CN110066785A - 一种罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体及其构建方法和应用，该突变体可在酵母宿主或植物宿主中将产物葫芦二烯醇的产量提高33.5％，满足了在工业化生产中的应用。

Description

一种罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，尤其涉及一种罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体及其构建方法和应用。
背景技术
罗汉果甜苷,是一种葫芦烷型三萜皂苷,不仅是传统中药罗汉果的主要活性成分,还是非糖类纯天然甜味剂。药理学研究表明罗汉果甜苷具有镇咳祛痰、润肺保肝,抗炎、抗癌、降血糖等作用,已成为为数不多的从中药中发掘出来的具有治疗功能的新型甜味剂。在罗汉果甜苷的生物合成途径中,葫芦二烯醇合酶是葫芦烷型三萜骨架合成的第一个限速酶,也是此条途径唯一的环化酶,可催化底物2,3-氧化鲨烯生成葫芦二烯醇。随后葫芦二烯醇在细胞色素P450酶和和葡萄糖基转移酶的作用下,依次形成罗汉果醇和罗汉果苷。葫芦二烯醇是葫芦烷型三萜化合物罗汉果苷和葫芦素的基本母核,具有抗炎、癌细胞防治功效,与很多萜类相似,葫芦二烯醇在植物中的含量很低,因而限制了其规模化生产和广泛应用。现有技术发现，罗汉果葫芦二烯醇合酶的酶活性并不高，从而严重影响了该酶在酵母宿主进行生物合成的效率，阻碍了工业化生产中的应用。
发明内容
本发明的目的在于通过基因工程手段对野生型罗汉果葫芦二烯醇合酶进行改造，使改造后的罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体的催化活力和生物合成效率显著提高，达到工业化应用的要求。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明通过对野生型罗汉果葫芦二烯醇合酶的氨基酸序列(SEQIDNO.4)，尤其是通过50位点处的氨基酸进行点突变，将精氨酸置换为赖氨酸K，从而获得SEQ ID NO.1所示的罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体，研究证明，该突变体可在酵母宿主或植物宿主中将产物葫芦二烯醇的产量提高33.5％。
对所述罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体的其他氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体形也包括在本发明的范围内。
本发明还提供了一种编码所述罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体的基因，具有如SEQID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种包含如上所述的编码基因的重组载体。优选地，原始载体为pCEV-G4-Km质粒。
本发明还提供了一种携带所述编码基因或所述重组载体的重组表达菌株。所述重组载体转化宿主细胞获得所述重组表达菌株，作为优选，重组表达菌株为酵母菌株BY4742-SgCS-50K。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述重组表达菌株的方法，所述方法是在野生型罗汉果葫芦二烯醇合酶基因序列的基础上，将其编码的第50位精氨酸突变成赖氨酸K，得到突变基因型，将突变基因型连到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到宿主菌中即得到重组菌株。所述方法具体包括以下步骤:
(1)以含有SEQIDNO.3所示核酸序列的质粒为模板，以50K-F和50K-R所示的核酸序列为引物，进行PCR扩增，即得到大量含有编码的50位精氨酸突变成赖氨酸K的突变体基因序列的重组质粒；特别地，所述SEQIDNO.3所示核酸序列即为罗汉果葫芦二烯醇合酶野生型基因；优选地，所述质粒为pCEV-G4-Km质粒；
(2)将上一步得到的重组质粒，转化到E.coli DH5α感受态细胞中；
(3)提取E.coli DH5α感受态细胞中的重组质粒，转入到表达菌株，获得重组表达菌株。
本发明的另一目的是提供所述的罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体的应用，其特征在于，通过基因工程的方法，上调真核宿主中的所述酶的活性，从而提高葫芦二烯醇的产量。优选地，所述的真核宿主为酵母宿主或植物宿主，所述的酵母优选为酵母菌株BY4742，所述的植物优选为罗汉果。
与现有技术相比，本发明具备的有益效果：
本发明提供了一种酶定向改造的方法，将野生型罗汉果葫芦二烯醇合酶的氨基酸序列的50位点处的氨基酸进行点突变，将精氨酸置换为赖氨酸K，从而获得一种罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体，研究证明，该突变体可在酵母宿主或植物宿主中将产物葫芦二烯醇的产量提高33.5％，满足了在工业化生产中的应用。
附图说明
图1为突变位点处测序峰图。
图2为GC-MS检测结果(a，对照品MS图谱分析；b，对照品GC-MS图谱；c，重组菌株GC-MS图谱)。
具体实施方式
以下结合附图对本申请作进一步详细说明，但不作为对本申请的限定。
1.点突变引物的设计
本研究选择了第50位氨基酸作为突变位点，得到得编码氨基酸序列结构如SEQ IDNO.1所示，并设计了如下PCR引物：
表1.突变体引物设计
注：加下划线为突变位点。
2.PCR扩增
以含有优化了密码子的SgCS的pCEV-G4-Km质粒为模板，用设计的点突变引物50K-F、50K-R进行PCR扩增，反应体系如下：
表2 PCR反应体系
PCR反应条件：94℃预变性2min；98℃变性10s，57℃退火30s，68℃延伸1min，30个循环；68℃延伸7min。
反应后取5μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
3.扩增产物转化DH5α感受态细胞与测序
使用连接好的重组质粒E.coli DH5α感受态细胞进行转化。
(1)将E.coli DH5a感受态细胞预先置于冰浴中，分装50μL感受态细胞液至无菌预冷的1.5mL离心管中，加入上述重组质粒10μL，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰浴中静置30min。
(2)将离心管置于42℃水浴中60s，然后快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却2-3min，该过程不要晃动离心管。
(3)向管中加入250μL无菌无抗生素的LB培养基，混匀后，于37℃，150rpm条件下复苏45min。
(4)吸取100μL离心管中已转化的细胞液，用涂布器均匀涂布于含有氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，倒置，37℃培养16h。
(5)用白色枪头挑取阳性克隆，至装有1mL含有氨苄青霉素的液体LB培养基的小管中，37℃，220rpm，温育16h，获得含有重组质粒的大肠杆菌菌液。
(6)以菌液为模板，引物釆用通用引物M13+、M13-进行PCR扩增，反应体系和反应条件如本节“2”，筛选出具有阳性结果的菌液，进行测序。其测序结果拼接后序列如SEQ IDNO.2所示。
4.质粒转化酵母感受态细胞BY4742
(1)提取E.coli DH5a感受态细胞中的质粒。
(2)将提取质粒转化入酵母感受态细胞BY4742中。
(3)取适量转化后的细胞涂布到相应的YPD(G418，200μg/mL)固体平板。30℃培养箱培养2-3天至单菌落出现。获得转化子，提取相应转化子的基因组，进行PCR验证。
(4)获得重组酵母菌株BY4742-SgCS-50K
5.重组菌株发酵培养
在YPD(G418，200μg/mL)固体筛选培养平板中活化重组菌株BY4742-SgCS-50K；于相应的液体筛选培养基中制备种子液(培养条件30℃,200rpm)，调OD600值～0.5，移取100μL接种于含100mL YPD(G418，200ug/mL)液体培养基的250mL三角瓶中，200rpm，30℃摇床培养72h。
6.代谢产物提取
重组菌株摇瓶培养72h后停止，取培养液50mL，5000rpm离心5min，弃上清液收集菌体，干燥称重；加入2mL裂解液(20％KOH-50％乙醇，1:1)，将菌体重悬后，置于95℃水浴60min，期间每隔10min震荡混匀；待溶液冷却后，加入2mL正己烷，震荡混匀，5000rpm离心5min，吸取正己烷萃取液置于新的离心管中，重复萃取一次；浓缩正己烷萃取液；最后定容于1mL的正己烷中，加无水硫酸钠除水后离心，上清液置于进样小瓶备用。
7.产物GC-MS(气相色谱-质谱)分析
进样口温度280℃，进样体积1uL，不分流，溶剂延时13min；色谱柱：HP-5MS(0.25*30m，0.5um)；升温程序：70℃，2min，20℃/min到260℃，10℃/min到300℃，保留10min；MS条件：EI源，m/z 50-800；用葫芦二烯醇对照品进行定性、定量分析。其检测结果如图2所示，结果分析如下：1)当前色谱条件下，代谢产物色谱峰分离良好，与质谱联用可对目标代谢产物准确定性、定量分析。2)SgCS野生型基因表达葫芦二烯醇的产量为0.365±0.028mg/g，SgCS-50K突变型获得产物的量为0.487±0.025mg/g，较野生型产量提高了33.5％。
在一种具体实施方式中，将SgCS第50位氨基酸的序列通过定点突变替换为赖氨酸K后，导入酵母表达菌株BY4742，YPD培养基发酵培养后，产物葫芦二烯醇的产量可增加33.5％。
另外一种具体实施方式中，将SgCS第50位氨基酸的序列通过定点突变替换为赖氨酸K后，利用基因编辑技术导入罗汉果遗传转化体系，炼苗移栽后，植物体内葫芦二烯醇的产量可增加33.5％。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变形。
序列表
<110> 中国医学科学院药用植物研究所
<120> 一种罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体及其构建方法和应用
<130> 1
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 759
<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 1
Met Trp Arg Leu Lys Val Gly Ala Glu Ser Val Gly Glu Asn Asp Glu
1 5 10 15
Lys Trp Leu Lys Ser Ile Ser Asn His Leu Gly Arg Gln Val Trp Glu
20 25 30
Phe Cys Pro Asp Ala Gly Thr Gln Gln Gln Leu Leu Gln Val His Lys
35 40 45
Ala Lys Lys Ala Phe His Asp Asp Arg Phe His Arg Lys Gln Ser Ser
50 55 60
Asp Leu Phe Ile Thr Ile Gln Tyr Gly Lys Glu Val Glu Asn Gly Gly
65 70 75 80
Lys Thr Ala Gly Val Lys Leu Lys Glu Gly Glu Glu Val Arg Lys Glu
85 90 95
Ala Val Glu Ser Ser Leu Glu Arg Ala Leu Ser Phe Tyr Ser Ser Ile
100 105 110
Gln Thr Ser Asp Gly Asn Trp Ala Ser Asp Leu Gly Gly Pro Met Phe
115 120 125
Leu Leu Pro Gly Leu Val Ile Ala Leu Tyr Val Thr Gly Val Leu Asn
130 135 140
Ser Val Leu Ser Lys His His Arg Gln Glu Met Cys Arg Tyr Val Tyr
145 150 155 160
Asn His Gln Asn Glu Asp Gly Gly Trp Gly Leu His Ile Glu Gly Pro
165 170 175
Ser Thr Met Phe Gly Ser Ala Leu Asn Tyr Val Ala Leu Arg Leu Leu
180 185 190
Gly Glu Asp Ala Asn Ala Gly Ala Met Pro Lys Ala Arg Ala Trp Ile
195 200 205
Leu Asp His Gly Gly Ala Thr Gly Ile Thr Ser Trp Gly Lys Leu Trp
210 215 220
Leu Ser Val Leu Gly Val Tyr Glu Trp Ser Gly Asn Asn Pro Leu Pro
225 230 235 240
Pro Glu Phe Trp Leu Phe Pro Tyr Phe Leu Pro Phe His Pro Gly Arg
245 250 255
Met Trp Cys His Cys Arg Met Val Tyr Leu Pro Met Ser Tyr Leu Tyr
260 265 270
Gly Lys Arg Phe Val Gly Pro Ile Thr Pro Ile Val Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Lys Glu Leu Tyr Ala Val Pro Tyr His Glu Ile Asp Trp Asn Lys Ser
290 295 300
Arg Asn Thr Cys Ala Lys Glu Asp Leu Tyr Tyr Pro His Pro Lys Met
305 310 315 320
Gln Asp Ile Leu Trp Gly Ser Leu His His Val Tyr Glu Pro Leu Phe
325 330 335
Thr Arg Trp Pro Ala Lys Arg Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gln Thr Ala
340 345 350
Met Gln His Ile His Tyr Glu Asp Glu Asn Thr Arg Tyr Ile Cys Leu
355 360 365
Gly Pro Val Asn Lys Val Leu Asn Leu Leu Cys Cys Trp Val Glu Asp
370 375 380
Pro Tyr Ser Asp Ala Phe Lys Leu His Leu Gln Arg Val His Asp Tyr
385 390 395 400
Leu Trp Val Ala Glu Asp Gly Met Lys Met Gln Gly Tyr Asn Gly Ser
405 410 415
Gln Leu Trp Asp Thr Ala Phe Ser Ile Gln Ala Ile Val Ser Thr Lys
420 425 430
Leu Val Asp Asn Tyr Gly Pro Thr Leu Arg Lys Ala His Asp Phe Val
435 440 445
Lys Ser Ser Gln Ile Gln Gln Asp Cys Pro Gly Asp Pro Asn Val Trp
450 455 460
Tyr Arg His Ile His Lys Gly Ala Trp Pro Phe Ser Thr Arg Asp His
465 470 475 480
Gly Trp Leu Ile Ser Asp Cys Thr Ala Glu Gly Leu Lys Ala Ala Leu
485 490 495
Met Leu Ser Lys Leu Pro Ser Glu Thr Val Gly Glu Ser Leu Glu Arg
500 505 510
Asn Arg Leu Cys Asp Ala Val Asn Val Leu Leu Ser Leu Gln Asn Asp
515 520 525
Asn Gly Gly Phe Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Arg Ser Tyr Pro Trp Leu
530 535 540
Glu Leu Ile Asn Pro Ala Glu Thr Phe Gly Asp Ile Val Ile Asp Tyr
545 550 555 560
Pro Tyr Val Glu Cys Thr Ser Ala Thr Met Glu Ala Leu Thr Leu Phe
565 570 575
Lys Lys Leu His Pro Gly His Arg Thr Lys Glu Ile Asp Thr Ala Ile
580 585 590
Val Arg Ala Ala Asn Phe Leu Glu Asn Met Gln Arg Thr Asp Gly Ser
595 600 605
Trp Tyr Gly Cys Trp Gly Val Cys Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Phe Gly
610 615 620
Ile Lys Gly Leu Val Ala Ala Gly Arg Thr Tyr Asn Asn Cys Leu Ala
625 630 635 640
Ile Arg Lys Ala Cys Asp Phe Leu Leu Ser Lys Glu Leu Pro Gly Gly
645 650 655
Gly Trp Gly Glu Ser Tyr Leu Ser Cys Gln Asn Lys Val Tyr Thr Asn
660 665 670
Leu Glu Gly Asn Arg Pro His Leu Val Asn Thr Ala Trp Val Leu Met
675 680 685
Ala Leu Ile Glu Ala Gly Gln Ala Glu Arg Asp Pro Thr Pro Leu His
690 695 700
Arg Ala Ala Arg Leu Leu Ile Asn Ser Gln Leu Glu Asn Gly Asp Phe
705 710 715 720
Pro Gln Gln Glu Ile Met Gly Val Phe Asn Lys Asn Cys Met Ile Thr
725 730 735
Tyr Ala Ala Tyr Arg Asn Ile Phe Pro Ile Trp Ala Leu Gly Glu Tyr
740 745 750
Cys His Arg Val Leu Thr Glu
755
<210> 2
<211> 2277
<212> DNA
<213> 人工合成()
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tcttacttat cttgccagaa taaggtttac acaaacttag agggtaacag acctcactta 2040
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<211> 2277
<212> DNA
<213> S. silomaradjae Merr.
<400> 3
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tctatctcta accacttggg tagacaagtt tgggaatttt gtccagatgc tggtactcaa 120
caacaattgt tgcaagttca taaagctaga aaagcttttc atgatgatag attccataga 180
aaacagtctt ctgatttgtt tatcactatc caatacggta aagaagttga aaacggtggt 240
aaaactgctg gtgttaaatt gaaagaaggt gaagaagtta gaaaagaagc tgttgaatct 300
tctttggaaa gagctttgtc tttttattct tctatccaaa cttctgatgg taactgggct 360
tctgatttgg gtggtccaat gtttttgttg ccaggtttgg ttattgcttt gtatgttact 420
ggtgttttga attctgtttt gtctaagcat catagacaag aaatgtgtag atatgtttat 480
aatcaccaga acgaagatgg tggttggggt ttgcatattg aaggtccatc tactatgttt 540
ggttctgctt tgaattatgt tgctttgaga ttgttgggtg aagatgctaa tgctggtgct 600
atgccaaaag ctagagcttg gattttggat catggtggtg ctactggtat tacttcttgg 660
ggtaaattgt ggttgtctgt tttgggtgtt tatgaatggt ctggtaataa tccattgcca 720
ccagaatttt ggttgtttcc atattttttg ccatttcatc caggtagaat gtggtgtcat 780
tgtagaatgg tttatttgcc aatgtcttat ttgtacggta aaagatttgt tggtccaatt 840
actccaattg ttttgtcttt gagaaaagaa ttgtatgctg ttccatatca tgaaatcgat 900
tggaataaat ctagaaacac ttgcgctaaa gaagatttgt attacccaca tccaaaaatg 960
caagatattt tgtggggttc tttgcatcat gtttatgaac cattgtttac tagatggcca 1020
gctaaaagat tgagagaaaa agctttgcaa actgctatgc aacatattca ttatgaagat 1080
gaaaatacta gatatatttg tttgggtcca gttaacaagg ttttgaattt gttatgttgt 1140
tgggttgaag atccatattc tgatgctttt aaattacatt tacaaagagt tcatgattat 1200
ttatgggttg ctgaagatgg tatgaaaatg caaggttata atggttctca attatgggat 1260
actgcttttt ctatccaagc tattgtttct actaagttag ttgacaatta cggtcctact 1320
ttaagaaagg ctcatgattt tgttaagtct tctcaaatcc aacaagattg tcctggtgat 1380
cctaatgttt ggtatagaca cattcacaag ggtgcttggc ctttttctac tagagatcac 1440
ggttggttaa tttctgactg tactgctgaa ggtttaaagg ctgctttaat gttatctaag 1500
ttaccttctg aaactgttgg tgaatcttta gaaagaaata gattatgcga cgcagttaat 1560
gttttattat ctttacagaa cgacaatggt ggtttcgcat cttatgaatt aacaagatct 1620
tacccttggt tagaattaat taatcctgca gaaacattcg gtgacattgt tattgactac 1680
ccttacgttg agtgtacatc tgcaacaatg gaggcattaa cattattcaa gaagttacac 1740
cctggtcaca gaacaaagga gatagacaca gcaatagtta gagcagcaaa tttcttagag 1800
aatatgcaaa gaacagacgg ttcttggtac ggttgttggg gtgtttgttt cacatacgca 1860
ggttggttcg gtataaaggg tttagttgca gcaggtagaa catacaataa ttgcttagca 1920
ataagaaagg catgcgactt cttattatct aaggagttac ctggtggtgg ttggggtgag 1980
tcttacttat cttgccagaa taaggtttac acaaacttag agggtaacag acctcactta 2040
gttaacacag catgggtttt aatggcatta atagaggcag gtcaggcaga gagagaccct 2100
acacctttac acagagcagc aagattatta ataaactctc agttagagaa cggtgacttc 2160
cctcagcagg agataatggg tgttttcaac aagaactgca tgataacata cgcagcatac 2220
agaaacatat tccctatctg ggcattaggt gagtactgcc acagagtttt aacagag 2277
<210> 4
<211> 759
<212> PRT
<213> S. silomaradjae Merr.
<400> 4
Met Trp Arg Leu Lys Val Gly Ala Glu Ser Val Gly Glu Asn Asp Glu
1 5 10 15
Lys Trp Leu Lys Ser Ile Ser Asn His Leu Gly Arg Gln Val Trp Glu
20 25 30
Phe Cys Pro Asp Ala Gly Thr Gln Gln Gln Leu Leu Gln Val His Lys
35 40 45
Ala Arg Lys Ala Phe His Asp Asp Arg Phe His Arg Lys Gln Ser Ser
50 55 60
Asp Leu Phe Ile Thr Ile Gln Tyr Gly Lys Glu Val Glu Asn Gly Gly
65 70 75 80
Lys Thr Ala Gly Val Lys Leu Lys Glu Gly Glu Glu Val Arg Lys Glu
85 90 95
Ala Val Glu Ser Ser Leu Glu Arg Ala Leu Ser Phe Tyr Ser Ser Ile
100 105 110
Gln Thr Ser Asp Gly Asn Trp Ala Ser Asp Leu Gly Gly Pro Met Phe
115 120 125
Leu Leu Pro Gly Leu Val Ile Ala Leu Tyr Val Thr Gly Val Leu Asn
130 135 140
Ser Val Leu Ser Lys His His Arg Gln Glu Met Cys Arg Tyr Val Tyr
145 150 155 160
Asn His Gln Asn Glu Asp Gly Gly Trp Gly Leu His Ile Glu Gly Pro
165 170 175
Ser Thr Met Phe Gly Ser Ala Leu Asn Tyr Val Ala Leu Arg Leu Leu
180 185 190
Gly Glu Asp Ala Asn Ala Gly Ala Met Pro Lys Ala Arg Ala Trp Ile
195 200 205
Leu Asp His Gly Gly Ala Thr Gly Ile Thr Ser Trp Gly Lys Leu Trp
210 215 220
Leu Ser Val Leu Gly Val Tyr Glu Trp Ser Gly Asn Asn Pro Leu Pro
225 230 235 240
Pro Glu Phe Trp Leu Phe Pro Tyr Phe Leu Pro Phe His Pro Gly Arg
245 250 255
Met Trp Cys His Cys Arg Met Val Tyr Leu Pro Met Ser Tyr Leu Tyr
260 265 270
Gly Lys Arg Phe Val Gly Pro Ile Thr Pro Ile Val Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Lys Glu Leu Tyr Ala Val Pro Tyr His Glu Ile Asp Trp Asn Lys Ser
290 295 300
Arg Asn Thr Cys Ala Lys Glu Asp Leu Tyr Tyr Pro His Pro Lys Met
305 310 315 320
Gln Asp Ile Leu Trp Gly Ser Leu His His Val Tyr Glu Pro Leu Phe
325 330 335
Thr Arg Trp Pro Ala Lys Arg Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gln Thr Ala
340 345 350
Met Gln His Ile His Tyr Glu Asp Glu Asn Thr Arg Tyr Ile Cys Leu
355 360 365
Gly Pro Val Asn Lys Val Leu Asn Leu Leu Cys Cys Trp Val Glu Asp
370 375 380
Pro Tyr Ser Asp Ala Phe Lys Leu His Leu Gln Arg Val His Asp Tyr
385 390 395 400
Leu Trp Val Ala Glu Asp Gly Met Lys Met Gln Gly Tyr Asn Gly Ser
405 410 415
Gln Leu Trp Asp Thr Ala Phe Ser Ile Gln Ala Ile Val Ser Thr Lys
420 425 430
Leu Val Asp Asn Tyr Gly Pro Thr Leu Arg Lys Ala His Asp Phe Val
435 440 445
Lys Ser Ser Gln Ile Gln Gln Asp Cys Pro Gly Asp Pro Asn Val Trp
450 455 460
Tyr Arg His Ile His Lys Gly Ala Trp Pro Phe Ser Thr Arg Asp His
465 470 475 480
Gly Trp Leu Ile Ser Asp Cys Thr Ala Glu Gly Leu Lys Ala Ala Leu
485 490 495
Met Leu Ser Lys Leu Pro Ser Glu Thr Val Gly Glu Ser Leu Glu Arg
500 505 510
Asn Arg Leu Cys Asp Ala Val Asn Val Leu Leu Ser Leu Gln Asn Asp
515 520 525
Asn Gly Gly Phe Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Arg Ser Tyr Pro Trp Leu
530 535 540
Glu Leu Ile Asn Pro Ala Glu Thr Phe Gly Asp Ile Val Ile Asp Tyr
545 550 555 560
Pro Tyr Val Glu Cys Thr Ser Ala Thr Met Glu Ala Leu Thr Leu Phe
565 570 575
Lys Lys Leu His Pro Gly His Arg Thr Lys Glu Ile Asp Thr Ala Ile
580 585 590
Val Arg Ala Ala Asn Phe Leu Glu Asn Met Gln Arg Thr Asp Gly Ser
595 600 605
Trp Tyr Gly Cys Trp Gly Val Cys Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Phe Gly
610 615 620
Ile Lys Gly Leu Val Ala Ala Gly Arg Thr Tyr Asn Asn Cys Leu Ala
625 630 635 640
Ile Arg Lys Ala Cys Asp Phe Leu Leu Ser Lys Glu Leu Pro Gly Gly
645 650 655
Gly Trp Gly Glu Ser Tyr Leu Ser Cys Gln Asn Lys Val Tyr Thr Asn
660 665 670
Leu Glu Gly Asn Arg Pro His Leu Val Asn Thr Ala Trp Val Leu Met
675 680 685
Ala Leu Ile Glu Ala Gly Gln Ala Glu Arg Asp Pro Thr Pro Leu His
690 695 700
Arg Ala Ala Arg Leu Leu Ile Asn Ser Gln Leu Glu Asn Gly Asp Phe
705 710 715 720
Pro Gln Gln Glu Ile Met Gly Val Phe Asn Lys Asn Cys Met Ile Thr
725 730 735
Tyr Ala Ala Tyr Arg Asn Ile Phe Pro Ile Trp Ala Leu Gly Glu Tyr
740 745 750
Cys His Arg Val Leu Thr Glu
755

Claims (10)

1.一种罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述的罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体的基因，具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3.一种包含如权利要求2所述的编码基因的重组载体。
4.携带权利要求2所述基因或权利要求3所述重组载体的重组表达菌株。
5.一种制备权利要求4所述重组表达菌株的方法，其特征在于，是在野生型罗汉果葫芦二烯醇合酶基因序列的基础上，将其编码的第50位精氨酸突变成赖氨酸K，得到突变基因，将突变基因连到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到宿主菌中即得到重组菌株。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法具体是:(1)以含有SEQIDNO.3所示核酸序列的质粒为模板，以50K-F和50K-R所示的核酸序列为引物，进行PCR扩增，即得到大量含有编码的50位精氨酸突变成赖氨酸K的突变体基因序列的重组质粒；(2)将上一步得到的重组质粒，转化到E.coli DH5α感受态细胞中；(3)提取E.coli DH5α感受态细胞中的重组质粒，转入到表达菌株，获得重组表达菌株。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述质粒为pCEV-G4-Km质粒。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述重组表达菌株为重组酵母菌株BY4742-SgCS-50K。
9.如权利要求1所述的罗汉果葫芦二烯醇合酶突变体的应用，其特征在于，通过基因工程的方法，上调真核宿主中的所述酶的活性，从而提高葫芦二烯醇的产量。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的真核宿主为酵母宿主或植物宿主，所述的酵母优选为酵母菌株BY4742，所述的植物优选为罗汉果。
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