CN101416971A - 桦木酸在制备糖苷酶抑制剂药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供桦木酸及其可药用的盐在制备糖苷酶抑制剂的药物中的应用。所述化合物是从紫薇属植物中分离得到的一个羽扇豆醇型五环三萜酸化合物，药理实验证实该化合物对α－葡萄糖苷酶具有明显的抑制作用，其抑制活性超过一线用药阿卡波糖100％，因此该化合物或其可药用的盐，以及与制剂允许的药物赋形剂或载体制备成的药物组合物可在制备预防或治疗II型糖尿病也即非胰岛素依赖型糖尿病药物中应用。本发明式(1)所示结构式如上。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物化学领域，具体而言，本发明涉及从紫薇属植物中分离得到的一个五环三萜酸化合物桦木酸(betulinic acid)用于制备糖苷酶抑制剂药物的用途。该化合物具有强效抑制α-葡萄糖苷酶的生物活性，因此该化合物或其可药用的盐，以及与制剂允许的药物赋形剂或载体制备成的药物组合物可预期作为糖苷酶抑制剂药物尤其是防治II型糖尿病也即非胰岛素依赖型糖尿病药物之用途。
背景技术
随着科技进步和生活水平的提高，在全球范围内，糖尿病的发病率正在提高。据统计，糖尿病发生在约3％的人身上，全世界患者总人数已超过一亿两千万。其中造成国民经济的重大损失。
糖尿病是临床常见的内分泌代谢性疾病。西医认为糖尿病病人可分为两种：即I型糖尿病(或称胰岛素依赖型，IDDM)和II型糖尿病(或称非胰岛素依赖型，NIDDM)，其中非胰岛素依赖型糖尿病的患病率和发病率更高，危害更大。我国糖尿病患者有2000万以上，其中近90％为II型糖尿病。
文献报道，使用竞争性α-糖苷酶抑制剂，可以推迟淀粉、蔗糖等糖类化合物在消化道内的转化和吸收，减轻肾脏负担，控制饭后血糖急剧上升，使血糖浓度在一天内变化波动幅度减小。此乃有效抑制糖尿病患者前期具备的葡萄糖调节受损尤其是葡萄糖耐量受损(IGT)阶段，而许多尚未发病的糖尿病潜在患者仍处于此阶段当中。德国拜耳公司研制的α-葡糖苷酶抑制剂阿卡波糖(acarbose)于1990年在德国首次上市，现已成为多个国家包括我国治疗非胰岛素依赖型糖尿病一线用药，商品名为拜糖平。亚太地区非胰岛素依赖型糖尿病政策研究组2005年给出治疗指南，将α-葡糖苷酶抑制剂(α-glucosidase)抑制剂作为降餐后血糖的首选用药。各国针对新的α-糖苷酶抑制剂暨降糖药物展开激烈竞争，日本开发的α-糖苷酶抑制剂voglibose也已于1994年上市，正在临床试验的α-糖苷酶抑制剂还有miglitol，emigliate等。然而其居高的价格必将受到新型低廉创新性同类药物的竞争。
中医常称糖尿病为消渴症。李时珍本草纲目中记录单味中药用于治疗糖尿病者有苦荞麦、苦瓜、三七、夏枯草等187种。但从中分离确定的以α-糖苷酶抑制剂为作用机制的活性先导物和药物鲜见报道。
千屈菜科紫薇属植物在我国主要分布于云南省(全国共16个种，在云南则有15种)，临床上该属植物有用于降糖的报道，从中进行活性检测下的活性成分筛选具有开发出新的α-糖苷酶抑制剂之潜力。根据该思路，我们从采自云南的数种紫薇属植物之枝、茎、叶等部位经醇提后再用石油醚萃取的低极性提取物中，用α-葡萄糖苷酶抑制作用为筛选指标，活性追踪提纯石油醚提取物中其最有效抑制α-葡萄糖苷酶的部位，并从中得到一个抑制α-葡萄糖苷酶作用最强的单体化合物，经化学测定其结构为一个羽扇豆型五环三萜化合物桦木酸即betulinic acid，从而提供了可期待用于制备α-糖苷酶抑制剂的药物。其中，与α-糖苷酶引起或有关的生理改变或疾病包括但不限于非胰岛素依赖型糖尿病。
发明内容
本发明的目的是提供桦木酸或其可药用的盐在制备糖苷酶抑制剂药物中的应用。
本发明提供的桦木酸或其可药用的盐尤其在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的应用。药理实验证实桦木酸具有较高的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，可作为预防和治疗与α-糖苷酶有关的疾病或生理改变症状，包括但不限于非胰岛素依赖型糖尿病。
本发明提供的桦木酸或其可药用的盐为羽扇豆型五环三萜化合物，通过从千屈菜科紫薇属植物植物中提取制备得到所述的桦木酸化合物，具体结构如下。
式(1)
桦木酸来源于千屈菜科紫薇属植物的各个部位，优选从云南省分布广泛的常见的紫薇种，例如绒毛紫薇(Lagerstroemia tomentosa Prezl)、西南紫薇(Lagerstroemia intermediate Koehne)、大叶紫薇(Lagerstroemiareginae Roxb)、大果紫薇(Lagerstroemia flos-reginae Retz)、小叶紫薇(Lagerstroemia pavviflora)、长毛紫薇(Lagerstroemia villosa Kurz)制备而得。优选植物的根茎和叶，可以是干品或鲜品。
本发明人以往的植物化学研究发现紫薇属植物中主要含有三萜类、香豆素类、酚酸类、倍半萜类、木质素类、和胡萝卜素类化合物[窦辉，张荣平，娄旭，贾婕，周长新，赵昱，Biochemical Systematics and Ecology，2005，33，639-642，2005]。本发明中，本发明人以α-葡萄糖苷酶抑制(α-glucosidase inhibition)为生物活性筛选模型及评价标准，对上述六种紫薇属植物的石油醚提取部位进行筛选，并通过多种正、反相层析手段对最强效抑制α-葡糖苷酶部位跟踪筛选得到该有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性化合物，并经红外、质谱、紫外和核磁共振波谱等综合解析推导出其化学结构为桦木酸(betulinic acid)。
从已发表资料看，桦木酸基本是作为抗肿瘤和抗HIV天然产物报道和使用的，而本发明得到的该羽扇豆烷型五环三萜酸成分，即桦木酸具有强效抑制α-葡萄糖苷酶的作用，其作用强度超过阳性对照阿卡波糖，此强效的α-葡萄糖苷酶对于该化合物属于首次报道，从而为医药学界及制药企业提供了一种新型的、来自天然界的、可期待用于制备α-糖苷酶抑制剂的药物，用于防治包括但不限于非胰岛素依赖型糖尿病的疾病。
本发明的另一目的是提供所述药物由式(1)化合物或其可药用的盐与制剂允许的药物赋形剂或载体制备成药物组合物。
本发明的桦木酸或其可药用盐可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有桦木酸抑制活性从而可以用于防治非胰岛素依赖型糖尿病等与α-糖苷酶相关疾病的药物或药物组合物。该药物或药物组合物可以采用片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、滴丸、注射剂、透皮贴剂、气雾剂等剂型；还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。
本发明的有益之处是：紫薇属植物为中国西南常见植物药材，从中提取分离强效的α-葡萄糖苷酶抑制剂桦木酸，其制备过程简便、成本低廉、低污染，且其植物来源丰富，提取方便，用植物叶子进行提取桦木酸可以使得植物本身不经破坏而得到多次循环利用，既提高了经济效益，又对环境友好，且该单体化合物产品稳定、易存放。其抑制α-葡萄糖苷酶活性高，极有可能进一步发展成为临床治疗NIDDM的药物，并且符合医药市场上回归自然的趋势，具有潜在的经济效益和社会效益，因此具有较好的市场化前景。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。必须说明，下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：绒毛紫薇干叶中桦木酸(betulinic acid)的制备
1.1 仪器与试剂
核磁共振氢谱(1H-NMR)，核磁共振碳谱(13C-NMR)和二维核磁共振波谱(2D NMR)由INOVA型超导核磁共振波谱仪(VARIANINOVA-400MHz)测定(四甲基硅醚为内标)；电喷雾质谱(ESI-MS)由Bruker Esquire 3000+质谱仪测定，柱层析用硅胶(100-200，200-300)以及薄层层析用硅胶GF254(10-40目)均购自青岛海洋化工厂；所用试剂均为分析纯，其中石油醚沸程为60-90℃；薄板(TLC)检测用254nm和365nm的紫外灯；显色剂用10％硫酸-乙醇以及溴甲酚绿溶液。
1.2 植物来源与鉴定
供提取用药材为绒毛紫薇(Lagerstroemia tomentosa Prezl)于2001年8月采自云南省境内，由中国科学院昆明植物研究所彭华研究员鉴定。
1.3 提取与分离
绒毛紫薇干叶(0.5公斤)粉碎后用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得51克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(14.6克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第33-45流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为49.2％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(12.6毫克)。
1.4 桦木酸的结构鉴定
桦木酸：无色针晶；熔点307-309℃(未校)；ESI-MS m/z：455[M-H]-；核磁共振氢谱(氘代吡啶，400MHz)：δ 4.23(1H，双峰，J＝2.0Hz)，4.55(1H，双峰，J＝0.8Hz)，3.33(1H，多重峰)，3.26(1H，双双峰，J＝8.4，8.4Hz)，2.54(1H)，2.41(1H)，1.57(3H，单峰)，1.05(3H，单峰)，0.85(3H，单峰)，0.84(3H，单峰)，0.79(3H，单峰)，0.60(3H，单峰)；核磁共振碳谱(氘代吡啶，100MHz)：δ 177.8(C，C-28)，150.2(C，C-20)，108.8(CH2，C-29)，76.9(CH，C-3)，55.4(C，C-17)，54.7(CH，C-5)，49.7(CH，C-9)，48.6(CH，C-19)，46.6(CH，C-18)，41.6(C，C-14)，39.9(C，C-8)，38.3(C，C-10)，38.1(CH2，C-1)，37.4(CH，C-13)，36.4(CH2，C-22)，36.3(C，C-4)，33.6(CH2，C-7)，31.7(CH2，C-16)，30.0(CH2，C-15)，29.1(CH2，C-21)，27.4(CH3，C-23)，27.0(CH2，C-2)，24.9(CH2，C-12)，20.0(CH2，C-11)，18.2(CH3，C-30)，17.6(CH2，C-6)，15.2(CH3，C-25)，15.2(CH3，C-26)，15.1(CH3，C-24)，13.7(CH3，C-27)。
根据上述结构鉴定相关数据可以看出，该化合物的波谱数据与化合物桦木酸基本一致[Akira Ikuta；Hideji Itokawa；Phytochemistry，27(9)，2813-2815，(1988)；Zongze Ma；Yoshio Hano，Feng Qiu；et al.；Tetrahedron，45，3261-3263，(2004)]，从而鉴定出该化合物结构为桦木酸(betulinic acid)。
实施例2：绒毛紫薇鲜叶中桦木酸(betulinic acid)的制备
2.1 仪器与试剂：同实施例1。
2.2 植物来源与鉴定：同实施例1。
2.3 提取与分离
样品(绒毛紫薇鲜叶，重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得35克褐黑色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(10.1克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第31-40流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为51.5％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(8.3毫克)。
2.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例3：绒毛紫薇茎枝及根皮中桦木酸(betulinic acid)的制备
3.1 仪器与试剂：同实施例1。
3.2 植物来源与鉴定：同实施例1。
3.3 提取与分离
样品(绒毛紫薇茎枝及根皮，干重0.5公斤)粉碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得43克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(12.2克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第35-47流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为55.3％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(7.1毫克)。
3.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例4：西南紫薇干叶中桦木酸(betulinic acid)的制备
4.1 仪器与试剂：同实施例1。
4.2 植物来源与鉴定
供提取用药材为西南紫薇(Lagerstroemia intermediate Koehne)于2001年8月采自云南省境内，由中国科学院昆明植物研究所彭华研究员鉴定。
4.3 提取与分离
样品(西南紫薇干叶，重0.5公斤)粉碎后用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得48.9克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(16.0克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第31-40流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为47.7％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(8.7毫克)。
4.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例5：西南紫薇鲜叶中桦木酸(betulinic acid)的制备
5.1 仪器与试剂：同实施例1。
5.2 植物来源与鉴定：同实施例4。
5.3 提取与分离
样品(西南紫薇鲜叶，重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得39克褐黑色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(12.2克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第32-43流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为50.2％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(6.5毫克)。
5.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例6：西南紫薇茎枝及根皮中桦木酸(betulinic acid)的制备
6.1 仪器与试剂：同实施例1。
6.2 植物来源与鉴定：同实施例4。
6.3 提取与分离
样品(西南紫薇茎枝及根皮干，重0.5公斤)粉碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得37克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(13.7克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第33-39流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为49.8％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(7.3毫克)。
6.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例7：大叶紫薇干叶中桦木酸(betulinic acid)的制备
7.1 仪器与试剂：同实施例1。
7.2 植物来源与鉴定
供提取用药材为大叶紫薇(Lagerstroemia reginae Roxb)于2001年8月采自云南省境内，由中国科学院昆明植物研究所彭华研究员鉴定。
7.3 提取与分离
样品(大叶紫薇干叶，重0.5公斤)粉碎后用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得52.5克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(18.3克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第35-46流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为52.5％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(11.1毫克)。
7.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例8：大叶紫薇鲜叶中桦木酸(betulinic acid)的制备
8.1 仪器与试剂：同实施例1。
8.2 植物来源与鉴定：同实施例7。
8.3 提取与分离
样品(大叶紫薇鲜叶，重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得45.3克褐黑色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(12.8克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第29--39流份所测得α-葡糖苷酶抑制活性为48.6％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(10.2毫克)。
8.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例9：大叶紫薇茎枝及根皮中桦木酸(betulinic acid)的制备
9.1 仪器与试剂：同实施例1。
9.2 植物来源与鉴定：同实施例7。
9.3 提取与分离
样品(大叶紫薇茎枝及根皮，干重0.5公斤)粉碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得46.4克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(13.5克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第29-38流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为46.4％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(8.6毫克)。
9.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例10：大果紫薇干叶中桦木酸(betulinic acid)的制备
10.1 仪器与试剂：同实施例1。
10.2 植物来源与鉴定
供提取用药材为大果紫薇(Lagerstroemia flos-reginae Retz)于2001年8月采自云南省境内，由中国科学院昆明植物研究所彭华研究员鉴定。
10.3 提取与分离
样品(大果紫薇干叶，重0.5公斤)粉碎后用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得50.7克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(17.7克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第34-40流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为50.1％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(10.2毫克)。
10.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例11：大果紫薇鲜叶中桦木酸(betulinic acid)的制备
11.1 仪器与试剂：同实施例1。
11.2 植物来源与鉴定：同实施例10。
11.3 提取与分离
样品(大果紫薇鲜叶，重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得42.7克褐黑色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(13.2克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第35-39流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为40.5％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(4.5毫克)。
11.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例12：大果紫薇茎枝及根皮中桦木酸(betulinic acid)的制备
12.1 仪器与试剂：同实施例1。
12.2 植物来源与鉴定：同实施例10。
12.3 提取与分离
样品(大果紫薇茎枝及根皮，干重0.5公斤)粉碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得44.6克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(12.3克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第30-34流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为40.7％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(5.2毫克)。
12.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例13：小叶紫薇干叶中桦木酸(betulinic acid)的制备
13.1 仪器与试剂：同实施例1。
13.2 植物来源与鉴定
供提取用药材为小叶紫薇(Lagerstroemia pavviflora)于2001年8月采自云南省境内，由中国科学院昆明植物研究所彭华研究员鉴定。
13.3 提取与分离
样品(小叶紫薇干叶，重0.5公斤)粉碎后用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得50.2克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(17.9克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第31-37流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为43.5％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(8.8毫克)。
13.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例14：小叶紫薇鲜叶中桦木酸(betulinic acid)的制备
14.1 仪器与试剂：同实施例1。
14.2 植物来源与鉴定：同实施例13。
14.3 提取与分离
样品(小叶紫薇鲜叶，重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得41.1克褐黑色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(13.5克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第33-40流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为45.5％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(7.0毫克)。
14.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例15：小叶紫薇茎枝及根皮中桦木酸(betulinic acid)的制备
15.1 仪器与试剂：同实施例1。
15.2 植物来源与鉴定：同实施例13。
15.3 提取与分离
样品(小叶紫薇茎枝及根皮，干重0.5公斤)粉碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得43.2克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(11.7克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第31-35流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为41.8％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(6.4毫克)。
15.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例16：长毛紫薇干叶中桦木酸(betulinic acid)的制备
16.1 仪器与试剂：同实施例1。
16.2 植物来源与鉴定
供提取用药材为长毛紫薇(Lagerstroemia villosa Kurz)于2001年8月采自云南省境内，由中国科学院昆明植物研究所彭华研究员鉴定。
16.3 提取与分离
样品(长毛紫薇干叶，重0.5公斤)粉碎后用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得46.4克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(14.8克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第33-39流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为45.2％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(7.5毫克)。
16.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例17：长毛紫薇鲜叶中桦木酸(betulinic acid)的制备
17.1 仪器与试剂：同实施例1。
17.2 植物来源与鉴定：同实施例16。
17.3 提取与分离
样品(长毛紫薇鲜叶，重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得40.8克褐黑色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(13.2克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第32-39流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为44.4％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(7.2毫克)。
17.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例18：长毛紫薇茎枝及根皮中桦木酸(betulinic acid)的制备
18.1 仪器与试剂：同实施例1。
18.2 植物来源与鉴定：同实施例16。
18.3 提取与分离
样品(长毛紫薇茎枝及根皮，干重0.5公斤)粉碎后并用95％乙醇室温下浸提两次，每次24小时，提取液冷却后合并，经减压浓缩得41.8克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用2升热水溶解，石油醚萃取(2升/每次，共3次)，减压蒸除溶剂，得到的石油醚浸膏(12.9克)用10克100-200目硅胶拌样，用硅胶柱(200-300目，150克)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱，每100毫升为一流份，薄层层析检测相同组分之流份，减压脱溶后送测α-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第32-38流份所测得α-葡萄糖苷酶抑制活性为43.7％(粗提物于100微克/毫升浓度下测定)，继而减压蒸除其溶剂，以甲醇为溶剂进行多次重结晶，得到无色针晶化合物即桦木酸(8.6毫克)。
18.4 桦木酸(betulinic acid)的结构鉴定：同实施例1。
实施例19：化合物桦木酸(betulinic acid)对α-葡萄糖苷酶的抑制活性检测
19.1 仪器与试剂
19.1.1 实验仪器：酶标仪：ELISA plate reader(Bio-Tek Instruments，USA)
19.1.2 试剂
α-D-Glucosidase即α-葡萄糖苷酶(Sigma，500U/毫升)；4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，Merck)，还原性谷胱甘肽(上海生工)，阿卡波糖即拜糖平(拜耳医药保健有限公司，北京)。
19.2 测试方法
化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用测定采用比色法。样品孔中加入磷酸缓冲液(67毫摩尔/升，pH 6.8，170微升)，还原型谷光甘肽(1毫克/毫升，5微升)，α-葡萄糖苷酶(用磷酸缓冲液稀释成0.2U/毫升，25微升)，化合物桦木酸用二甲亚砜溶解，用磷酸缓冲液稀释，每孔25微升，使其终浓度为0.04毫克/毫升，0.004毫克/毫升，0.0004毫克/毫升，最后加入底物4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(23.2毫摩尔/升，25微升)，37℃，水浴反应15分钟后，加入碳酸钠(1摩尔/升，50微升)终止反应，在405nm波长处比色测定。空白孔中用相同体积的三羟甲基氨基甲烷-氯化氢缓冲液代替底物。溶剂对照孔中加入与化合物等浓度的二甲亚砜。化合物抑制率由样品OD值对于空白和对照OD值计算。其中桦木酸对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)由剂量效应曲线得到。
19.3 试验结果参见表1：
表1
19.4 实验结论
α-葡萄糖苷酶是α-糖苷酶抑制剂药物筛选中的的指标性测试酶，许多药物是基于对α-葡萄糖苷酶竞争性抑制作用而成为降糖药物的。本实验表明桦木酸具有强效抑制α-葡萄糖苷酶的作用，其抑制活性超过一线用药阿卡波糖100％，因而具有较强的开发潜力，有可能进一步发展成为新的预防或治疗非胰岛素依赖型糖尿病用药。
Claims (6)
1.一种桦木酸或其可药用的盐在制备糖苷酶抑制剂药物的应用，所述桦木酸化合物是羽扇豆型五环三萜化合物，具有式(1)所示结构式：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：桦木酸或其可药用的盐在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物由式(1)化合物或其可药用的盐与制剂允许的药物赋形剂或载体制备成药物组合物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：式(1)化合物由紫薇属植物之任一部位提取分离得到。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述紫薇属植物选自绒毛紫薇、西南紫薇、大叶紫薇、大果紫薇、小叶紫薇、长毛紫薇的干品或鲜品中的一种。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述紫薇属植物选自绒毛紫薇、西南紫薇、大叶紫薇、大果紫薇、小叶紫薇、长毛紫薇的叶。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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