Lagerstroemia flos-reginae Retz)、小叶紫薇(Lagerstroemiapavviflora)、长毛紫薇(Lagerstroemia villosa Kurz)制备而得。优选植物的根茎和叶，可以是干品或鲜品。
本发明人以往的植物化学研究发现紫薇属植物中主要含有三萜类、香豆素类、酚酸类、倍半萜类、木质素类、和胡萝卜素类化合物[窦辉，张荣平，娄旭，贾婕，周长新，赵昱，Biochemical Systematics and Ecology，2005，33，639-642]。本发明中，以α-葡萄糖苷酶抑制率(α-glucosidase inhibition)为生物活性筛选模型，对上述六种紫薇属植物的乙酸乙酯提取部位进行筛选，并通过多种正、反相层析手段对最强效抑制α-葡萄糖苷酶部位跟踪筛选得到该有效抑制α-葡糖苷酶的式(1)活性化合物，并经红外、质谱、紫外和核磁共振波谱等综合解析推导出其化学结构为阿江榄仁酸(arjunolic acid)，即2α，3β，23-三羟基-齐墩果-12-烯-28-酸。
本发明的阿江榄仁酸或其可药用的盐可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有阿江榄仁酸抑制活性从而可以用于防治II型糖尿病等与α-糖苷酶相关疾病的药物或药物组合物。该药物或药物组合物可以采用片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、滴丸、注射剂、透皮贴剂、气雾剂等剂型；还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。
本发明从采自云南的数种紫薇属植物之根、叶等部位提取物中，用α-葡萄糖苷酶抑制作用为筛选指标，活性追踪提纯其最有效抑制α-葡萄糖苷酶的部位，并从中得到一个抑制α-葡萄糖苷酶作用最强的单体化合物，经化学测定其结构为一个五环三萜酸化合物阿江榄仁酸(arjunolic acid)，即2α，3β，23-三羟基-齐墩果-12-烯-28-酸，从而提供了可期待用于制备α-糖苷酶抑制剂的药物。其中，与α-糖苷酶引起或有关的生理改变或疾病包括但不限于II型糖尿病。
本发明的有益之处是：紫薇属植物为中国西南常见植物药材，从中提取分离强效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，其制备过程简便、成本低廉、低污染，且其植物来源丰富，提取方便，用植物叶子进行提取可以使得植物本身不经破坏而得到多次循环利用，既提高了经济效益，又对环境友好，且该单体化合物产品稳定、易存放。其抑制α-葡萄糖苷酶活性高，极有可能进一步发展成为临床治疗NIDDM的药物，并且符合医药市场上回归自然的趋势，具有潜在的经济效益和社会效益，因此具有较好的市场化前景。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。必须说明，下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：绒毛紫薇干叶中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
1.1 仪器与试剂
核磁共振氢谱(1H-NMR)，核磁共振碳谱(13C-NMR)和二维核磁共振波谱(2D NMR)由INOVA型超导核磁共振波谱仪(VARIAN INOVA-400MHz)测定(四甲基硅醚为内标)；电喷雾质谱(ESI-MS)由Bruker Esquire 3000+质谱仪测定，柱层析用硅胶(100-200，200-300)以及薄层层析用硅胶GF254(10-40目)均购自青岛海洋化工厂；所用试剂均为分析纯，其中石油醚沸程为60-90℃；薄板(TLC)检测用254nm和365nm的紫外灯；显色剂用10％硫酸-乙醇以及溴甲酚绿溶液。
1.2 植物来源与鉴定
供提取用药材为绒毛紫薇(Lagerstroemia tomentosa Prezl)于2001年8月采自云南省境内，由中国科学院昆明植物研究所彭华研究员鉴定。
1.3 提取与分离
样品(绒毛紫薇干叶，重0.5公斤)粉碎后用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得51克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(12.5克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第55-76流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为65.7％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(42毫克)。
1.4 阿江榄仁酸的结构鉴定
阿江榄仁酸：无色针晶；熔点250-252℃(未校)；ESI-MS m/z：487[M-H]-；核磁共振氢谱(CD3OD，400MHz)：δ 5.29(1H)，3.73(1H，多重峰)，3.54(1H，双峰，J＝10.0Hz)，3.39(1H，双峰，J＝9.6Hz)，3.35(2H，单峰)，3.31(1H，双峰，J＝10.0Hz)，2.89(1H，多重峰)，1.22(3H，单峰)，1.14(3H，单峰)，1.10(3H，单峰)，0.98(3H，单峰)，0.95(3H，单峰)，0.86(3H，单峰)，0.74(3H，单峰)；核磁共振碳谱(Me2CO-d6，100MHz)：δ 181.84(C，C-28)，145.37(C，C-13)，123.40(CH，C-12)，78.13(CH，C-3)，69.65(CH，C-2)，66.23(CH2，C-23)，48.92(CH，C-5)，48.13(CH，C-9)，47.86(CH2，C-1)，47.21(CH2，C-19)，47.61(C，C-17)，44.10(C，C-4)，43.00(C，C-14)，42.70(CH，C-18)，39.02(s，C-10)，34.87(CH2，C-21)，33.81(CH2，C-7)，33.55(CH3，C-29)，33.32(CH2，C-22)，31.60(C，C-20)，28.76(CH2，C-15)，26.45(CH3，C-27)，24.60(CH2，C-11)，24.02(CH3，C-30)，23.97(CH2，C-16)，19.08(CH2，C-6)，17.76(CH3，C-25)，17.52(CH3，C-26)，13.86(CH3，C-24)。
根据上述结构鉴定相关数据可以看出，该化合物的1H-NMR和13C-NMR谱与化合物阿江榄仁酸基本一致[Kundu，A.P.；Mahato，S.B.Phytochemistry，1993，32，999；Yu Shao；Bing-Nan Zhou，Long-Ze Lin et al；phytochemistry，1996，38(6)，1487-1492]，从而鉴定出该化合物结构为阿江榄仁酸(arjunolic acid)，即2α，3β，23-三羟基-齐墩果-12-烯-28-酸。
实施例2：绒毛紫薇鲜叶中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
2.1 仪器与试剂：同实施例1。
2.2 植物来源与鉴定：同实施例1。
2.3 提取与分离
样品(鲜叶重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得35克褐黑色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(8.3克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第45-53流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为59.7％(粗提物于与100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(28毫克)。
2.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例3：绒毛紫薇茎枝及根皮中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
3.1 仪器与试剂：同实施例1。
3.2 植物来源与鉴定：同实施例1。
3.3 提取与分离
样品(茎枝及根皮干重0.5公斤)粉碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得43克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(9.6克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第50-57流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为51.5％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(26毫克)。
3.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例4：西南紫薇干叶中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
4.1 仪器与试剂：同实施例1。
4.2 植物来源与鉴定
供提取用药材为西南紫薇(Lagerstroemia intermediate Koehne)于2001年8月采自云南省境内，由中国科学院昆明植物研究所彭华研究员鉴定。
4.3 提取与分离
样品(西南紫薇干叶，重0.5公斤)粉碎后用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得48.9克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(14.1克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第53-70流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为62.1％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(24毫克)。
4.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例5：西南紫薇鲜叶中阿江榄仁酸(ariunolic acid)的制备
5.1 仪器与试剂：同实施例1。
5.2 植物来源与鉴定：同实施例4。
5.3 提取与分离
样品(鲜叶重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得39克褐黑色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(10.1克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第52-59流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为53.2％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(18毫克)。
5.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例6：西南紫薇茎枝及根皮中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
6.1 仪器与试剂：同实施例1。
6.2 植物来源与鉴定：同实施例4。
6.3 提取与分离
样品(茎枝及根皮干重0.5公斤)粉碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得37克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(7.7克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第60-66流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为56.8％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(27毫克)。
6.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例7：大叶紫薇干叶中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
7.1 仪器与试剂：同实施例1。
7.2 植物来源与鉴定
供提取用药材为大叶紫薇(Lagerstroemia reginae Roxb)于2001年8月采自云南省境内，由中国科学院昆明植物研究所彭华研究员鉴定。
7.3 提取与分离
样品(大叶紫薇干叶，重0.5公斤)粉碎后用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得52.5克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(15.6克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第60-72流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为65.5％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(28毫克)。
7.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例8：大叶紫薇鲜叶中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
8.1 仪器与试剂：同实施例1。
8.2 植物来源与鉴定：同实施例7。
8.3 提取与分离
样品(鲜叶重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得45.3克褐黑色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(10.6克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第58-69流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为60.1％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(26毫克)。
8.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例9：大叶紫薇茎枝及根皮中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
9.1 仪器与试剂：同实施例1。
9.2 植物来源与鉴定：同实施例7。
9.3 提取与分离
样品(茎枝及根皮干重0.5公斤)粉碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得46.4克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(11.2克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第58-63流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为56.7％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(22毫克)。
6.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例10：大果紫薇干叶中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
10.1 仪器与试剂：同实施例1。
10.2 植物来源与鉴定
供提取用药材为大果紫薇(Lagerstroemia flos-reginae Retz)于2001年8月采自云南省境内，由中国科学院昆明植物研究所彭华研究员鉴定。
10.3 提取与分离
样品(大果紫薇干叶，重0.5公斤)粉碎后用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得50.7克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(13.8克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第60-68流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为62.7％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(26毫克)。
10.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例11：大果紫薇鲜叶中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
11.1 仪器与试剂：同实施例1。
11.2 植物来源与鉴定：同实施例10。
11.3 提取与分离
样品(鲜叶重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得42.7克褐黑色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(9.7克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第48-57流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为58.2％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(14毫克)。
11.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例12：大果紫薇茎枝及根皮中阿江榄仁酸(ariunolic acid)的制备
12.1 仪器与试剂：同实施例1。
12.2 植物来源与鉴定：同实施例10。
12.3 提取与分离
样品(茎枝及根皮干重0.5公斤)粉碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得44.6克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(8.7克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第52-58流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为50.2％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(14毫克)。
12.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例13：小叶紫薇干叶中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
13.1 仪器与试剂：同实施例1。
13.2 植物来源与鉴定
供提取用药材为小叶紫薇(Lagerstroemia pavviflora)于2001年8月采自云南省境内，由中国科学院昆明植物研究所彭华研究员鉴定。
13.3 提取与分离
样品(小叶紫薇干叶，重0.5公斤)粉碎后用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得50.2克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(13.6克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100∶0-0∶100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第54-63流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为63.3％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(22毫克)。
13.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例14：小叶紫薇鲜叶中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
14.1 仪器与试剂：同实施例1。
14.2 植物来源与鉴定：同实施例13。
14.3 提取与分离
样品(鲜叶重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得41.1克褐黑色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(9.2克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第50-61流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为50.3％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(13毫克)。
14.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例15：小叶紫薇茎枝及根皮中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
15.1 仪器与试剂：同实施例1。
15.2 植物来源与鉴定：同实施例13。
15.3 提取与分离
样品(茎枝及根皮干重0.5公斤)粉碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得43.2克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(8.9克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第53-62流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为51.5％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(16毫克)。
15.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例16：长毛紫薇干叶中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
16.1 仪器与试剂：同实施例1。
16.2 植物来源与鉴定
供提取用药材为长毛紫薇(Lagerstroemia villosa Kurz)于2001年8月采自云南省境内，由中国科学院昆明植物研究所彭华研究员鉴定。
16.3 提取与分离
样品(长毛紫薇干叶，重0.5公斤)粉碎后用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得46.4克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(12.7克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第59-70流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为60.4％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(30毫克)。
16.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例17：长毛紫薇鲜叶中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
17.1 仪器与试剂：同实施例1。
17.2 植物来源与鉴定
同实施例16。
17.3 提取与分离
样品(鲜叶重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得40.8克褐黑色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(8.9克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第49-62流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为51.7％(粗提物于与100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(16毫克)。
17.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例18：长毛紫薇茎枝及根皮中阿江榄仁酸(arjunolic acid)的制备
18.1 仪器与试剂：同实施例1。
18.2 植物来源与鉴定：同实施例16。
18.3 提取与分离
样品(茎枝及根皮干重0.5公斤)粉碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得41.8克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚脱脂(2升/每次，共3次)，继而用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，减压蒸除溶剂，得到的乙酸乙酯浸膏(7.8克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第55-63流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为52.0％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压整除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即阿江榄仁酸(18毫克)。
18.4 阿江榄仁酸的结构鉴定：同实施例1。
实施例19：化合物阿江榄仁酸对α-葡萄糖苷酶的抑制活性检测
19.1 仪器与试剂
19.1.1 实验仪器：酶标仪：ELISA plate reader(Bio-Tek Instruments，USA)
19.1.2 试剂
α-glucosidase即α-葡萄糖苷酶(Sigma，500U/毫升)；4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，Merck)，还原性谷胱甘肽(上海生工)，阿卡波糖即拜糖平(拜耳医药保健有限公司，北京)。
19.2 测试方法
化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用测定采用比色法。样品孔中加入磷酸缓冲液(67毫摩尔/升，pH 6.8，170微升)，还原型谷光甘肽(1毫克/毫升，5微升)，α-葡萄糖苷酶(用磷酸缓冲液稀释成0.2U/毫升，25微升)，化合物阿江榄仁酸用二甲亚砜溶解，用磷酸缓冲液稀释，每孔25微升，使其终浓度为0.04毫克/毫升，0.004毫克/毫升，0.0004毫克/毫升，最后加入底物4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(23.2毫摩尔/升，25微升)，37℃，水浴反应15分钟后，加入碳酸钠(1摩尔/升，50微升)终止反应，在405nm波长处比色测定。空白孔中用相同体积的Tris-HCl缓冲液代替底物。溶剂对照孔中加入与化合物等浓度的二甲亚砜。化合物抑制率由样品OD值对于空白和对照OD值计算。其中受测化合物对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)由剂量效应曲线得到。
19.3 试验结果参见表1：
表1
19.4 实验结论
α-葡萄糖苷酶是α-糖苷酶抑制剂药物筛选中的指标性测试酶，许多药物是基于对α-葡萄糖苷酶竞争性抑制作用而成为降糖药物的。本实验表明该齐墩果烷型五环三萜酸具有强效抑制α-葡萄糖苷酶的作用，其抑制活性堪比一线用药阿卡波糖，因而具有较强的开发潜力，有可能进一步发展成为新的预防或治疗II型糖尿病用药。
Claims (6)
1.一种阿江榄仁酸或其可药用的盐在制备糖苷酶抑制剂药物中的应用，所述阿江榄仁酸及其可药用的盐是一种五环三萜化合物，其结构式为：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在制备预防或治疗由α-葡萄糖苷酶引起的II型糖尿病药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物由阿江榄仁酸或其可药用的盐与制剂允许的药物赋形剂或载体制备成药物组合物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述式(1)化合物由紫薇属植物之任一部位提取分离得到。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述紫薇属植物选自绒毛紫薇、西南紫薇、大叶紫薇、大果紫薇、小叶紫薇、长毛紫薇的干品或鲜品中的一种。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述紫薇属植物选自绒毛紫薇、西南紫薇、大叶紫薇、大果紫薇、小叶紫薇或长毛紫薇的叶。
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