CN102433347A - 羽扇豆醇c28氧化酶基因及其获得方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羽扇豆醇C28氧化酶基因及其获得方法与应用，涉及五环三萜化合物的生物合成技术。羽扇豆醇C28氧化酶基因来源于长春花植物叶片，基因被命名为CYP716AL1，基因序列为①或②：①其核苷酸序列是SEQIDNO：1所示DNA分子；②在严格条件下与①限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白或具有90％以上同源性蛋白的DNA分子。本发明将羽扇豆醇C28氧化酶基因转入酵母细胞，转基因酵母能够以羽扇豆醇为底物，在羽扇豆醇的C28位置上进行逐级氧化反应最终形成抗癌化合物白桦酸。

Description

羽扇豆醇C28氧化酶基因及其获得方法与应用

技术领域

本发明涉及五环三萜化合物的生物合成技术，尤其涉及一种羽扇豆醇C28氧化酶基因及其获得方法与应用。

背景技术

五环三萜化合物广泛分布于植物界中，主要有乌苏烷型、齐墩果烷型和羽扇豆烷型这三个类型；其代表化合物分别是熊果酸(ursolic acid)、齐墩果酸(oleanolic acid)和白桦酸(betulinic acid)。其中白桦酸具有显著的抗HIV(艾滋病病毒)和抗肿瘤活性，是寻找抗HIV和抗肿瘤药物的优秀的先导物。目前通过对白桦酸的结构修饰，已获得了不少生物活性优异且具有新型作用机制的衍生物。白桦酸的生物合成主要是通过2，3-环氧鲨烯的环化形成羽扇豆醇，然后通过下游的细胞色素P450单加氧酶作用下生成。目前，关于2，3-环氧鲨烯环化酶基因的克隆已有不少报道，但是下游的P450基因国内外尚未有报道。

化合物白桦酸主要分布在白桦科植物，在树皮中进行合成，目前，此抗癌药物的获得方法主要是依赖植物资源；直接从植物中进行提取纯化，生产成本高，严重导致了植物资源的破坏与濒危。挖掘白桦酸生物合成途径中的关键基因，利用微生物平台合成白桦酸将大大降低此药的生产成本。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种羽扇豆醇C28氧化酶基因及其获得方法与应用。

本发明的目的是这样实现的：

从长春花植物中分离得到一个关键P450基因，并将此基因转入酵母细胞，转基因酵母能够催化羽扇豆醇生成白桦酸；因此，本发明将为抗癌药物白桦酸的合成提供必要的基因资源与新的合成技术。

1、羽扇豆醇C28氧化酶基因

来源于长春花植物叶片，基因被命名为CYP716AL1，基因序列为①或②：

①其核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示DNA分子；

②在严格条件下与①限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白或具有90％以上同源性蛋白的DNA分子；

所述严格条件是在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

2、羽扇豆醇C28氧化酶基因的获得方法

设计引物P1和P2，以长春花叶片的cDNA为模板，利用PCR技术扩增羽扇豆醇C28氧化酶基因，P1和P2的核苷酸序列如下：

P1：5’-CGGGATCCATGGAGATCTTCTATGTCACTCT-3’

P2：5’-GGGGTACCTTATGCATTAATGTGAGGATAAAGTCG-3’。

3、羽扇豆醇C28氧化酶基因的应用

①白桦酸在酵母细胞中的生物合成

将羽扇豆醇C28氧化酶基因转入酵母细胞，转基因酵母能够以羽扇豆醇为底物，在羽扇豆醇的C28位置上进行逐级氧化反应最终形成抗癌化合物白桦酸。

②检测方法

利用LC-MS分析方法检测转基因酵母是否能够催化羽扇豆醇生成白桦酸，转羽扇豆醇C28氧化酶基因的酵母能够催化白桦酸的生物合成，而对照酵母是以空载体进行转化，不插入任何基因，不能催化白桦酸的生物合成。

本发明具有下列优点和积极效果：

1、创新性：

①首次从长春花植物中克隆出羽扇豆醇C28氧化酶基因的全长cDNA序列，序列如SEQ ID NO：1所示；

②利用酵母细胞表达了SEQ ID NO：1所示的基因序列，首次揭示序列为SEQID NO：2所示的蛋白质能够在羽扇豆醇的C28位置上进行逐级氧化反应，最终生成了白桦酸。

2、应用前景

白桦酸是一个具有巨大潜力的抗癌药，目前关于它的研究已经集中在临床前的研究阶段，有望成为继著名抗癌药物紫杉醇后的另一个抗癌化合物。本发明首次从长春花中克隆到一个关键P450基因的全长序列，并利用酵母转化技术鉴定了此P450基因所编码的蛋白质能够催化羽扇豆醇生成白桦酸，从而为将来利用酵母生产白桦酸提供了一个必要的基因资源。长期以来，白桦酸的生产主要是依赖植物资源，从植物体内直接提取与纯化，既导致了白桦酸的生产成本较高，有破坏了生态环境，不利于植物资源的可持续利用。本发明的公开将会开启利用微生物合成白桦酸的研究热潮，具有很大的应用前景。

附图说明

图1为长春花总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图2为PCR扩增羽扇豆醇C28氧化酶基因(CYP716AL1)的全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中：

泳道M为DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增产物；

图3为羽扇豆醇在C28位置上进行逐级氧化反应生成白桦酸的反应图；

图4为转基因酵母合成白桦酸的LC-MS检测图谱，其中：

betulinic acid为白桦酸的标准样品；

WAT11/pESC-TRP为转空载体的对照酵母；

WAT11/CYP716AL1为转羽扇豆醇C28氧化酶基因的酵母，箭头所指为转基因酵母合成的白桦酸化合物。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明：

1、羽扇豆醇C28氧化酶基因的全长cDNA序列的获得

根据GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)里提供的3个序列表达标签(序列标签在GenBank中的注册号码分别为FD660831、FD661068与FD661229)信息，利用RACE-PCR技术，得到此基因的全长cDNA序列信息，然后用下列一般的PCR反应体系就可获得。

25μl PCR反应体系为：cDNA模板2μl、引物P1与P2各1μl，5×Buffer5μl，dNTP Mixture(2.5mmol/L each)2μl，Phusion酶0.2μl(NEB生物技术有限公司)，ddH₂O 13.8μl；

反应条件为：先98℃预变性3min；然后98℃10s，62℃30s，72℃45s，共35个循环；最后72℃延伸5min。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。其中，泳道M为DL 2000Plus DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增产物，结果表明，经PCR扩增获得了长度约为1500bp左右的目的片段。回收并纯化PCR产物，将其连接到pMD 18-T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌Top 10感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。结果表明，该片段的长度为1443bp，其脱氧核糖核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2、羽扇豆醇C28氧化酶基因的应用

将羽扇豆醇C28氧化酶基因克隆进一种酵母表达载体pESC-TRP，形成含有羽扇豆醇C28氧化酶基因的酵母表达质粒pESC-TRP-CaAO。将此表达质粒pESC-TRP-CaAO转入酵母，对照为酵母细胞的空载体(pESC-TRP)转化。挑取转基因酵母单克隆，接种于20mL SD-TRP缺失培养基中，30℃250转/分钟培养至OD₆₀₀＝0.8，双蒸水洗涤三次后，重悬于含2％半乳糖的SD-TRP培养基中，加入80μg羽扇豆醇至培养基中，30℃诱导培养24小时。收集上述培养得到的菌液，加入等体积的乙酸乙酯抽提，取上层乙酸乙酯于一新瓶中，旋转蒸干后溶于300μL甲醇溶液，进行HPLC-MS检测。HPLC-MS检测结果如图4所示，转入空载体pESC-TRP的对照酿酒酵母中，没有白桦酸的生成，而转入插有羽扇豆醇C28氧化酶基因的载体(pESC-TRP-CaAO)导致了白桦酸的生物合成。

该基因的发现有利于研究三萜皂苷生物合成途径及其调控机制，为代谢工程技术生产这类化合物提供必要的基因资源，具有重要的应用价值。

将此基因转入酵母细胞，利用酵母翻译此基因所编码的蛋白质，编码的蛋白质被命名为CaAO，能够催化羽扇豆醇生成白桦酸(见图4)，CaAO是如下a)或b)的蛋白质：

a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有羽扇豆醇C28氧化酶活性的由a)衍生的蛋白质。

为了使a)的CaAO蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列4所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

上述b)中的CaAO蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的CaAO蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表4所示的标签的编码序列得到。

序列表

<110>中国科学院武汉植物园

<120>羽扇豆醇C28氧化酶基因及其获得方法与应用

<160>4

<210>1

<211>1443

<212>DNA

<213>长春花（Catharanthus roseus）

<400>

ATGGAGATCTTCTATGTCACTCTCCTTAGCTTATTCGTTCTCCTTGTTTCCCTTTCCTTTCATTTCCTCTTCTACAAAAACAAATCAACCTTGCCGGGACCGTTACCTCCGGGCCGGACCGGCTGGCCGATGGTGGGAGAAAGTCTTCAATTTCTCTCAGCGGGCTGGAAAGGCCATCCTGAAAAATTCATATTTGATCGTATGGCTAAGTATTCTTCGAATGTCTTTAGGTCACATCTACTAGGTGAACCTGCCGCGGTATTTTGTGGTGCAATTGGAAATAAATTTTTATTCTCAAATGAAAATAAACTTGTTCAAGCATGGTGGCCTGATTCAGTAAACAAAGTTTTCCCATCTTCAAATCAAACTTCTTCAAAAGAAGAAGCTATTAAAATGCGAAAGATGCTTCCGAATTTTCTTAAACCGGAAGCTTTACAACGTTACATAGGTTTAATGGACCAAATTGCCCAAAAACATTTTTCTTCCGGTTGGGAAAATAGGGAACAAGTTGAAGTTTTTCCTTTAGCCAAAAATTATACTTTTTGGTTAGCTTCAAGATTATTTGTTAGTGTTGAAGATCCAATTGAAGTTGCAAAATTACTTGAACCCTTTAATGTTTTGGCCTCGGGACTAATTTCTGTCCCTATTGATTTGCCTGGTACACCTTTTAATCGTGCTATAAAGGCATCAAATCAAGTAAGAAAAATGCTTATTTCTATAATTAAACAAAGAAAAATTGATTTAGCTGAAGGAAAAGCATCTCCAACACAAGATATTTTGTCACATATGCTTTTAACAAGTGATGAAAATGGTAAATTCATGCATGAATTGGATATTGCTGATAAAaTCCTTGGTTTGTTAATTGGTGGACATGATACTGCAAGTTCTGCATGTACTTTTATTGTCAAGTTTCTTGGAGAATTGCCAGAGATATATGAAGGAGTTTATAAAGAACAAATGGAGATTGCCAACTCAAAAGCCCCTGGTGAATTCTTGAATTGGGAAGATATTCAAAAGATGAAATATTCATGGAATGTAGCATGTGAAGTGTTGAGACTTGCACCACCTCTCCAAGGTGCTTTTAGAGAAGCCCTAAATGATTTCATGTTCCATGGATTCTCTATTCCAAAAGGATGGAAGATTTACTGGAGTGTGAATTCAACACACAGAAATCCAGAATGTTTTCCAGATCCACTTAAATTTGACCCGTCAAGATTTGATGGATCTGGACCTGCTCCATATACATTTGTACCATTTGGTGGAGGACCAAGAATGTGCCCTGGAAAAGAATACGCTAGGCTGGAAATTCTGGTTTTTATGCATAATCTTGTGAAGAGATTCAAGTGGGAAAAAATTATCCCAAATGAAAAGATTGTTGTTGATCCAATGCCAATTCCTGAAAAAGGACTTCCTGTTCGACTTTATCCTCACATTAATGCATAA；

 

<210>2

<211>480

<212>PRT

<213>长春花（Catharanthus roseus）

<400>

MEIFYVTLLSLFVLLVSLSFHFLFYKNKSTLPGPLPPGRTGWPMVGESLQFLSAGWKGHPEKFIFDRMAKYSSNVFRSHLLGEPAAVFCGAIGNKFLFSNENKLVQAWWPDSVNKVFPSSNQTSSKEEAIKMRKMLPNFLKPEALQRYIGLMDQIAQKHFSSGWENREQVEVFPLAKNYTFWLASRLFVSVEDPIEVAKLLEPFNVLASGLISVPIDLPGTPFNRAIKASNQVRKMLISIIKQRKIDLAEGKASPTQDILSHMLLTSDENGKFMHELDIADKILGLLIGGHDTASSACTFIVKFLGELPEIYEGVYKEQMEIANSKAPGEFLNWEDIQKMKYSWNVACEVLRLAPPLQGAFREALNDFMFHGFSIPKGWKIYWSVNSTHRNPECFPDPLKFDPSRFDGSGPAPYTFVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHNLVKRFKWEKIIPNEKIVVDPMPIPEKGLPVRLYPHINA；

 

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

CGGGATCCAT GGAGATCTTC TATGTCACTC T；

 

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

GGGGTACCTT ATGCATTAAT GTGAGGATAA AGTCG。

 

Claims (4)

1.一种羽扇豆醇C28氧化酶基因，其特征在于：

来源于长春花植物叶片，基因被命名为CYP716AL1，基因序列为①或②：①其核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示DNA分子；②在严格条件下与①限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白或具有90％以上同源性蛋白的DNA分子；

所述严格条件是在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

2.按权利要求1所述的一种羽扇豆醇C28氧化酶基因的获得方法，其特征在于：

设计引物P1和P2，以长春花叶片的cDNA为模板，利用PCR技术扩增羽扇豆醇C28氧化酶基因，P1和P2的核苷酸序列如下：

P1：5’-CGGGATCCATGGAGATCTTCTATGTCACTCT-3’

P2：5’-GGGGTACCTTATGCATTAATGTGAGGATAAAGTCG-3’。

3.按权利要求1所述的一种羽扇豆醇C28氧化酶基因的应用，其特征在于白桦酸在酵母细胞中的生物合成：

将羽扇豆醇C28氧化酶基因转入酵母细胞，转基因酵母能够以羽扇豆醇为底物，在羽扇豆醇的C28位置上进行逐级氧化反应最终形成抗癌化合物白桦酸。

4.按权利要求1所述的一种羽扇豆醇C28氧化酶基因的应用，其特征在于检测方法是：

利用LC-MS分析方法检测转基因酵母是否能够催化羽扇豆醇生成白桦酸，转羽扇豆醇C28氧化酶基因的酵母能够催化白桦酸的生物合成，而对照酵母是以空载体进行转化，不插入任何基因，不能催化白桦酸的生物合成。

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