CN115820712A - 一种利用酿酒酵母工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法 - Google Patents

一种利用酿酒酵母工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法 Download PDF

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CN115820712A CN202211449654.3A CN202211449654A CN115820712A CN 115820712 A CN115820712 A CN 115820712A CN 202211449654 A CN202211449654 A CN 202211449654A CN 115820712 A CN115820712 A CN 115820712A
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徐子淇
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Abstract

本发明提供了一种利用酿酒酵母工程菌制备10‑羟基‑2‑癸烯酸的方法，属于生物发酵技术领域，主要为构建含有重组质粒pESC‑URA‑CYP539A7*‑F0CPR*、pESC‑URA‑CYP539A7*‑F0CPR*‑sil1p、pESC‑URA‑CYP539A7*‑F0CPR*‑crp5p或pJEF3‑CYP539A7*‑F0CPR*的酵母工程菌；所述CYP539A7*‑F0CPR*融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；利用酵母工程菌能够发酵生产10‑HDA。

Description

一种利用酿酒酵母工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法
技术领域
本发明涉及一种利用酿酒酵母工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，属于生物发酵技术领域。
背景技术
10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)是一种既含有羟基，又含有羧基，还在α和β碳上有一个不饱和双键的特殊中链脂肪酸。10-HDA具有抗菌、抗氧化、抗炎、免疫调节和抗肿瘤等独特的性能，具有较高经济价值。在自然界中，这种化学物质只存在于蜂王浆中，是一种独特的、高效的生物活性物质。
目前市面上10-HDA的生产方法多采用化学合成法，包括Wittig试剂合成、臭氧化、溴化消除、Knoevenagel缩合、生长碳链合成等。然而化学合成方法容易产生环境污染和反应，且难以控制。因此市面上且尚无法大规模生产10-HDA，价格昂贵。研究者们致力于研究一种可大规模生产，不受资源限制的生产方法。生物催化合成法具有高度选择性、环境友好、生产周期短、不受资源限制、可大规模生产等优点，引起了人们的极大兴趣。
目前对于生物途径合成10-HDA的报道甚微，仅有在大肠杆菌中通过两步法催化癸酸合成10-HDA。但是由于大肠杆菌安全性低，目前尚未有在酿酒酵母中合成10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用酿酒酵母工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法。
本发明的技术方案如下：
CYP539A7*-F0CPR*融合基因在生产10-羟基-2-癸烯酸中的应用，所述CYP539A7*-F0CPR*融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
根据本发明优选的，CYP539A7*-F0CPR*融合基因在酵母菌发酵生产10-羟基-2-癸烯酸中的应用。
一种生产10-羟基-2-癸烯酸的酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：
构建含有重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p或pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*的酵母工程菌；所述CYP539A7*-F0CPR*融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
根据本发明优选的，所述构建方法中，酵母工程菌使用的宿主酵母菌为酿酒酵母菌株BY4741。
根据本发明优选的，所述构建含有重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p或pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*的酵母工程菌，步骤如下：
(i)将基因CYP539A7密码子优化，得到优化后质粒pET28a-CYP539A7*，以质粒pET28a-CYP539A7*为模板PCR扩增基因CYP539A7*，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
将基因F0CPR密码子优化，得到优化后质粒pET28a-F0CPR*，以质粒pET28a-F0CPR*为模板PCR扩增基因F0CPR*，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
以酿酒酵母基因组为模板PCR扩增辅助基因sil1p，上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
以酿酒酵母基因组为模板PCR扩增辅助基因crp5p，上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
以重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*为模板PCR扩增融合基因CYP539A7*-F0CPR*，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；
然后将质粒pESC-URA用BamH I和Xho I进行双酶切；重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*用EcoR I和Cla I进行双酶切；质粒pJEF3-URA用BamH I和Pst I进行双酶切；
所述步骤(i)中CYP539A7*基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，F0CPR*的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，辅助基因sil1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，辅助基因crp5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，CYP539A7*-F0CPR*融合基因的核苷酸序列如SEQID NO.15所示；
(ii)将步骤(i)扩增的CYP539A7*、F0CPR*基因片段和酶切后的载体pESC-URA进行无缝克隆，得到重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*；
将步骤(i)扩增的sil1p、crp5p基因片段和酶切后的载体pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*分别进行无缝克隆，得到重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p；
将步骤(i)扩增的CYP539A7*-F0CPR*融合基因片段和酶切后的载体pJEF3-URA进行无缝克隆，得到重组质粒pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*；
(iii)将步骤(ii)的重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p、pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*分别转入宿主酵母菌，筛选阳性酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p、酵母工程菌/pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*。
进一步优选的，步骤(i)中PCR扩增体系为：100μM上游引物2.0μL，100μM下游引物2.0μL，模板2.0μL，5U/μL phanta酶25μL，ddH2O 19μL，共50μL。
进一步优选的，步骤(i)中PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃分别延伸1min30s、2min、1min、40s、3min40s，循环30次；72℃延伸5min。
进一步优选的，步骤(iii)中筛选阳性菌株的方法为：采用菌落PCR鉴定和蛋白表达鉴定。
一种利用酵母工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，步骤如下：
将含有CYP539A7*-F0CPR*融合基因的酵母工程菌，利用含有反式-2-癸烯酸的培养基发酵产10-羟基-2-癸烯酸。
根据本发明优选的，所述方法中，含有CYP539A7*-F0CPR*融合基因的酵母工程菌为上述方法构建的酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p。
进一步优选的，所方法中，酵母工程菌利用含有反式-2-癸烯酸的培养基发酵产10-羟基-2-癸烯酸，步骤如下：
(1)将酵母工程菌接入pH5.0-6.0尿嘧啶缺陷型种子培养基中，在25-35℃振荡过夜培养，种子液以初始OD600为0.3-0.5，接入尿嘧啶缺陷型发酵培养基，在25-35℃振荡诱导培养到OD600为1.0-1.2的菌液后收集菌体；
(2)将步骤(1)收集的菌体经步骤(1)中尿嘧啶缺陷型发酵培养基重悬，然后向培养基中加入反式-2-癸烯酸，培养，制得10-羟基-2-癸烯酸。
根据本发明优选的，所述方法中，含有CYP539A7*-F0CPR*融合基因的酵母工程菌为上述方法构建的酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p。
进一步优选的，所方法中，酵母工程菌利用含有反式-2-癸烯酸的培养基发酵产10-羟基-2-癸烯酸，步骤如下：
①将酵母工程菌接入pH5.0-6.0尿嘧啶缺陷型种子培养基中，在25-35℃振荡过夜培养，种子液以初始OD600为0.3-0.5，接入尿嘧啶缺陷型种子培养基，在25-35℃振荡诱导培养到OD600为1.0-1.2的菌液后收集菌体；
②将步骤①收集的菌体经步骤①中尿嘧啶缺陷型种子培养基重悬，然后向培养基中加入反式-2-癸烯酸，培养，制得10-羟基-2-癸烯酸。
更优选的，步骤(1)或步骤①中，尿嘧啶缺陷型种子培养基成分组成为基础培养基YNB、质量浓度为1.5％-2.5％葡萄糖、尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物1.0-1.5g/L。
更优选的，步骤(1)中，尿嘧啶缺陷型发酵培养基成分组成为基础培养基YNB、质量浓度为3.5％-4.5％半乳糖、2mM 5-ALA和尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物1.0-1.5g/L。
更优选的，步骤(1)或步骤①中，收集菌体的方式为将菌液在3500-4000rpm条件下离心10-15min，收集沉淀。
更优选的，步骤(2)或步骤②中，培养条件为在25～35℃条件下培养48-72小时。
更优选的，步骤(2)或步骤②中，加入反式-2-癸烯酸在培养基中的浓度为0.5～1.0g/L。
有益效果
1、本发明首次构建CYP539A7*-F0CPR*融合基因与酵母菌重组，用于底物反式-2-癸烯酸的催化生产10-HDA。
2、本发明构建CYP539A7*-F0CPR*融合基因与酿酒酵母中辅助蛋白基因sil1p和crp5p共表达质粒，能够有效提高酵母工程菌中10-HDA的产量。
附图说明
图1为PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
图中，泳道M为Marker；泳道1-2为CYP539A7*的PCR扩增产物样品；泳道3-4为F0CPR*的PCR扩增产物样品；泳道5-6为辅助蛋白基因sil1p的PCR扩增产物样品；泳道7-8为辅助蛋白基因crp5p的PCR扩增产物样品；泳道9-10为CYP539A7*-F0CPR*的PCR扩增产物样品。
图2为重组质粒构建示意图；
图中：(a)pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*质粒构建图、(b)pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p质粒构建图、(c)pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p质粒构建图、(d)pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*质粒构建图。
图3为菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图中，泳道M为Marker；泳道1-2为挑取大肠杆菌DH5α/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*菌株的不同的单菌落PCR扩增产物样品；泳道3-4为挑取大肠杆菌DH5α/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p菌株的不同的单菌落PCR扩增产物样品；泳道5-6为挑取大肠杆菌DH5α/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p菌株的不同的单菌落PCR扩增产物样品；泳道7-8为挑取大肠杆菌DH5α/pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*菌株的不同的单菌落PCR扩增产物样品。
图4为不同工程菌株下反应24h的10-HDA产量图；
由左往右依次是酿酒酵母工程菌BY4741/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*菌株的反式-2-癸烯酸和10-HDA的含量；酿酒酵母工程菌BY4741/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p菌株的反式-2-癸烯酸和10-HDA的含量；酿酒酵母工程菌BY4741/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p菌株的反式-2-癸烯酸和10-HDA的含量；酿酒酵母工程菌BY4741/pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*菌株的反式-2-癸烯酸和10-HDA的含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的内容作进一步阐述，但本发明保护内容并不仅局限于此。实施例中未作详细说明的操作方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。
本发明中所用的试剂及药品均为普通市售产品。
主要材料的来源：
基础培养基YNB：市售产品，购自酷莱博生物科技有限公司；
尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物：市售产品，购自酷莱博生物科技有限公司；
葡萄糖：市售产品，购自上海麦克林生化科技有限公司；
半乳糖：市售产品，购自上海麦克林生化科技有限公司；
5-ALA：市售产品，购自上海麦克林生化科技有限公司；
酿酒酵母菌株BY4741：市售产品，购自上海昂羽生物技术有限公司。
培养基组成如下：
SD-URA尿嘧啶缺陷型种子培养基成分组成为:基础培养基YNB 6.7g/L、尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物1.29g/L、质量浓度为2％葡萄糖；
SD-URA尿嘧啶缺陷型发酵培养基成分组成为:基础培养基YNB 6.7g/L、尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物1.29g/L、质量浓度为4％半乳糖、2mM 5-ALA。
实施例1
基因CYP539A7*、F0CPR*、sil1p、crp5p、CYP539A7*-F0CPR*的PCR扩增
将基因CYP539A7密码子优化，以优化后质粒pET28a-CYP539A7*为模板进行PCR扩增，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
将基因F0CPR密码子优化，以优化后质粒pET28a-F0CPR*为模板进行PCR扩增，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板进行扩增辅助基因sil1p，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板扩增辅助基因crp5p，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
以重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*为模板进行扩增融合基因CYP539A7*-F0CPR*，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；
其中，CYP539A7*基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，F0CPR*的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，辅助基因sil1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，辅助基因crp5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，CYP539A7*-F0CPR*融合基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示。
使用上述引物进行PCR扩增，反应体系如下：
Figure BDA0003951068220000061
PCR反应条件如下：
Figure BDA0003951068220000062
PCR扩增结束后通过1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，结果如图1所示，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工生物工程股份有限公司的DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。
实施例2
重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p、pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*的构建，示意图见图2。
pESC-URA、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、pJEF3-URA质粒载体的双酶切反应，反应体系如下：
质粒载体双酶切后经1％琼脂糖凝胶电泳纯化，并使用DNA胶回收试剂盒进行目的片段回收。
将实施例1中的PCR扩增的片段与实施例2中的酶切后载体通过无缝克隆进行连接，连接反应体系如下：
Figure BDA0003951068220000071
将上述连接反应体系充分混匀后离心3-5秒，将管壁液滴收到管底，50℃30min，得重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p、pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*。
实施例3
重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p、pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*的扩增，包括如下步骤：
(1)DH5α感受态细胞的制备
①挑取大肠杆菌DH5α单菌落(或挑取保存菌种)接种至10ml液体LB培养基，37℃、200rpm过夜培养；
②取5ml菌液接种于500ml LB培养基中，37℃、210rpm培养至菌液OD600为0.375左右；
③将菌液放置于冰水混合物上10min，同时预冷50ml离心管；
④将菌液转移到离心管中，4℃，3700rpm离心10min收集菌体；
⑤每个离心管中加入10mL预冷的0.1M CaCl2溶液，重悬菌体，再加入30mL预冷的0.1M CaCl2溶液，颠倒混匀，冰上静置20min；
⑥4℃，3700rpm离心10min收集菌体，按照与步骤④中菌液的体积比为3：125的比例加入预冷的含有15％甘油的0.1M的CaCl2溶液，重悬菌体，得感受态细胞；
⑦将感受态细胞分装，并于-80℃冻存。
(2)重组质粒的转化
①将重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p、重组质粒pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*分别取10μL加到四个100μL新鲜制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；
②42℃热激45s，然后迅速置于冰浴中冷却2min；
③将上述感受态细胞接入到900μL无抗LB培养基，37℃，200rpm振荡培养60min；
④2500Xg，离心3min，去掉900μL上清，剩余培养基重悬菌体，涂布于带有100mg/mL氨苄霉素的LB固体培养基；
⑤37℃培养箱中正置30min，待菌液被吸干后，倒置平板于37℃培养12-16h。
(3)阳性克隆的鉴定：
①菌落PCR鉴定
挑取上述培养出的单菌落至1mL含有氨苄霉素的LB培养基，37℃、200rpm振荡培养6-8h，吸取1μL菌液，按照20μL PCR反应体系，进行菌落PCR鉴定，鉴定结果如图3所示，出现目的条带且条带单一的，显示菌落为阳性克隆。
②菌样测序
将用以上两种方法鉴定后的阳性克隆，送至测序公司进行测序，进一步证明构建的阳性克隆的正确性。
(4)得到扩增的重组质粒：
扩增的重组质粒：pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p、pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*。
实施例4
将实施例3制备的重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p、pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*分别转化到酿酒酵母菌株BY4741，具体步骤如下：
①350uLZOMANBIO快捷型酿酒酵母高效感受态制备试剂盒TM转化液+10uL实施例3中扩增的质粒；
②吸取360uL预混液加到感受态细胞中，反复吹吸，充分混匀；
③30℃水浴锅中热激45-60min，每10min混匀一次，3000×g，离心3min；
④弃上清，用500uL YPD重悬菌体，30℃摇床培育1h，3000×g，离心5min，弃上清；
⑤沉淀中加入100uL无菌水重悬菌体后，涂布在SD-URA缺陷型固体培养基上，30℃恒温培育3-5天，得到了四种工程菌：酿酒酵母工程菌BY4741/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、酿酒酵母工程菌BY4741/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、酿酒酵母工程菌BY4741/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p、酿酒酵母工程菌BY4741/pJEF3-URA-CYP539A7*-F0CPR*。
所述固体培养基成分为：2％琼脂粉、基础培养基YNB、尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物、2％葡萄糖。
实施例5
酿酒酵母工程菌BY4741/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、酿酒酵母工程菌BY4741/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、酿酒酵母工程菌BY4741/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p的发酵及生产10-羟基-2-癸烯酸的方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：挑取实施例4中的阳性重组酿酒酵母单菌落pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p分别接种至10mL的SD-URA尿嘧啶缺陷型种子培养基中，在30℃、200rpm振荡过夜培养；
(2)菌体转接：取上述活化菌株以初始OD600为0.4的接种量接入25mL pH5.5的SD-URA尿嘧啶缺陷型发酵培养基中，在30℃振荡诱导培养到OD600为1.0-1.2后，3500rpm，离心10min收集菌体；
(3)经SD-URA尿嘧啶缺陷型发酵培养基重悬，然后向培养基中加入0.5g/L的反式-2-癸烯酸，在30℃条件下，培养48小时，制得10-羟基-2-癸烯酸。
实施例6
酿酒酵母工程菌BY4741/pJEF3-URA-CYP539A7*-F0CPR*的发酵及生产10-羟基-2-癸烯酸的方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：同实施例5；
(2)菌体转接：取上述活化菌株以初始OD600为0.4的接种量接入25mL pH5.5的SD-URA尿嘧啶缺陷型种子培养基中，在30℃振荡诱导培养到OD600为1.0-1.2后，3500rpm，离心10min收集菌体；
(3)经SD-URA尿嘧啶缺陷型种子培养基重悬，然后向培养基中加入0.5g/L的反式-2-癸烯酸，在30℃条件下，培养48小时，制得10-羟基-2-癸烯酸。
实施例7
发酵液硅烷化处理：取1mL发酵液于2mL离心管中，每个样品用等体积的乙酸乙酯萃取样品溶液中的脂肪酸，旋流混合器混合30s，室温下14000r/m离心l0min。取提取液蒸发干燥，干燥后的样品重新溶解在0.5mL乙酸乙酯(色谱纯)，0.5mL正己烷(色谱纯)中，100uLBSTFA-TMCS(99:1,v/v)衍生化试剂加入后室温放置5min，在50℃的烤箱中孵育20min。
气相质谱检测生成产物：气相色谱以氦气为载气，恒流模式，进样体积1uL，分流进样，分流比为1:5，进样温度250℃，50℃保持lmin，以15℃/min升至250℃，保持10min。
酿酒酵母工程菌催化反式-2-癸烯酸生成10-HDA的产量如图4所示。
酿酒酵母工程菌BY4741/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*最终催化0.5g/L反式-2-癸烯酸生成131mg/L 10-HDA。
酿酒酵母工程菌BY4741/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p最终催化0.5g/L反式-2-癸烯酸生成239mg/L 10-HDA。
酿酒酵母工程菌BY4741/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p最终催化0.5g/L反式-2-癸烯酸生成220mg/L 10-HDA。
酿酒酵母工程菌BY4741/pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*最终催化0.5g/L反式-2-癸烯酸生成299mg/L10-HDA。
本发明发现酿酒酵母工程菌BY4741/pESC-URA-YP539A7*-F0CPR*能够生产10-HDA，辅助基因sil1p、crp5p能够明显增加酿酒酵母工程菌BY4741/pESC-URA-YP539A7*-F0CPR*生产10-HDA的产量。
本发明发现酵母工程菌BY4741/pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*生产10-HDA的产量最高达299mg/L，显著优于酿酒酵母工程菌BY4741/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*生产10-HDA的产量131mg/L。

Claims (10)

1.CYP539A7*-F0CPR*融合基因在生产10-羟基-2-癸烯酸中的应用，所述CYP539A7*-F0CPR*融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，CYP539A7*-F0CPR*融合基因在酵母菌发酵生产10-羟基-2-癸烯酸中的应用。
3.一种生产10-羟基-2-癸烯酸的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
构建含有重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p或pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*的酵母工程菌；所述CYP539A7*-F0CPR*融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述构建方法中，酵母工程菌使用的宿主酵母菌为酿酒酵母菌株BY4741。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述构建含有重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p或pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*的酵母工程菌，步骤如下：
(i)将基因CYP539A7密码子优化，得到优化后质粒pET28a-CYP539A7*，以质粒pET28a-CYP539A7*为模板PCR扩增基因CYP539A7*，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
将基因F0CPR密码子优化，得到优化后质粒pET28a-F0CPR*，以质粒pET28a-F0CPR*为模板PCR扩增基因F0CPR*，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
以酿酒酵母基因组为模板PCR扩增辅助基因sil1p，上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
以酿酒酵母基因组为模板PCR扩增辅助基因crp5p，上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
以重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*为模板PCR扩增融合基因CYP539A7*-F0CPR*，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
然后将质粒pESC-URA用BamH I和Xho I进行双酶切；重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*用EcoR I和Cla I进行双酶切；质粒pJEF3-URA用BamH I和Pst I进行双酶切；
所述步骤(i)中CYP539A7*基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，F0CPR*的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，辅助基因sil1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，辅助基因crp5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，CYP539A7*-F0CPR*融合基因的核苷酸序列如SEQID NO.15所示；
(ii)将步骤(i)扩增的CYP539A7*、F0CPR*基因片段和酶切后的载体pESC-URA进行无缝克隆，得到重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*；
将步骤(i)扩增的sil1p、crp5p基因片段和酶切后的载体pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*分别进行无缝克隆，得到重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p；
将步骤(i)扩增的CYP539A7*-F0CPR*融合基因片段和酶切后的载体pJEF3-URA进行无缝克隆，得到重组质粒pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*；
(iii)将步骤(ii)的重组质粒pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p、pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*分别转入宿主酵母菌，筛选阳性酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p、酵母工程菌/pJEF3-CYP539A7*-F0CPR*。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(i)中PCR扩增体系为：100μM上游引物2.0μL，100μM下游引物2.0μL，模板2.0μL，5U/μL phanta酶25μL，ddH2O 19μL，共50μL；
优选的，步骤(i)中PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃分别延伸1min30s、2min、1min、40s、3min40s，循环30次；72℃延伸5min；
优选的，步骤(iii)中筛选阳性菌株的方法为：采用菌落PCR鉴定和蛋白表达鉴定。
7.一种利用酵母工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，其特征在于，步骤如下：
将含有CYP539A7*-F0CPR*融合基因的酵母工程菌，利用含有反式-2-癸烯酸的培养基发酵产10-羟基-2-癸烯酸。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中，含有CYP539A7*-F0CPR*融合基因的酵母工程菌为权利要求3构建的酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*、酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-sil1p、酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p；
优选的，所方法中，酵母工程菌利用含有反式-2-癸烯酸的培养基发酵产10-羟基-2-癸烯酸，步骤如下：
(1)将酵母工程菌接入pH5.0-6.0尿嘧啶缺陷型种子培养基中，在25-35℃振荡过夜培养，种子液以初始OD600为0.3-0.5，接入尿嘧啶缺陷型发酵培养基，在25-35℃振荡诱导培养到OD600为1.0-1.2的菌液后收集菌体；
(2)将步骤(1)收集的菌体经步骤(1)中尿嘧啶缺陷型发酵培养基重悬，然后向培养基中加入反式-2-癸烯酸，培养，制得10-羟基-2-癸烯酸。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中，含有CYP539A7*-F0CPR*融合基因的酵母工程菌为权利要求3构建的酵母工程菌/pESC-URA-CYP539A7*-F0CPR*-crp5p；
优选的，所方法中，酵母工程菌利用含有反式-2-癸烯酸的培养基发酵产10-羟基-2-癸烯酸，步骤如下：
①将酵母工程菌接入pH5.0-6.0尿嘧啶缺陷型种子培养基中，在25-35℃振荡过夜培养，种子液以初始OD600为0.3-0.5，接入尿嘧啶缺陷型种子培养基，在25-35℃振荡诱导培养到OD600为1.0-1.2的菌液后收集菌体；
②将步骤①收集的菌体经步骤①中尿嘧啶缺陷型种子培养基重悬，然后向培养基中加入反式-2-癸烯酸，培养，制得10-羟基-2-癸烯酸。
10.如权利要求8或权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)或步骤①中，尿嘧啶缺陷型种子培养基成分组成为基础培养基YNB、质量浓度为1.5％-2.5％葡萄糖、尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物1.0-1.5g/L；
优选的，步骤(1)中，尿嘧啶缺陷型发酵培养基成分组成为基础培养基YNB、质量浓度为3.5％-4.5％半乳糖、2mM 5-ALA和尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物1.0-1.5g/L；
优选的，步骤(1)或步骤①中，收集菌体的方式为将菌液在3500-4000rpm条件下离心10-15min，收集沉淀；
优选的，步骤(2)或步骤②中，培养条件为在25～35℃条件下培养48-72小时；
优选的，步骤(2)或步骤②中，加入反式-2-癸烯酸在培养基中的浓度为0.5～1.0g/L。
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