CN112063647A - 酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法、酿酒酵母重组菌Cuol02及应用 - Google Patents

酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法、酿酒酵母重组菌Cuol02及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法、酿酒酵母重组菌Cuol02及应用，本发明通过同源重组的手段，将生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块6个基因：tHMG1、HcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9和HcOSC6基因均导入酿酒酵母中得到初始重组菌Cuol01，发现其可产生葫芦二烯醇；再导入甲羟戊酸途径的上游模块7个基因：ERG12、ERG13、ERG19、ERG8、IDI、tHMG1和ERG10基因的表达，得到最终重组菌Cuol02，其葫芦二烯醇产量明显提高；为人工合成达玛二烯和原人参二醇奠定了基础。

Description

酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法、酿酒酵母重组菌Cuol02 及应用
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法、酿酒酵母重组菌Cuol02及应用。
背景技术
葫芦二烯醇(cucurbitadienol)是从葫芦科多种植物中分离得到的葫芦烷型四环三萜化合物，药理活性研宄表明葫芦二烯醇具有显著的抗炎、抗肿瘤作用，而且葫芦二烯醇是葫芦素类和罗汉果甜苷等化合物的三萜碳骨架，为其生物合成的关键前体化合物。
葫芦素已被报道具有良好的抗癌活性，其中葫芦素B、D和葫芦素E、I细胞毒性显著。通过特异阻断肿瘤细胞生长所需的JAK-STAT信号通路来抑制肝癌、膀胱癌、胰腺癌等癌细胞的扩散，可与其他抗癌药物一块使用，提高癌症治疗的效果。此外，各种葫芦素还具有抗糖尿病、抗肥胖显著的降血糖和降血糖作用，例如来自苦瓜中的葫芦烷糖苷和苦瓜苷。雪胆属植物块茎中富含葫芦素类和其他三萜皂苷成分，特别是从该属植物中提取的雪胆素(雪胆甲素和雪胆乙素混合物)开发成“雪胆素片”，具有清热解毒、抗菌消炎等多种功效，临床上用于治疗菌痢、肠炎、支气管炎及急性扁桃体炎等多种疾病。国内外学者还发现雪胆甲素具有明显的细胞毒性作用，通过抑制JAK2/STAT3下游的生存素 (Survivin)，破坏肌动蛋白细胞骨架，引导细胞发生PARP介导的凋亡，从而抑制肿瘤细胞的增殖，使其成为一类新型的抗癌药物。雪胆属植物中葫芦素含量均非常低，由于人类无序采挖等原因，雪胆类药材野生资源正在日益减少，同时，雪胆素提取原材料的种植周期长，并且对种植地块和种植技术要求较高。因此，如何能够高效地获得这些有用的次生代谢物，缓解野生资源压力，一直都是科研究人员思考和研究的问题。
目前利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认为是一种最有潜力的方法，如在大肠杆菌中生产紫杉醇的前体紫杉二烯已达到1000mg/L(Parayil Kumaran Ajikumar et al.,2010,Science,330:70-74)；银杏内酯类(Ginkgolides)前体左旋海松二烯(Levopimaradiene)，在改造后的大肠杆菌工程菌中达到700mg/L的产量(Effendi Leonard et al.,2010,PNAS,107(31): 13654-13659)；在酵母工程菌中生产青蒿素(Artemisinin)的前体青蒿酸 (Artemisinic acid)最高达到100mg/L(Dae-Kyun Ro etal.,2006,Nature, 440:940-943)；目前国内在青蒿素，紫杉醇和丹参酮等药物分子的生物合成方面有相关研究，同时Shang等人利用罗汉果(Siraitiagrosvenorii)中的葫芦二烯醇合酶(SgCBS)来生产葫芦二烯醇，将携带SgCBS人工质粒导入到构建好的三萜前体底盘酵母菌株WD-2091，摇瓶系统生产葫芦二烯醇的得率为82.89mg/L。
雪胆素与绝大多数葫芦素化合物相似，是一种高度氧化的四环三萜化合物，生物合成途径主要通过甲羟戊酸代谢途径合成。即以乙酰辅酶A为原料合成异戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)的一条代谢途径。随后，角鲨烯在鲨烯环氧酶(Squaleneepoxidase，SE)进一步的催化作用下形成2,3-氧化鲨烯。最后2,3-氧化鲨烯在葫芦二烯醇合酶(cucurbitadienol synthase,CBS)一种氧化鲨烯环化酶(OSC)作用下，形成葫芦素的三萜碳骨架葫芦二烯醇(Cuol)，之后再经细胞色素CYP450酶和乙酰基转移酶(BAHD-AT)等经过一系列的结构修饰后，衍生出更多的葫芦素终产物。
目前，葫芦素生物合成途径仍然不清楚，存在很多氧化修饰催化酶基因没被挖掘鉴定出来，其中主要包括氧化还原酶，比如CYP450酶、短链脱氢酶等。要搞清这些活性葫芦素化合物的生物合成途径，必须鉴定这些途径中相关的关键酶基因。然而，发掘和鉴定葫芦素后期作用酶基因需要有足够的催化前体葫芦二烯醇，这严重影响了葫芦素途径后期作用酶的挖掘鉴定。因此，迫切需要构建生产葫芦二烯醇(Cuol)的酿酒酵母底盘细胞成为研究葫芦素生物合成途径的关键环节，为解析完整葫芦素生物合成途径和工厂化生产葫芦素单体奠定了重要基础。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母重组菌Cuol01、酿酒酵母重组菌Cuol02及应用，为雪胆甲素及葫芦素的生物合成提供了足够的中间体。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法，包括以下步骤：
S1、将来源于酿酒酵母BY4742的甲羟戊酸途径的相关基因ERG20、ERG9、 tHMG1和来源于植物中华雪胆中编码葫芦二烯醇合酶基因synHcOSC6以及细胞色素P450还原酶基因synHcCPR1，分别构建形成基因表达盒成为生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块；
S2、运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母BY4742中的δDNA 位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因LEU2，形成含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母工程菌Cuol01。
作为优选，所述酿酒酵母工程菌Cuol01提供的基因表达盒的构建方法，是利用组成型启动子HXT7p、TEF2 p、TPI1p、GPM1p、PGK1p、TDH3p和终止子ADH1t、TDH2t、ENO2t、CYC1t、FBA1t、PGT1t控制tHMG1、HcCPR1、 ERG1、ERG20、ERG9和HcOSC6基因的表达，即生产葫芦二烯醇途径的下游模块。
作为优选，所述酿酒酵母工程菌Cuol01提供的基因表达盒的构建方法中的筛选标记基因为LEU2。
本发明还提供了一种由上述的构建方法构建得到的酿酒酵母重组菌 Cuol01。
本发明还提供了一种含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母重组菌Cuol02的构建方法，包括以下步骤：
将来源于酿酒酵母BY4742的甲羟戊酸途径上游模块的相关基因ERG12、 ERG13、ERG8、ERG19、ERG10、IDI、tHMG1分别构建形成基因表达盒，然后运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母工程菌Cuol01中的 YPRCδ15DNA位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因HIS3，形成强化了酿酒酵母类异戊二烯合成途径代谢通量，同时含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母重组菌Cuol02。
作为优选，所述酿酒酵母工程菌Cuol02提供的基因表达盒的构建方法，是利用组成型启动子ENO2p、TEF2p、GPM1p、TPI1p、PGK3p、TEF1p、TDH3p 和终止子CPS1t、IDP1t、HIS5t、PRM5t、PRM9t、ADH1t、SPG5t控制ERG12、 ERG13、ERG19、ERG8、IDI、tHMG1和ERG10基因的表达，即强化甲羟戊酸途径的上游模块。
作为优选，所述酿酒酵母工程菌Cuol02提供的基因表达盒的构建方法中筛选标记基因为HIS3。
作为优选，各个基因表达盒的构建是通过两步重叠延伸PCR的方法连接，多个基因表达盒通过酵母同源重组系统重组至酵母基因组的δDNA和 YPRCδ15DNA位点。
作为优选，所述δDNA位点为酿酒酵母染色体上多个δ基因中的1～10个随机位置；所述YPRCδ15DNA位点为酿酒酵母第16条染色体的第16条染色体的 YPRCdelta15位点位置。
本发明还提供了一种由上述的构建方法构建得到的酿酒酵母重组菌 Cuol02。
本发明还提供了如上述的酿酒酵母重组菌Cuol02在制备葫芦二烯醇的应用。
具体应用时，上述发酵采用的培养基为液体培养基，其中各组分及其终浓度如下：终浓度为1％(质量百分含量)Yeast Extract(酵母膏)、终浓度为2％(质量百分含量)Peptone(蛋白胨)、终浓度为2％(质量百分含量)Dextrose(葡萄糖),用水补足体积：固体培养基需再加2％琼脂粉。
上述发酵的条件为：30℃、250rpm/min、摇瓶振荡培养4天。
本发明还提供了植物来源编码葫芦二烯醇合酶基因synHcOSC6、细胞色素 P450还原酶基因synHcCPR1密码子优化核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
本发明还提供了来源酵母编码ERG20、ERG9、ERG1、ERG12、ERG13、 ERG8、ERG19、ERG10、IDI、tHMG1的核苷酸序列分别为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、、 SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12。
本发明中涉及的蛋白和基因的名称具体如下：
HcOSC6为来源于雪胆(Hemsleya chinensis)的葫芦二烯醇合酶编码基因，其编码的蛋白为葫芦二烯醇合酶(cucurbitadienol synthase)；
HcCPR1为来源于雪胆(Hemsleya chinensis)的烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸- 细胞色素P450还原酶1编码基因,其编码的蛋白为烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶(NDPH-cytochrome P450reductase)；
tHMG1为来源于部分酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1编码基因，具体为酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 1(3-hydroxy1-3-methylglutaryl-CoA reductase)；
ERG1为酵母鲨烯环氧酶基因名，其编码的酶为鲨烯环氧酶(Squaleneepoxidase)；
ERG20为酵母法呢基焦磷酸合酶基因名，其编码的酶为法呢基焦磷酸合酶(Farnesyl pyrophosphate synthase)；
ERG9为酵母鲨烯合酶基因名，其编码的酶为鲨烯合酶(Squalene synthase)；
ERG12为酵母甲羟戊酸激酶基因名，其编码的酶为甲羟戊酸激酶 (Mevalonatekinase)；
ERG13为酵母HMG辅酶A合酶基因名，其编码的酶为HMG辅酶A合酶 (Hydroxymethylglutaryl CoA synthetase)；
ERG19为酵母磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因名，其编码的酶为磷酸甲羟戊酸脱羧酶(Pophosphomevalonate deearboxylase)；
ERG8为酵母磷酸甲羟戊酸激酶基因名，其编码的酶为磷酸甲羟戊酸激酶(Phosphomevalonate kinase)；
IDI为酵母异戊二烯焦磷酸异构酶基因名，其编码的酶为异戊二烯焦磷酸异构酶(isopentenyl pyrophosphate isomerase)；
ERG10为酵母乙酰乙酰辅酶A转移酶基因名，其编码的酶为乙酰乙酰辅酶 A转移酶基(acetyl-CoA acyltransferase)。
本发明所述的编码葫芦二烯醇合酶基因synHcOSC6以及细胞色素P450还原酶基因synHcCPR1，是由生工生物技术有限公司(中国上海)按酵母体内表达密码子优化后，合成核苷酸序列后进行PCR扩增获得；酵母来源编码ERG20、 ERG9、tHMG1、ERG12、ERG13、ERG8、ERG19、ERG10、IDI、tHMG1等9 个基因是通过设计引物扩增酵母基因组获得。
本发明还提供了来源于质粒pESC-LEU2和pESC-HIS3的筛选标记基因 LEU2和HIS3核苷酸序列分别为SEQ ID No.103和SEQ ID No.104。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明通过同源重组的手段，将生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块6个基因：tHMG1、HcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9和HcOSC6基因均导入酿酒酵母中得到初始重组菌Cuol01，发现其可产生葫芦二烯醇；再导入甲羟戊酸途径的上游模块7个基因：ERG12、ERG13、ERG19、ERG8、IDI、tHMG1和ERG10 基因的表达，得到最终重组菌Cuol02，其葫芦二烯醇产量明显提高；为人工合成达玛二烯和原人参二醇奠定了基础。
附图说明
图1为生产葫芦二烯醇(cucurbitadienol,Cuol)推导的合成路径和构建示意图；
其中，Cuol01为构建在酿酒酵母BY4742中的δDNA位点上，Cuol02为构建在酿酒酵母Cuol01-1中的YPRCδ15DNA位点上。
图2为生产葫芦二烯醇的基因表达盒构建示意图(用于生产完整葫芦二烯醇的基因上、下游模块组合)。
图3为本发明中Cuol01中基因表达盒融合PCR扩增的7个融合片段(各个基因表达盒通过两步重叠延伸PCR连接)。
图4为Cuol02中基因表达盒融合PCR扩增的7个融合片段(各个基因表达盒通过两步重叠延伸PCR连接)。
图5为TLC检测生产葫芦二烯醇酿酒酵母底盘细胞的提取液；其中， Ergosterol酵母中内源麦角固醇；squalene为酵母中内源角鲨烯；cucurbitadienol 为目的产物；1为Ergosterol标准品；2为葫芦二烯醇cucurbitadienol标准品；3-6 为酵母底盘细胞Cuol01不同菌株的提取物，7-8为酵母底盘细胞Cuol02不同菌株的提取物。
图6为GC-MS进一步鉴定cucurbitadienol目标产物；其中，cucurbitadienol：标准品；WT：野生型BY4742的提取物；Cuol01-1：生产葫芦二烯醇的酿酒酵母工程菌Cuol01中命名Cuol01-1菌株的提取检测；Cuol02-2：生产葫芦二烯醇的酿酒酵母工程菌Cuol02中命名Cuol02-2菌株的提取检测。
图7为GC-MS进一步测定底盘细胞生产目标产物cucurbitadienol的产量其中，图7中C:Cuol01中命名Cuol01-1菌株生产葫芦二烯醇产量最高，为133.21 mg/L；Cuol02中命名Cuol02-2菌株生产葫芦二烯醇产量最高，为296.37mg/L； GIL77-pYES2:HcOSC6为对照组，前期人工质粒系统生产葫芦二烯醇，产量为 18.51mg/L；
图7中D:Cuol01中命名Cuol01-1菌株生产葫芦二烯醇在发酵96小时时产量最高；Cuol02中命名Cuol02-2菌株生产葫芦二烯醇在发酵96小时时产量最高。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
基因元件克隆和基因表达盒的构建分为以下三步:
(1)酵母基因组DNA提取
挑取酿酒酵母BY4742(Saccharomyces cerevisiae BY4742)菌斑于YPD液体培养基(配方:1％Yeast Extract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(葡萄糖))中，30℃，200rpm，培养24h，10000g，5分钟收集菌体于1.5ml离心管中，水清洗两次，菌体重悬于酵母破壁液中(25ul酵母破壁酶，470ul山梨醇缓冲液，5ul B-ME)，30℃温浴1h后离心:菌体用500ul TENTS缓冲液(10 mMTris-HCI,pH 7.5；1mM EDTA,pH 8.0:100mM NaAc:2％triton-100；1％ SDS)重悬，0℃水浴1h；酚/氯仿抽提2次；上清液加3倍体积的EtOH,1/10 倍体积的3M NaAc，20℃冰箱放置2h:1300g，4℃，离心10min，倒掉上清，沉淀用70％EtOH，洗剂沉淀2次后吹干，双蒸水溶解，-20℃保存备用，得到酵母基因组DNA。
(2)HcOSC6和HcCPR1序列密码子优化
来源于雪胆(Hemsleya chinensis)的HcOSC6和HcCPR1序列进行密码子优化，由生工生物技术有限公司(中国上海)完成，基因命名为synHcOSC6、 synHcCPR1。
(3)基因序列扩增和构建基因表达盒
本发明中使用或构建的所有菌株在表1中列出，用于构建质粒和菌株的引物在附件表1中列出,每种酵母菌株构建的一般程序描述如下：
首先，将每个启动子，基因，终止子，营养选择标记和同源臂进行PCR扩增，分别用表2中引物扩增获得功能模块，采用
Figure BDA0002687907210000103
High-Fidelity DNA Polymerase (NEB:M0491)进行基因扩增。PCR反应体系为：94℃、5min；94℃、30S，56℃、 1.5min，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。
其次，PCR扩增结束后，进行跑胶，确认扩增成功后进行目的条带回收。基因切胶回收使用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒进行目的基因回收。回收后在NanoReady超微量紫外可见分光光度计上测定其回收浓度，放-20℃冰箱中，保存备用。
最后，得到基本片段，相邻的基本片段均具有40-75bp的同源序列，用于重组或融合PCR；其次，使用相邻的2–4个基本片段作为模板，进行融合PCR，得到每个融合片段构建形成基因表达盒(如图2和图3所示)。
表1使用的酵母菌株
Table 1 Yeast strains used in this study
Figure BDA0002687907210000101
表2用于构建酵母底盘细胞株的扩增引物
Table 2.Primers used for the construction of yeast strains
Figure BDA0002687907210000102
Figure BDA0002687907210000111
Figure BDA0002687907210000121
Figure BDA0002687907210000131
实施例2
酿酒酵母基因工程菌Cuol01的构建
生产葫芦二烯醇途径的下游模块基因表达盒(tHMG1、HcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9构建完成后，通过标准醋酸锂转化方法(LiAc/ssDNA)将融合片段纯化，定量并共转化入酵母菌株，因为每个相邻的片段共享40-75bp的同源序列，它们将通过酵母同源重组连接在一起并整合到染色体δDNA位点上。具体步骤如下：
(1)出发菌酿酒酵母BY4742于YPD中过夜培养，取1ml(OD约0.6-1.0) 分装到1.5mlEP管中，4C、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤,同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mM LiAc：10mM DTT； 0.6Msorbitol；10mM Tris-HCI(pH7.5)，处理液使用时才加DTT)，25℃下放置 20min.离心,弃上清,菌体中加入1ml IM sorbitol(0.22um水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1Msorbitol重悬二次),到最终体积约为90u1，即为BY4742感受态细胞。
(2)在超净工作台中进行如下转化体系配比，PEG3350(50％(W/V过滤除菌)240ul，LiAc 1.0M(过滤除菌)36ul，SSDNA(2.0mg/ml)50ul，融合片段2ul，除菌水33ul，共360ul。用混合好的转化体系重悬菌体，于30℃培养箱中保温 20min；42℃热激40min，取150ul转化菌液涂布于SC-LEU固体筛选培养基： 2％葡萄糖，缺对应营养选择标记氨基酸LEU；筛选培养的条件为：倒置放于30℃培养箱中培养2-3天，待转化子长出来，挑选单克隆，提基因组分别用表2引物进行PCR鉴定，得到全部6条对应的目的片段的为正确的阳性克隆，命名为菌株Cuol01。
实施例3
酿酒酵母基因工程菌Cuol02的构建
酿酒酵母基因工程菌Cuol01构建成功后，选取生产葫芦二烯醇最高第一代工程菌Cuol1-1作为转入菌，将甲羟戊酸途径上游模块的(ERG12、ERG13、 ERG8、ERG19、ERG10、IDI、tHMG1)基因表达盒构建完成后，采用实施例2 中相同的方法进行Cuol1-1感受态细胞的制备及转化，转入染色体的 YPRCδ15DNA位点上。
用混合好的转化体系重悬菌体，于30℃培养箱中保温20min；42℃热激 40min，取150ul转化菌液涂布于SC-LEU-HIS3固体筛选培养基：2％葡萄糖，缺对应营养选择标记氨基酸LEU和HIS；筛选培养的条件为：倒置放于30℃培养箱中培养2-3天，待转化子长出来，挑选单克隆，提基因组分别用表2引物进行PCR鉴定，得到全部7条对应的目的片段的为正确的阳性克隆，命名为菌株 Cuol02。
实施例4
工程菌Cuol01和Cuol02生产葫芦二烯醇
1、工程菌培养及产物提取
在固体筛选培养平板中活化的BY4742、由实施例2和实施例2构建的重组工程菌株Cuol01-9和Cuol02-3；于YPD液体筛选培养基中制备发酵种子液 (30℃，250rpm，16小时)；离心收集菌体，转移至含250ml发酵液的1000ml 三角瓶中,调OD至0.5,各菌株相应的发酵培养基同筛选培养基，30℃，250 rpm/min。振荡培养生长96h，得到发酵产物。进一步检测产物葫芦二烯醇的含量。
提取产物条件：发酵产物8000rpm离心5min收集细胞菌体，用2ml裂解液(20％KOH，50％EtOH)，55℃孵育1h，每20min摇晃一次；用相同体积的正己烷萃取三次合并，得到提取产物。
2、薄层色谱(TLC)鉴定葫芦二烯醇
将浓缩的萃取物点到TCL板上(薄层色谱法)，用溶剂环己烷/乙酸乙酯(12:1，体积比)展开，并用5％的硫酸乙醇显色剂染色显点，检测提取产物。
3、气相质谱(GC-MS)鉴定和测定葫芦二烯醇
将上述提取产物作经下述处理：
加入200ul N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide至浓缩的萃取物中， 70℃衍生化1h后，通过GC-MS对代谢产物进行分析。
衍生化后的干燥样品重悬于200μL萃取溶剂中，即用1ml正己烷重新溶解，然后转移至玻璃自动进样器小瓶中的玻璃插件中。吸取每个样品的1μl直接进样到与ISQ型质谱联用的定量GC超气相色谱仪(THERMO Science)中检测。
使用7890B GC(安捷伦)和配有Zebron ZB5-HT色谱柱(Phenomenex)的电子轰击(EI)5977AMSD(安捷伦)进行GC-MS分析。色谱条件：以不分流模式(脉冲压力30psi)注入1μL样品(进样口250℃)，该程序涉及2分钟的柱箱温度170℃，以20℃/min的速度升至300℃在300℃下11.5分钟。在8 分钟的溶剂延迟后，以扫描模式(60-800质量单位)进行检测，设置为7.2。使用MassHunter工作站(Agilent)软件进行数据分析。葫芦二烯醇标准品中的葫芦二烯醇保留时间为25.21min。采用标准曲线定量分析测定葫芦二烯醇含量： Y＝1137000000X+20510000(R＝0.9991)。
4、结果
(1)薄层色谱(TLC)检测结果如图5所示，选取第一代酵母工程菌Cuol01 中Cuol01-3 Cuol01-4、Cuol01-5、Cuol01-6的提取物检测，样品中葫芦二烯醇和葫芦二烯醇标准品Rf值相近，表明提取产物中有葫芦二烯醇。选取第二代酵母工程菌中Cuol02-1和Cuol02-1的提取物检测，样品中葫芦二烯醇和葫芦二烯醇标准品Rf值相近，表明提取产物中有葫芦二烯醇。
(2)酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742(WT)没有葫芦二烯醇。
(3)Cuol01:酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742中引入外源的葫芦二烯醇合酶、细胞色素P450氧化还原酶基因和甲羟戊酸途径的相关基因ERG20、 ERG9、tHMG1得到的重组菌；其提取产物经葫芦二烯醇GC-MS分析，结果如图6所示，其中,TIC:cucurbitadienol为葫芦二烯醇标准品，(B)WT：空白对照， Cuol01-1：Cuol01-1的提取物，Cuol02-2：Cuol02-2的提取物；可以看出，样品中葫芦二烯醇和葫芦二烯醇标准品保留时间为25.21min和25.22min，表明提取产物中有葫芦二烯醇。
(4)含量检测结果如表3所示，其中第一代酵母工程菌中Cuol01-1葫芦二烯醇含量最高(如图7所示)，达133.21mg/L，Cuol01-7葫芦二烯醇含量最低，达74.02mg/L；在Cuol01-1基础上通过对酿酒酵母中上游模块的相关基因 ERG12、ERG13、ERG8、ERG19、ERG10、IDI、tHMG1的表达调控后，即强化甲羟戊酸途径代谢通量后获得系列显著提高目标产物产量的工程菌Cuol02，各工程菌发酵96h时产量如表3所示，其中Cuol02-2葫芦二烯醇含量最高(如图7所示)，达296.37mg/L。
表3摇瓶中不同菌株产生的葫芦二烯醇
Table3-6 cucurbitadienol production by different strains in shakeflasks
Figure BDA0002687907210000171
Figure BDA0002687907210000181
该表3中所有给定的数据均代表三个重复序列的平均值，并具有相应的标准偏差。阴影是本实施例构建的底盘菌株中葫芦吧二烯醇产量最高的菌株。
酿酒酵母构建过程中，将下游模块整合到酵母菌株BY4742的δDNA位点后，所得菌株CUOL01-1在摇瓶中由葡萄糖产生133.21mg/L葫芦二烯醇，这表明我们的构建设计是可行的，因为与GIL77酵母细胞中人工质粒表达HcOSC6 的相比，只需一步整合即可将葫芦二烯醇产量提高六倍以上。
在下一步中，将上游模块整合到CUOL01-1的Yprc-delta15位点，产生菌株CUOL02-2。在摇瓶中，其葫芦二烯醇产量进一步提高至296.37mg/L。然而，菌株CUOL02-2的葫芦二烯醇产量比菌株CUOL01-1高55％，如图7所示。这表明引入上游模块促进了向MVA途径的代谢通量，将底物物质转化并积累葫芦二烯醇。在不同时间梯度发酵的试验中，检测酵母提取物显示发酵时间在96h 时达可达到最大值。
序列表
<110> 云南大学
<120> 酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法、酿酒酵母重组菌Cuol02及应用
<160> 104
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2313
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 1
atgtggaagt tgaagattgg tggtgaatct gttggcaaga acgatgaaag attgttgaag 60
actgttaaca atcatttggg taggcaagtt tgggaattct ctaacgaatc tgattccgat 120
tccgattcag attctcacca tttccaaatc gatgaagcta gaaacacctt ctaccataat 180
agattccatc aaaagcaatc ttctgacttg ttcattagaa tccaatatgg aaaggaaatt 240
tcttctggtg gtaaaatcgg tggtatcaaa ttgaaggaat ctgaagaagt ttctggtgaa 300
gccgtcaaga ccactttaga acgtgcattg aatttttact ctgccattca aacatctgat 360
ggtaactggg cctctgattt gggtggtcca atgttcttat taccaggttt gattatctct 420
ttgtatgtca ctggtgtttt gaattccgtt ttatctaagc aacatagaca agagatctgt 480
agatatatct ataaccatca aaatgaagat ggtggttggg gtctgcatat tgaaggtcca 540
tccactatgt tttgttccgt cttgaactac gttgctttga gattgttgag aaaggaccca 600
tatgaagata gtatgcctaa ggctagatta tggattcttg accacggtgg tgctaccgct 660
atcacttctt ggggtaaatt gtggttatct gttttaggtg tttacgaatg gtcaggtaat 720
aacccattac caccagaatt ttggatttta ccatacttct tgcccttcca tcctggtaga 780
atgtggtgtc actgtagaat ggtctacttg ccaatgtctt atttgtacgg taaaagattt 840
gtcggtccaa tcactccaac tgtattgtct ttgagaaagg aattatacac ggtcccatac 900
catgaaattg attggaacaa gtctagaaat acgtgtgcta aagaagattt gtactatcct 960
catcctaaga tgcaagacat tttatggggt agtatccatc atgtctatga accattcttt 1020
accagatggc caggtaaaag attaagagaa aaagctctgg atgctgctat gcaacatatc 1080
cactatgaag atgaaaacac tagatatatt tgtttaggtc cagttaacaa agttttgaat 1140
atgttgtgtt gttgggttga agacccacat agtgaagctt ttaagttaca tttggaaaga 1200
gttcatgact acttgtgggt ggctgaagac ggtatgaaga tgcaaggtta taatggttcc 1260
caattgtggg atactgcctt ctctgttcaa gctataattt ctaccaaatt gactgataat 1320
ttcggtccta ccttgagaaa ggcccacgat tttattaaga actcccaaat ccgtcaagat 1380
tgtccaggtg acccaaacat ttggtataga catattcata agggtgcttg gccattctct 1440
actgctgatc atggttggtt gatttctgat tgtactgccg aaggcttgaa ggctgcctta 1500
ttgttgagta agttgtcttc tgaaactgtt ggtgaacctt tggaaagaaa tagattgtat 1560
gacgctgtta atgttttgct ttcattgcaa aatgaaaacg gtggtatcgc ttcttacgag 1620
ttgactagat catatccatg gttggaatta attaacccag ctgaaacctt cggggatatt 1680
gtcattgact acccttacgt cgaatgtact tcagcttcta ttgaagcttt ggccttgttt 1740
aagaaattac acccaggtca tagaactaaa gaaatagaga acgctgttgc taaagctgct 1800
aagtttttgg aagatatgca aagagaagat ggttcctggt acggttgttg gggtgtttgt 1860
ttcacctacg ctggttggtt cggtattaag ggtttggttg ctgctggtcg taagtataat 1920
aactgtccaa ctattagaaa ggcttgtaat ttcttgttat caaaggaatt accaggtggt 1980
ggttggggtg aatcttatct aagttgtcaa aacaaagttt acactaactt agaaggtaat 2040
agaccacatt tggtaaatac agcttgggct ttgatggctt tgattgaagc tggtcaatat 2100
gaaaaggatc caacaccttt acatagagct gctagattgt tgattaattc tcaattagaa 2160
aacggtgact tcccacaaga agaaattatg ggtgttttta acaagaactg tatgataact 2220
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<211> 2124
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 2
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gttcatgacg ctcaacatcc atacagatcc aacgtcgctg ttagaaaaga attacactct 960
cctgctagtg accgttcatg tactcatttg gaattcgata tttctggttc cgctttgacc 1020
tatgaaaccg gtgaccacgt tggtgtctat tgtgaaaatt tgaccgaaac tgttgaagaa 1080
gctttaaatt tgttcggttt atctcctgaa acttacttta gtattcatac tgataatgaa 1140
gatggtactc caattggtgg tggttcttta ccaccaccat ttgcttcttg tactttgaga 1200
gttgctttga cacgttacgc tgatttgttg aactccccaa agaagtccgc tttgttagct 1260
ttagctgctc atgctagcaa cccaattgaa gctgatagat taagatatct agcttctcca 1320
gctggtaaag acgaatattc tcaatctgtt gttggtgttc aaaaatcatt gttagaagtt 1380
atggctgaat tcccatctgc taaaccacct ctaggtgtat tctttgctgc tgttgctcca 1440
agattgcaac caagatacta ttctatttct tcctcttctc gtatggcccc atctagaatt 1500
cacgttactt gtgctttagt ttacgacaag atgccaaccg gtagaacaca taagggtgtt 1560
tgttccactt ggatgaaaaa ttccgtttct gttgaaaaat ctcatgaatg ttcttgggct 1620
ccaattttcg tgagacaatc taactttaag ttgccagctg attctaaggt tccaatcatt 1680
atgattggtc caggtactgg tttagcacca ttcagaggtt tcttgcaaga aagattggct 1740
ttgaaggaat caggtgttga aatgggtcca tccatgttgt tcttcggttg tagaaacaga 1800
agaactgatt ttatctacga agatgaattg aataactttg ttgaaactgg tgctttgtct 1860
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ggtgacgcta aaggtatggc tagagatgtt catagaactt tgcataccat tgttcaagaa 2040
caaggttctt tagattcatc taaggctgaa tctatggtta aaaatttgca aatgaacggt 2100
agatacttga gagatgtttg gtaa 2124
<210> 3
<211> 1059
<212> DNA
<213> 酵母(Saccharomyces)
<400> 3
atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60
gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg tgactggtat 120
gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagctaa atagaggttt gtccgttgtg 180
gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga agaatacgaa 240
aaggttgcca ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttacttctt ggtcgccgat 300
gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360
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aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt ccatgaggtc 480
accttccaaa ccgaattggg ccaattgatg gacttaatca ctgcacctga agacaaagtc 540
gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcaa gactgcttac 600
tattctttct acttgcctgt cgcattggcc atgtacgttg ccggtatcac ggatgaaaag 660
gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatacttcca aattcaagat 720
gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac agatatccaa 780
gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattggaac ttgcttccgc agaacaaaga 840
aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa atgcaaaaag 900
attttcaatg acttgaaaat tgaacagcta taccacgaat atgaagagtc tattgccaag 960
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actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaatag 1059
<210> 4
<211> 1335
<212> DNA
<213> 酵母(Saccharomyces)
<400> 4
atgggaaagc tattacaatt ggcattgcat ccggtcgaga tgaaggcagc tttgaagctg 60
aagttttgca gaacaccgct attctccatc tatgatcagt ccacgtctcc atatctcttg 120
cactgtttcg aactgttgaa cttgacctcc agatcgtttg ctgctgtgat cagagagctg 180
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gagaaattgt tgttaactaa atggagtttc gacggaaatg cccccgatgt gaaggacaga 360
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caagaagtca tcaaggagat caccgagaaa atgggtaatg gtatggccga ctacatctta 480
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tacgtagctg gtttggtcgg tgatggtttg acccgtttga ttgtcattgc caagtttgcc 600
aacgaatctt tgtattctaa tgagcaattg tatgaaagca tgggtctttt cctacaaaaa 660
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<210> 5
<211> 1494
<212> DNA
<213> 酵母(Saccharomyces)
<400> 5
atgtctgctg ttaacgttgc acctgaattg attaatgccg acaacacaat tacctacgat 60
gcgattgtca tcggtgctgg tgttatcggt ccatgtgttg ctactggtct agcaagaaag 120
ggtaagaaag ttcttatcgt agaacgtgac tgggctatgc ctgatagaat tgttggtgaa 180
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attccatacc cttacaaggc cgatatccct aaagttgaaa aattgaagga cttggtcaaa 360
gatggtaatg acaaggtctt ggaagacagc actattcaca tcaaggatta cgaagatgat 420
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aatcctgctc ctatgcacgg tcacgttatt cttggtagtg atcatatgcc aatcttggtt 780
taccaaatca gtccagaaga aacaagaatc ctttgtgctt acaactctcc aaaggtccca 840
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catccattga ctggtggtgg tatgactgtc ggtttgcatg atgttgtctt gttgattaag 1080
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<210> 6
<211> 1332
<212> DNA
<213> 酵母(Saccharomyces)
<400> 6
atgtcattac cgttcttaac ttctgcaccg ggaaaggtta ttatttttgg tgaacactct 60
gctgtgtaca acaagcctgc cgtcgctgct agtgtgtctg cgttgagaac ctacctgcta 120
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<210> 7
<211> 1476
<212> DNA
<213> 酵母(Saccharomyces)
<400> 7
atgaaactct caactaaact ttgttggtgt ggtattaaag gaagacttag gccgcaaaag 60
caacaacaat tacacaatac aaacttgcaa atgactgaac taaaaaaaca aaagaccgct 120
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caatgtgtca accaatctga gctagagaaa tttgatggcg tttctcaagg taaatacaca 240
attggtctgg gccaaaccaa catgtctttt gtcaatgaca gagaagatat ctactcgatg 300
tccctaactg ttttgtctaa gttgatcaag agttacaaca tcgacaccaa caaaattggt 360
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ggtggtacca acgcgttgtt caactctttg aactggattg aatctaacgc atgggatggt 540
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gaatatcctt acgtcgatgg tcatttttca ttaacttgtt acgtcaaggc tcttgatcaa 780
gtttacaaga gttattccaa gaaggctatt tctaaagggt tggttagcga tcccgctggt 840
tcggatgctt tgaacgtttt gaaatatttc gactacaacg ttttccatgt tccaacctgt 900
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<212> DNA
<213> 酵母(Saccharomyces)
<400> 8
atgtcagagt tgagagcctt cagtgcccca gggaaagcgt tactagctgg tggatattta 60
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<212> DNA
<213> 酵母(Saccharomyces)
<400> 9
atgaccgttt acacagcatc cgttaccgca cccgtcaaca tcgcaaccct taagtattgg 60
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<210> 10
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<212> DNA
<213> 酵母(Saccharomyces)
<400> 10
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<212> DNA
<213> 酵母(Saccharomyces)
<400> 11
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<212> DNA
<213> 酵母(Saccharomyces)
<400> 12
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ttgaacattg ctaagaattt ggttggatct gcaatggctg ggtctgttgg tggatttaac 1140
gcacatgcag ctaatttagt gacagctgtt ttcttggcat taggacaaga tcctgcacaa 1200
aatgttgaaa gttccaactg tataacattg atgaaagaag tggacggtga tttgagaatt 1260
tccgtatcca tgccatccat cgaagtaggt accatcggtg gtggtactgt tctagaacca 1320
caaggtgcca tgttggactt attaggtgta agaggcccgc atgctaccgc tcctggtacc 1380
aacgcacgtc aattagcaag aatagttgcc tgtgccgtct tggcaggtga attatcctta 1440
tgtgctgccc tagcagccgg ccatttggtt caaagtcata tgacccacaa caggaaacct 1500
gctgaaccaa caaaacctaa caatttggac gccactgata taaatcgttt gaaagatggg 1560
tccgtcacct gcattaaatc ctaa 1584
<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Unknown)
<400> 13
tttctttttg ctttttcttt ttttttctct tgaactcggc caggcgcctt tatatcata 59
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 14
gaccggatgc aatgccaatt gtaatagctt tcccattgtt ttatatttgt tgtaaaaagt 60
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 15
ggatatagga atcctcaaaa tg 22
<210> 16
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 16
gaggtcgctc ttattgacca cacctctacc ggcatgctgt tggaatagaa atcaactat 59
<210> 17
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 17
actagttagt agatgatagt tgatttctat tccaacagca tgccggtaga ggtgtggtc 59
<210> 18
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 18
gtttgaaaga tgggtccgtc acctgcatta aatcctaaag ttataaaaaa aataagtgt 59
<210> 19
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 19
actttaaaat ttgtatacac ttattttttt tataacttta ggatttaatg caggtgacg 59
<210> 20
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 20
cacaaaaaca aaaagttttt ttaattttaa tcaaaaaatg gctgcagacc aattggtga 59
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 21
ggtgacttca gttttcacca attggtctgc agccattttt tgattaaaat taaaaaaac 59
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 22
cttctcgtag gaacaatttc g 21
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 23
ggggccgtat acttacatat ag 22
<210> 24
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 24
atggagacaa cttcatagag gaggattcag attccatgtt tagttaatta tagttcgtt 59
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 25
ttagaatata cggtcaacga actataatta actaaacatg gaatctgaat cctcctcta 59
<210> 26
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 26
aactaaatca ttaaagtaac ttaaggagtt aaatttatta ccaaacatct ctcaagtat 59
<210> 27
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 27
gcaaatgaac ggtagatact tgagagatgt ttggtaataa atttaactcc ttaagttac 59
<210> 28
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 28
cacagtgata tgcatatggg agatggagat gatacctgcg aaaagccaat tagtgtgat 59
<210> 29
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 29
gataaagcac ttagtatcac actaattggc ttttcgcagg tatcatctcc atctcccat 59
<210> 30
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 30
attcacccca tttttgtttg gtgagttgat tggttaataa agtgctttta actaagaat 59
<210> 31
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 31
cagaaaagac taataattct tagttaaaag cactttatta accaatcaac tcaccaaac 59
<210> 32
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 32
aatctataac tacaaaaaac acatacataa actaaaaaat gtctgctgtt aacgttgca 59
<210> 33
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 33
ttaatcaatt caggtgcaac gttaacagca gacatttttt agtttatgta tgtgtttt 58
<210> 34
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 34
ctgctcacaa atcttaaagt catacattgc acgactatat atctaggaac ccatcaggt 59
<210> 35
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 35
ggtaatcttc caccaacctg atgggttcct agatatatag tcgtgcaatg tatgac 56
<210> 36
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 36
caagaatctc tctctcctaa tttctttttc tgaagccatt tattgtaata tgtgtgtttg 60
<210> 37
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 37
tcttaataat ccaaacaaac acacatatta caataaatgg cttcagaaaa agaaattag 59
<210> 38
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 38
tcaggttgtc taactccttc cttttcggtt agagcggatc tatttgcttc tcttgtaaac 60
<210> 39
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 39
actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaataga tccgctctaa ccgaaaagg 59
<210> 40
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 40
gcaaatgcct attatgcaga tgttataata tctgtgcgta gtcgagcgtc ccaaaacctt 60
<210> 41
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 41
ctgaaaacct tgcttgagaa ggttttggga cgctcgacta cgcacagata ttataacatc 60
<210> 42
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 42
gaccggatgc aatgccaatt gtaatagctt tcccattgtt ttatatttgt tgtaaaaagt 60
<210> 43
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 43
ggaagtaatt atctactttt tacaacaaat ataaaacaat gggaaagcta ttacaattg 59
<210> 44
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 44
actcattaaa aaactatatc aattaatttg aattaacttc acgctctgtg taaagtgtat 60
<210> 45
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 45
ttgggtttta ttatatatac actttacaca gagcgtgaag ttaattcaaa ttaattgata 60
<210> 46
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 46
acttcttgtt gttgacgcta acattcaacg ctagtatagt aagctactat gaaagactt 59
<210> 47
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 47
ttcgagttct ttgtaaagtc tttcatagta gcttactata ctagcgttga atgttagcg 59
<210> 48
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 48
tggatcgtta ccttgagcaa ccttcaactt ccacattttt gtttgtttat gtgtgttta 59
<210> 49
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 49
aacttagttt cgaataaaca cacataaaca aacaaaaatg tggaagttga agattggtg 59
<210> 50
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 50
taatgttctt taggtatata tttaagagcg atttgtttta gaacaaggca gctggatgt 59
<210> 51
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 51
tgttttgaat gaacaacatc cagctgcctt gttctaaaac aaatcgctct taaatatat 59
<210> 52
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 52
ctcttgcatc ttacgatacc tgagtattcc cacagttggt atactggagg cttcatgag 59
<210> 53
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 53
gcgcgaagga cataactcat gaagcctcca gtataccaac tgtgggaata ctcaggtat 59
<210> 54
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 54
aaggctaact ctcaacagac aacaacacct gcttcattta agcaaggatt ttcttaact 59
<210> 55
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 55
tgctgtcgcc gaagaagtta agaaaatcct tgcttaaatg aagcaggtgt tgttgtctg 59
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 56
aggagaactt ctagtatatt c 21
<210> 57
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 57
agaaacattt tgaagctatg gtgtgtgggg gatcactacg cacagatatt ataacatct 59
<210> 58
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 58
gcaccatggg gcatactatt gttgtcggca gtcattgttt tatatttgtt gtaaaaagt 59
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 59
tttgccaaca atcgaaacca aaca 24
<210> 60
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 60
ataaaaaaaa aaaaaagtgt caaatcaagt gtcaaatata aagcagccgc taccaaaca 59
<210> 61
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 61
actgaatctt gtctgtttgg tagcggctgc tttatatttg acacttgatt tgacacttt 59
<210> 62
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 62
attgccagga aacacgaatt taccatggac ttcataagcg caatgattga atagtcaaa 59
<210> 63
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 63
taaaaaaaaa aaatctttga ctattcaatc attgcgctta tgaagtccat ggtaaattc 59
<210> 64
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 64
aacaccaagc aactaatact ataacataca ataataaatg tcattaccgt tcttaactt 59
<210> 65
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 65
cctttcccgg tgcagaagtt aagaacggta atgacattta ttattgtatg ttatagtat 59
<210> 66
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 66
tacgcttgac atctactata tgtaagtata cggccccgtg tcgacgctgc gggtataga 59
<210> 67
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 67
gagtaaagaa ccctttctat acccgcagcg tcgacacggg gccgtatact tacatatag 59
<210> 68
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 68
taataccaca ccaacaaagt ttagttgaga gtttcatgtt tagttaatta tagttcgtt 59
<210> 69
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 69
ttagaatata cggtcaacga actataatta actaaacatg aaactctcaa ctaaacttt 59
<210> 70
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 70
aaaaaaaaaa gtggtagatt gggctacgta aattcgatta ttttttaaca tcgtaagat 59
<210> 71
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 71
tgacaaattt agaagatctt acgatgttaa aaaataatcg aatttacgta gcccaatct 59
<210> 72
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 72
aatctttgat tgacgcaaag actggtctac caaaggggcg ccacttctat aaaaggtc 58
<210> 73
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 73
cgtaacaata tcatgagacc ttttatagaa gtggcgcccc tttggtagac cagtctttg 59
<210> 74
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 74
ttcttaataa tccaaacaaa cacacatatt acaataaatg accgtttaca cagcatccg 59
<210> 75
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 75
tgacgggtgc ggtaacggat gctgtgtaaa cggtcattta ttgtaatatg tgtgtttgt 59
<210> 76
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 76
ggtaatcttc caccaacctg atgggttcct agatatatag tcgtgcaatg tatgacttt 59
<210> 77
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 77
ctgctcacaa atcttaaagt catacattgc acgactatat atctaggaac ccatcaggt 59
<210> 78
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 78
ctttccctgg ggcactgaag gctctcaact ctgacatttt ttagtttatg tatgtgttt 59
<210> 79
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 79
atctataact acaaaaaaca catacataaa ctaaaaaatg tcagagttga gagccttca 59
<210> 80
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 80
tgcttaaaaa aaatattgca aaatatcata aaagttttta tttatcaaga taagtttcc 59
<210> 81
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 81
gaaagaaaaa gatccggaaa cttatcttga taaataaaaa cttttatgat attttgcaa 59
<210> 82
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 82
cattatgcaa cgcttcggaa aatacgatgt tgaaaatata gaacccaaaa agagagact 59
<210> 83
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 83
ttatattatt tgtttagtct ctctttttgg gttctatatt ttcaacatcg tattttccg 59
<210> 84
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 84
agtggaaaat gacaggcaaa ttcatagaat gctataaaca gaagacggga gacactagc 59
<210> 85
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 85
ctggtaaagt tgtgtgctag tgtctcccgt cttctgttta tagcattcta tgaatttgc 59
<210> 86
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 86
gaagtaatta tctacttttt acaacaaata taaaacaatg actgccgaca acaatagta 59
<210> 87
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 87
gcaccatggg gcatactatt gttgtcggca gtcattgttt tatatttgtt gtaaaaagt 59
<210> 88
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 88
agaaacattt tgaagctatg gtgtgtgggg gatcactacg cacagatatt ataacatct 59
<210> 89
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 89
aaatgcctat tatgcagatg ttataatatc tgtgcgtagt gatcccccac acaccatag 59
<210> 90
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 90
tggtgacttc agttttcacc aattggtctg cagccatttt gtaattaaaa cttagatta 59
<210> 91
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 91
gaaagcatag caatctaatc taagttttaa ttacaaaatg gctgcagacc aattggtga 59
<210> 92
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 92
actttaaaat ttgtatacac ttattttttt tataacttta ggatttaatg caggtgacg 59
<210> 93
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 93
tttgaaagat gggtccgtca cctgcattaa atcctaaagt tataaaaaaa ataagtgta 59
<210> 94
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 94
gcataaaaac ttcatgaaaa ttcggcagaa aataagcgca tgccggtaga ggtgtggtc 59
<210> 95
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 95
gaggtcgctc ttattgacca cacctctacc ggcatgcgct tattttctgc cgaattttc 59
<210> 96
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 96
tggtggtgct tcctctattg tcattgaaaa gatatgacaa agacgttgtt tcatcgcgc 59
<210> 97
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 97
accttcttgg taatagcgcg atgaaacaac gtctttgtca tatcttttca atgacaata 59
<210> 98
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 98
aacttagttt cgaataaaca cacataaaca aacaaaaatg tctcagaacg tttacattg 59
<210> 99
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 99
tctggcagtc gatacaatgt aaacgttctg agacattttt gtttgtttat gtgtgttta 59
<210> 100
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 100
tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaata ctagcgttga atgttagcg 59
<210> 101
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 101
acttcttgtt gttgacgcta acattcaacg ctagtattcg cgcgtttcgg tgatgacgg 59
<210> 102
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 102
ttttgtgtct taattatatg atataaaggc gcctggccga gttcaagaga aaaaaaaag 59
<210> 103
<211> 1512
<212> DNA
<213> 酵母(Saccharomyces)
<400> 103
aactgtggga atactcaggt atcgtaagat gcaagagttc gaatctctta gcaaccatta 60
tttttttcct caacataacg agaacacaca ggggcgctat cgcacagaat caaattcgat 120
gactggaaat tttttgttaa tttcagaggt cgcctgacgc atataccttt ttcaactgaa 180
aaattgggag aaaaaggaaa ggtgagaggc cggaaccggc ttttcatata gaatagagaa 240
gcgttcatga ctaaatgctt gcatcacaat acttgaagtt gacaatatta tttaaggacc 300
tattgttttt tccaataggt ggttagcaat cgtcttactt tctaactttt cttacctttt 360
acatttcagc aatatatata tatatttcaa ggatatacca ttctaatgtc tgcccctatg 420
tctgccccta agaagatcgt cgttttgcca ggtgaccacg ttggtcaaga aatcacagcc 480
gaagccatta aggttcttaa agctatttct gatgttcgtt ccaatgtcaa gttcgatttc 540
gaaaatcatt taattggtgg tgctgctatc gatgctacag gtgtcccact tccagatgag 600
gcgctggaag cctccaagaa ggttgatgcc gttttgttag gtgctgtggc tggtcctaaa 660
tggggtaccg gtagtgttag acctgaacaa ggtttactaa aaatccgtaa agaacttcaa 720
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atttactttg gtaagagaaa ggaagacgat ggtgatggtg tcgcttggga tagtgaacaa 900
tacaccgttc cagaagtgca aagaatcaca agaatggccg ctttcatggc cctacaacat 960
gagccaccat tgcctatttg gtccttggat aaagctaatc ttttggcctc ttcaagatta 1020
tggagaaaaa ctgtggagga aaccatcaag aacgaattcc ctacattgaa ggttcaacat 1080
caattgattg attctgccgc catgatccta gttaagaacc caacccacct aaatggtatt 1140
ataatcacca gcaacatgtt tggtgatatc atctccgatg aagcctccgt tatcccaggt 1200
tccttgggtt tgttgccatc tgcgtccttg gcctctttgc cagacaagaa caccgcattt 1260
ggtttgtacg aaccatgcca cggttctgct ccagatttgc caaagaataa ggttgaccct 1320
atcgccacta tcttgtctgc tgcaatgatg ttgaaattgt cattgaactt gcctgaagaa 1380
ggtaaggcca ttgaagatgc agttaaaaag gttttggatg caggtatcag aactggtgat 1440
ttaggtggtt ccaacagtac caccgaagtc ggtgatgctg tcgccgaaga agttaagaaa 1500
atccttgctt aa 1512
<210> 104
<211> 1360
<212> DNA
<213> 酵母(Saccharomyces)
<400> 104
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
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accataaatt cccgttttaa gagcttggtg agcgctagga gtcactgcca ggtatcgttt 240
gaacacggca ttagtcaggg aagtcataac acagtccttt cccgcaattt tctttttcta 300
ttactcttgg cctcctctag tacactctat atttttttat gcctcggtaa tgattttcat 360
tttttttttt cccctagcgg atgactcttt ttttttctta gcgattggca ttatcacata 420
atgaattata cattatataa agtaatgtga tttcttcgaa gaatatacta aaaaatgagc 480
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actgaagatg acaaggtaat gcatcattct atacgtgtca ttctgaacga ggcgcgcttt 1320
ccttttttct ttttgctttt tctttttttt tctcttgaac 1360

Claims (10)

1.酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将来源于酿酒酵母BY4742的甲羟戊酸途径的相关基因ERG20、ERG9、tHMG1和来源于植物中华雪胆中编码葫芦二烯醇合酶基因synHcOSC6以及细胞色素P450还原酶基因synHcCPR1，分别构建形成基因表达盒成为生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块；
S2、运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母BY4742中的δDNA位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因LEU2，形成含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母工程菌Cuol01；
其中，所述酿酒酵母工程菌Cuol01提供的基因表达盒的构建方法，是利用组成型启动子HXT7p、TEF2 p、TPI1p、GPM1p、PGK1p、TDH3p和终止子ADH1t、TDH2t、ENO2t、CYC1t、FBA1t、PGT1t控制tHMG1、HcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9和HcOSC6基因的表达，即生产葫芦二烯醇途径的下游模块。
2.如权利要求1所述的酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌Cuol01提供的基因表达盒的构建方法中的筛选标记基因为LEU2，序列为SEQ IDNo.103。
3.一种由权利要求1～2任一所述的构建方法构建得到的酿酒酵母重组菌Cuol01。
4.酿酒酵母重组菌Cuol02的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将来源于酿酒酵母BY4742的甲羟戊酸途径上游模块的相关基因ERG12、ERG13、ERG8、ERG19、ERG10、IDI、tHMG1分别构建形成基因表达盒，然后运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母工程菌Cuol01中的YPRCδ15DNA位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因HIS3，形成强化了酿酒酵母类异戊二烯合成途径代谢通量，同时含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母重组菌Cuol02；
其中，所述酿酒酵母工程菌Cuol02提供的基因表达盒的构建方法，是利用组成型启动子ENO2p、TEF2p、GPM1p、TPI1p、PGK3p、TEF1p、TDH3p和终止子CPS1t、IDP1t、HIS5t、PRM5t、PRM9t、ADH1t、SPG5t控制ERG12、ERG13、ERG19、ERG8、IDI、tHMG1和ERG10基因的表达，即强化甲羟戊酸途径的上游模块。
5.如权利要求4所述的酿酒酵母重组菌Cuol02的构建方法，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌Cuol02提供的基因表达盒的构建方法中筛选标记基因为HIS3，序列为SEQ IDNo.104。
6.如权利要求5所述的酿酒酵母重组菌Cuol02的构建方法，其特征在于，各个基因表达盒的构建是通过两步重叠延伸PCR的方法连接，多个基因表达盒通过酵母同源重组系统重组至酵母基因组的δDNA和YPRCδ15DNA位点；所述δDNA位点为酿酒酵母染色体上多个δ基因中的1～10个随机位置；所述YPRCδ15DNA位点为酿酒酵母第16条染色体的第16条染色体的YPRCdelta15位点位置。
7.一种由权利要求4～6任一所述的构建方法构建得到的酿酒酵母重组菌Cuol02。
8.如权利要求7所述的酿酒酵母重组菌Cuol02在制备葫芦二烯醇的应用。
9.植物来源编码葫芦二烯醇合酶基因synHcOSC6、细胞色素P450还原酶基因synHcCPR1密码子优化核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
10.来源酵母编码ERG20、ERG9、ERG1、ERG12、ERG13、ERG8、ERG19、ERG10、IDI、tHMG1的核苷酸序列分别为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQID No.8、SEQ ID No.9、、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111411099A (zh) * 2020-05-14 2020-07-14 云南农业大学 雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用
CN112877230A (zh) * 2021-03-11 2021-06-01 江南大学 一种维生素d3产量提高的酵母菌
CN113234610A (zh) * 2021-03-05 2021-08-10 江南大学 一种合成角鲨烯的酿酒酵母菌株及其应用
CN114410492A (zh) * 2021-12-24 2022-04-29 河北维达康生物科技有限公司 一种以葡萄糖为底物生物合成葫芦二烯醇的工程菌、构建及其应用
CN115161208A (zh) * 2022-01-15 2022-10-11 云南农业大学 酿酒酵母基因工程菌及其生产葫芦素中间体的应用
CN116334106A (zh) * 2022-09-15 2023-06-27 云南农业大学 雪胆细胞色素氧化酶基因及其转基因工程菌在制备葫芦素中间体中的应用

Citations (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102321696A (zh) * 2011-08-26 2012-01-18 中国科学院植物研究所 一种新的三萜合成酶的功能及应用
CN102433347A (zh) * 2011-11-03 2012-05-02 中国科学院武汉植物园 羽扇豆醇c28氧化酶基因及其获得方法与应用
CN102812124A (zh) * 2009-08-26 2012-12-05 器官平衡有限责任公司 用于产生脂质的经遗传改造的生物
CN102925376A (zh) * 2012-11-13 2013-02-13 天津工业生物技术研究所 生产达玛二烯和原人参二醇的重组微生物及其构建方法
CN104017798A (zh) * 2014-06-04 2014-09-03 中国医学科学院药用植物研究所 一种罗汉果SgCS基因的突变体及其用途
WO2015121168A1 (de) * 2014-02-12 2015-08-20 Organobalance Gmbh Hefe-stamm und mikrobielles verfahren zur produktion von pentazyklischen triterpenen und/oder triterpenoiden
CN105039274A (zh) * 2015-07-13 2015-11-11 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 参与西瓜葫芦素e合成的基因簇及其应用
CN106367361A (zh) * 2016-10-08 2017-02-01 天津大学 一种酿酒酵母工程菌株及其构建方法、应用
CN106688889A (zh) * 2016-12-29 2017-05-24 广西壮族自治区药用植物园 提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法
CN107109377A (zh) * 2014-09-11 2017-08-29 以色列国家农业和农村发展农业研究组织沃尔坎尼中心 生产罗汉果苷的方法和包含其的组合物及其用途
US20180237819A1 (en) * 2011-11-23 2018-08-23 Evolva Sa Methods and Materials for Enzymatic Synthesis of Mogroside Compounds
CN109385377A (zh) * 2017-08-04 2019-02-26 中国科学院天津工业生物技术研究所 用于生产葫芦二烯醇的工程菌及其制备方法与应用
CN109609522A (zh) * 2018-11-27 2019-04-12 湖南美可达生物资源股份有限公司 博落回二氢苯并菲啶氧化酶基因优化序列及其应用
CN109797173A (zh) * 2019-03-27 2019-05-24 山东泓达生物科技有限公司 一种β-法尼烯的生产方法
CN110066785A (zh) * 2019-01-30 2019-07-30 中国医学科学院药用植物研究所 一种罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体及其构建方法和应用
CN110117624A (zh) * 2019-04-02 2019-08-13 天津大学 利用地沟油生物法制备法尼烯的方法
CN110628806A (zh) * 2019-09-23 2019-12-31 华南理工大学 一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法和应用
CN110914416A (zh) * 2017-04-27 2020-03-24 加州大学董事会 产生大麻素和大麻素衍生物的微生物和方法
CN110982720A (zh) * 2019-12-13 2020-04-10 天津大学 产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌及用途
CN111019850A (zh) * 2019-10-21 2020-04-17 武汉臻智生物科技有限公司 重组微生物及构建方法和获得α-法尼烯的方法
CN111205993A (zh) * 2020-01-22 2020-05-29 天津大学 生产熊果酸和齐墩果酸的重组酵母菌及其构建方法和应用
CN111394290A (zh) * 2020-03-26 2020-07-10 北京化工大学 产长叶烯的基因工程菌及其构建方法与应用
CN111518817A (zh) * 2020-05-14 2020-08-11 云南农业大学 雪胆三萜合成酶HcOSC6基因及其工程菌和在制备葫芦二烯醇中的应用
CN111566222A (zh) * 2017-12-05 2020-08-21 埃沃尔瓦公司 在重组宿主中产生甜菊醇糖苷
CN111690690A (zh) * 2019-03-11 2020-09-22 浙江医药股份有限公司 用于生产法尼烯的酿酒酵母
CN112041457A (zh) * 2018-02-27 2020-12-04 马努斯生物合成股份有限公司 包括罗汉果苷在内的三萜类化合物的微生物产生
CN112646834A (zh) * 2021-01-06 2021-04-13 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种羽扇豆醇衍生物及其合成方法和应用
CN112877230A (zh) * 2021-03-11 2021-06-01 江南大学 一种维生素d3产量提高的酵母菌
CN113302298A (zh) * 2018-11-09 2021-08-24 银杏生物制品公司 罗汉果甙的生物合成
JP2021158992A (ja) * 2020-03-31 2021-10-11 三菱ケミカル株式会社 微生物由来トリテルペン酸化酵素を用いたグリチルレチン酸の製造方法
CN113584110A (zh) * 2021-08-11 2021-11-02 河北维达康生物科技有限公司 一种以罗汉果醇为底物生物合成罗汉果糖苷v的工程菌株的构建及其应用
CN113755478A (zh) * 2020-06-02 2021-12-07 东北林业大学 一种改变2,3-氧化鲨烯环化酶的活性或功能的方法
CN113755354A (zh) * 2020-07-16 2021-12-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途
CN113755355A (zh) * 2021-09-30 2021-12-07 河北维达康生物科技有限公司 一种以葡萄糖为底物生物合成罗汉果醇的工程菌株、构建及其应用
CN113969288A (zh) * 2021-10-29 2022-01-25 湖北冠众通科技有限公司 一种高产法尼醇基因工程菌及其构建方法与应用
CN114058525A (zh) * 2021-10-29 2022-02-18 湖北冠众通科技有限公司 一种高产角鲨烯基因工程菌及其构建方法与应用
CN114277024A (zh) * 2020-09-27 2022-04-05 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种新型三萜合酶及其应用

Patent Citations (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102812124A (zh) * 2009-08-26 2012-12-05 器官平衡有限责任公司 用于产生脂质的经遗传改造的生物
CN102321696A (zh) * 2011-08-26 2012-01-18 中国科学院植物研究所 一种新的三萜合成酶的功能及应用
CN102433347A (zh) * 2011-11-03 2012-05-02 中国科学院武汉植物园 羽扇豆醇c28氧化酶基因及其获得方法与应用
US20180237819A1 (en) * 2011-11-23 2018-08-23 Evolva Sa Methods and Materials for Enzymatic Synthesis of Mogroside Compounds
CN102925376A (zh) * 2012-11-13 2013-02-13 天津工业生物技术研究所 生产达玛二烯和原人参二醇的重组微生物及其构建方法
WO2015121168A1 (de) * 2014-02-12 2015-08-20 Organobalance Gmbh Hefe-stamm und mikrobielles verfahren zur produktion von pentazyklischen triterpenen und/oder triterpenoiden
US20170130233A1 (en) * 2014-02-12 2017-05-11 Organobalance Gmbh Yeast strain and microbial method for production of pentacyclic triterpenes and/or triterpenoids
CN104017798A (zh) * 2014-06-04 2014-09-03 中国医学科学院药用植物研究所 一种罗汉果SgCS基因的突变体及其用途
CN107109377A (zh) * 2014-09-11 2017-08-29 以色列国家农业和农村发展农业研究组织沃尔坎尼中心 生产罗汉果苷的方法和包含其的组合物及其用途
CN105039274A (zh) * 2015-07-13 2015-11-11 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 参与西瓜葫芦素e合成的基因簇及其应用
CN106367361A (zh) * 2016-10-08 2017-02-01 天津大学 一种酿酒酵母工程菌株及其构建方法、应用
CN106688889A (zh) * 2016-12-29 2017-05-24 广西壮族自治区药用植物园 提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法
CN110914416A (zh) * 2017-04-27 2020-03-24 加州大学董事会 产生大麻素和大麻素衍生物的微生物和方法
CN109385377A (zh) * 2017-08-04 2019-02-26 中国科学院天津工业生物技术研究所 用于生产葫芦二烯醇的工程菌及其制备方法与应用
CN111566222A (zh) * 2017-12-05 2020-08-21 埃沃尔瓦公司 在重组宿主中产生甜菊醇糖苷
CN112041457A (zh) * 2018-02-27 2020-12-04 马努斯生物合成股份有限公司 包括罗汉果苷在内的三萜类化合物的微生物产生
CN113302298A (zh) * 2018-11-09 2021-08-24 银杏生物制品公司 罗汉果甙的生物合成
CN109609522A (zh) * 2018-11-27 2019-04-12 湖南美可达生物资源股份有限公司 博落回二氢苯并菲啶氧化酶基因优化序列及其应用
CN110066785A (zh) * 2019-01-30 2019-07-30 中国医学科学院药用植物研究所 一种罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体及其构建方法和应用
CN111690690A (zh) * 2019-03-11 2020-09-22 浙江医药股份有限公司 用于生产法尼烯的酿酒酵母
CN109797173A (zh) * 2019-03-27 2019-05-24 山东泓达生物科技有限公司 一种β-法尼烯的生产方法
CN110117624A (zh) * 2019-04-02 2019-08-13 天津大学 利用地沟油生物法制备法尼烯的方法
CN110628806A (zh) * 2019-09-23 2019-12-31 华南理工大学 一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法和应用
CN111019850A (zh) * 2019-10-21 2020-04-17 武汉臻智生物科技有限公司 重组微生物及构建方法和获得α-法尼烯的方法
CN110982720A (zh) * 2019-12-13 2020-04-10 天津大学 产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌及用途
CN111205993A (zh) * 2020-01-22 2020-05-29 天津大学 生产熊果酸和齐墩果酸的重组酵母菌及其构建方法和应用
CN111394290A (zh) * 2020-03-26 2020-07-10 北京化工大学 产长叶烯的基因工程菌及其构建方法与应用
JP2021158992A (ja) * 2020-03-31 2021-10-11 三菱ケミカル株式会社 微生物由来トリテルペン酸化酵素を用いたグリチルレチン酸の製造方法
CN111518817A (zh) * 2020-05-14 2020-08-11 云南农业大学 雪胆三萜合成酶HcOSC6基因及其工程菌和在制备葫芦二烯醇中的应用
CN113755478A (zh) * 2020-06-02 2021-12-07 东北林业大学 一种改变2,3-氧化鲨烯环化酶的活性或功能的方法
CN113755354A (zh) * 2020-07-16 2021-12-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途
CN114277024A (zh) * 2020-09-27 2022-04-05 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种新型三萜合酶及其应用
CN112646834A (zh) * 2021-01-06 2021-04-13 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种羽扇豆醇衍生物及其合成方法和应用
CN112877230A (zh) * 2021-03-11 2021-06-01 江南大学 一种维生素d3产量提高的酵母菌
CN113584110A (zh) * 2021-08-11 2021-11-02 河北维达康生物科技有限公司 一种以罗汉果醇为底物生物合成罗汉果糖苷v的工程菌株的构建及其应用
CN113755355A (zh) * 2021-09-30 2021-12-07 河北维达康生物科技有限公司 一种以葡萄糖为底物生物合成罗汉果醇的工程菌株、构建及其应用
CN113969288A (zh) * 2021-10-29 2022-01-25 湖北冠众通科技有限公司 一种高产法尼醇基因工程菌及其构建方法与应用
CN114058525A (zh) * 2021-10-29 2022-02-18 湖北冠众通科技有限公司 一种高产角鲨烯基因工程菌及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MUHAMMAD SAAD AHMED 等: "Design and construction of short synthetic terminators for β-amyrin production in Saccharomyces cerevisiae", 《BIOCHEMICAL ENGINEERING JOURNAL》 *
NCBI: "NADPH:cytochrome P450 reductase, partial [Siraitia grosvenorii]", 《GENBANK DATABASE》 *
孙丽超等: "萜类化合物的合成生物学研究进展", 《生物技术通报》 *
张艳 等: "酿酒酵母细胞表达异源萜类化合物的研究进展", 《化工进展》 *
李佳秀 等: "萜类化合物在酿酒酵母中的合成生物学研究进展", 《生物技术通报》 *
林庭庭 等: "创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产羽扇豆醇", 《中国中药杂志》 *
王玉霞等: "紫杉醇在酵母中的组合生物合成", 《药物生物技术》 *
罗祖良 等: "葫芦二烯醇及其生物合成的研究进展", 《药物生物技术》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111411099A (zh) * 2020-05-14 2020-07-14 云南农业大学 雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用
CN111411099B (zh) * 2020-05-14 2022-09-27 云南农业大学 雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用
CN113234610A (zh) * 2021-03-05 2021-08-10 江南大学 一种合成角鲨烯的酿酒酵母菌株及其应用
CN112877230A (zh) * 2021-03-11 2021-06-01 江南大学 一种维生素d3产量提高的酵母菌
CN114410492A (zh) * 2021-12-24 2022-04-29 河北维达康生物科技有限公司 一种以葡萄糖为底物生物合成葫芦二烯醇的工程菌、构建及其应用
CN115161208A (zh) * 2022-01-15 2022-10-11 云南农业大学 酿酒酵母基因工程菌及其生产葫芦素中间体的应用
CN115161208B (zh) * 2022-01-15 2024-03-12 云南农业大学 酿酒酵母基因工程菌及其生产葫芦素中间体的应用
CN116334106A (zh) * 2022-09-15 2023-06-27 云南农业大学 雪胆细胞色素氧化酶基因及其转基因工程菌在制备葫芦素中间体中的应用

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