CN117624378A - 一种融合蛋白、表达载体、构建方法及应用 - Google Patents
一种融合蛋白、表达载体、构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明本发明涉及的一种融合蛋白、表达载体、构建方法及应用，包括以下步骤：克隆酿酒酵母Erg20基因；制备Erg20F96W‑N127W基因；合成滇龙胆香叶醇合酶基因；构建GES‑Erg20F96W‑N127W融合蛋白；构建GES‑Erg20F96W‑N127W融合基因表达载体。本发明的有益之处在于：构建了香叶醇合酶与香叶基焦磷酸合酶的融合表达载体，将GPP代谢流引入香叶醇合成通路，提高香叶醇生物合成产量，经实验论证重组的酿酒酵母能够产生大量单萜香叶醇类化合物，解决单萜类化合物香叶醇生物合成中香叶基焦磷酸(GPP)水平低，导致香叶醇产量低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及了生物技术领域，尤其涉及一种融合蛋白、表达载体、构建方法及应用。
背景技术
化合物在植物体内含量并不高，直接从植物中获取次生代谢产物单体得率低、分离纯化步骤繁琐。随着合成生物学的发展，通过在工程菌中整合异源生物合成途径已成为异源合成各类次生代谢产物的重要研究手段。香叶醇(Geraniol，trans-3,7-dimethyl-2,6-octadien-1-ol，C10H18O)是一种无环单萜醇，因其气味宜人而被广泛用于香水和香精行业，香叶醇主要来源于植物天然产物提取，产量较低。单萜生产的代谢工程主要是在大肠杆菌中进行的，且大多数单萜的产量较低。目前有少量报道称在酵母中合成了少量单萜，但产量也很低。本发明旨在开发一种高效生产香叶醇的重组酿酒酵母菌株，将外源基因整合到宿主基因组中，使得导入到外源基因能够稳定表达，本发明开发的平台可随时用于合成其他单萜类化合物。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种融合蛋白、表达载体、构建方法及应用，构建了香叶醇合酶与香叶基焦磷酸合酶的融合表达载体，将GPP代谢流引入香叶醇合成通路，提高香叶醇生物合成产量，能够通过酿酒酵母工程菌进行单萜类化合物香叶醇生物合成中香叶基焦磷酸(GPP)水平低，导致香叶醇产量低的问题。
本发明涉及的一种融合蛋白，具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。
本发明还涉及一种融合基因表达载体，其结构如图1所示。
本发明还涉及一种表达载体的构建方法，包括以下步骤：
S1、克隆酿酒酵母Erg20基因；
S2、制备Erg20F96W-N127W基因；
S3、合成滇龙胆香叶醇合酶基因；
S4、构建GES-Erg20F96W-N127W融合蛋白；
S5、构建GES-Erg20F96W-N127W融合基因表达载体。
进一步地，克隆酿酒酵母Erg20基因包括：
S11、挑选酿酒酵母BY4742单菌落于50mL的YPD培养基中，220r/min，30℃条件下培养48h；3000rpm/5min收集菌株，利用真菌RNA提取试剂盒提取BY4742的RNA，提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳及Nanodrop 2000质量检测合格后，进行去除污染DNA及DNase；
S12、使用反转录试剂盒获得cDNA，ProtoScript反转录总体积为50μL：包括0.1MDTT 5μL，10mM dNTP 2.5μL，50mM MgCl25μL，750mM KCl 5μL，60μM Random Primer Mix 5μL，5X ProtoScript II buffer 10μL，ProtoScript II RT 0.625μL，RNase Inhibitor1.25μL，加入1μg模板后补水至50μL；
S13、以cDNA为模板，使用Q5高保真DNA聚合酶扩增BY4742的Erg20基因片段，Q5高保真DNA聚合酶PCR体系为25μL：包括Q5 High-Fidelity 2XMaster Mix 12.5μL，10μM正向引物1.25μL，10μM反向引物1.25μL，cDNA模板1μL，水9μL；
S14、将得到的Erg20片段连入pEASY-Blunt载体，连接体系总体积为5μL：pEASY-Blunt载体1μL和PCR纯化产物4μL，25℃连接反应2h；连接完成后将5μL连接反应体系全部转入50μL的Trans1-T1感受态细胞，加入1mL的SOC培养基，在37℃、220r/min下复苏1h，转入含有载体相应抗性的LB固体培养基，37℃过夜；
运用菌落PCR挑选阳性克隆进行Sanger测序，菌落PCR体系总体积为20μL：2×TaqPCRMix 10μL，模板2μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，补水7μL；挑选的阳性克隆测序结果与基因组序列比对。
进一步地，制备Erg20F96W-N127W基因包括：
S21、双突变片段的制备：引物设计，引物包含5’端重叠区和3’端延伸区，突变位点位于重叠区内；将pEASY-Erg20分为2个片段制备，其中两对引物都包含F96W和N127W两个位点，其中F96W将TCC突变为TGG，N127W将AAT突变为TGG，使用Q5高保真DNA聚合酶对2个片段分别扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶纯化；
S22、突变片段的组装：使用Fast MultiSite Mutagenesis System多点突变试剂盒进行片段组装；片段组装体系总体积为10μL：2XAssemblyMix 5μL，片段一和片段二各0.5pmols，补水至10μL，轻轻混匀后，置于50℃反应15分钟。
结束后立即置于冰上冷却；
S23、连接片段转化：将5μL连接产物转入50μL的Trans1-T1感受态细胞，加入1mL的SOC培养基，在37℃、220r/min下复苏1h，转入含有载体相应抗性的LB固体培养基，37℃过夜；
S24、阳性克隆检测：进行菌落PCR挑取阳性克隆，得到阳性克隆后进行Sanger测序验证是否突变成功，得到双突变Erg20F96W-N127W基因的载体pEASY-Erg20F96W-N127W。
进一步地，滇龙胆香叶醇合酶基因的合成包括：植物基因直接进行异源表达可能存在密码子偏好导致表达量低，本发明通过密码子优化来提高异源基因在宿主细胞中的蛋白表达量。优化提高了翻译启动和终止的效率，基因合成由华大基因完成。得到片段后克隆到载体pEASY上，最后得到质粒pEASY-GES。
进一步地，构建GES-Erg20F96W-N127W融合蛋白包括：选用了常用的柔性Linker，将氨基酸链“GGGS”加到GES和Erg20F96W-N127W中间，使用吉布森组装(NEB，E2611)的方法将两个片段连接起来；
引物5’端需包含15-25bp重叠区和10bp左右的延伸区，分别设计片段一GES、片段二Erg20WW的引物。其中，在片段一正向引物的5’端和片段二反向引物的3’端分别加上限制性内切酶NotI的位点，片段一的反向引物和片段二代正向引物的5’端重叠区需要包含Linker序列，Linker序列为GGTGGTGGTAGC；
使用Q5高保真DNA聚合酶进行片段扩增，以pEASY-GES为模板扩增片段一，以pEASY-Erg20F96W-N127W为模板扩增片段二，使用引物将载体pEASY线性化；
连接反应总体积10μL：2X Gibson Assembly Master Mix 5μL，片段1-2各0.5pmols；冰上配置完以上反应体系后将离心管置于PCR仪中，50℃孵育30分钟，反应完成后立即置于冰上；取2μL连接产物转入50μL的DH5感受态细胞中，用菌落PCR挑阳性克隆并进行Sanger测序验证，获得质粒1，pEASY-GES-Linker-Erg20WW，并将其作为融合蛋白。
进一步地，首先将质粒1使用限制性内切酶NotI(NEB，R3189)酶切并用琼脂糖凝胶电泳回收载体pYES2和片段GES-Linker-Erg20WW，反应体系总体积50μL：10rCutSmarBuffer5μL、2μg质粒1或pYES2、NotI-HF 2μL、补水50μL，37℃孵育2h。回收后将载体和片段使用T4DNA连接酶(NEB，M0202)进行连接，连接反应体系总体积10μL：1μL 10T4 DNA LigaseReaction Buffer、0.5μL T4 DNA Ligase、50ng线性化的载体pYES2、100ng片段GES-Linker-Erg20WW、补水至10μL，37℃孵育过夜；
取2μL连接产物转入50μL的DH5感受态细胞中，用菌落PCR挑阳性克隆并进行Sanger测序验证最终得到质粒2，pYES2-GES-Linker-Erg20WW，作为融合基因表达载体。
本发明还提供一种融合蛋白表达载体在提高香叶醇生物合成产量中的应用，包括：采用LiAc/PEG质粒转化法将质粒2转入酿酒酵母BY4742中，获得重组酿酒酵母菌株1和重组酿酒酵母菌株2；
挑选菌株1和2分别接种于SD-Ura营养缺陷型液体培养基中，先用30℃，220r/min，48h培养种子液；随后将种子液按照1％的比例接种于YPD的培养基中，在30℃，220r/min震荡培养2天后，将含有葡萄糖的YPD换成半乳糖YPD，在30℃下诱导48h，获得重组酿酒酵母菌发酵液。
进一步地，还包括将重组酿酒酵母菌发酵液3000rpm离心，分离上清和菌体沉淀，只留上清，使用等体积乙酸乙酯充分萃取，吸取上层有机相，重复萃取3次，合并提取物。使用旋转蒸发仪从上清液中蒸馏出乙酸乙酯，得到浓缩的提取物。使用高效液相色谱检测所得的发酵提取物，液相条件：流速0.8ml/min，进样量5μL，柱温35℃，最大吸收波长210nm；A:乙腈，B:0.1％甲酸水，0min 40％A，60％B；15min 80％A，20％B。
本发明的有益之处在于：本发明通过构建香叶醇生物合成途径中两种关键酶基因的融合表达载体，转入酿酒酵母BY4742中，不影响其本身的代谢通路。通过对重组菌发酵条件优化及使用合适的提取方法，最终鉴定出重组的酿酒酵母能够产生大量单萜香叶醇类化合物。本发明有效的解决了在单萜生物合成过程中由于GPP水平过低导致的单萜产量低的问题，同时也有效地避免了化学合成工艺复杂、污染环境、目标产物得率低，以及直接从植物中提取香叶醇纯化步骤繁琐、耗费大量人力物力等问题。本发明具有专一性强、生长周期短、副产物少等优点。
为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是融合基因表达载体的结构图。
图2是发酵提取物的色谱检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明一较佳实施例中涉及的融合蛋白、表达载体、构建方法及应用包括：
S1、酿酒酵母Erg20基因的克隆：挑选酿酒酵母BY4742单菌落于50mL的YPD培养基中，220r/min，30℃条件下培养48h。3,000rpm/5min收集菌株，利用真菌RNA提取试剂盒(coolaber，RE781)提取BY4742的RNA，提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳及Nanodrop 2000(Thermo)质量检测合格后，进行去除污染DNA及DNase(Thermo，AM1906，DNA-free KitDNase Treatment&Removal)，使用反转录试剂盒(NEB，E6560，II FirstStrand cDNA Synthesis Kit)获得cDNA(ProtoScript反转录总体积为50μL：0.1M DTT 5μL，10mM dNTP 2.5μL，50mM MgCl25μL，750mM KCl 5μL，60μM Random Primer Mix 5μL，5XProtoScript II buffer 10μL，ProtoScript II RT 0.625μL，RNase Inhibitor 1.25μL，加入1μg模板后补水至50μL，程序如表1)。
设计引物(序列见表2)，以cDNA为模板，使用Q5高保真DNA聚合酶(NEB，M0492，High-Fidelity 2X Master Mix)扩增BY4742的Erg20基因片段(Q5高保真DNA聚合酶PCR体系为25μL：Q5 High-Fidelity 2X Master Mix 12.5μL，10μM正向引物1.25μL，10μM反向引物1.25μL，cDNA模板1μL，水9μL，程序如表3)。将得到的Erg20片段连入pEASY-Blunt载体(连接体系总体积为5μL：pEASY-Blunt载体1μL和PCR纯化产物4μL，25℃连接反应2h)。连接完成后将5μL连接反应体系全部转入50μL的Trans1-T1感受态细胞，加入1mL的SOC培养基，在37℃、220r/min下复苏1h，转入含有载体相应抗性的LB固体培养基，37℃过夜。运用菌落PCR挑选阳性克隆进行Sanger测序(菌落PCR体系总体积为20μL：2×Taq PCRMix 10μL，模板2μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，补水7μL，程序如表4)。挑选的阳性克隆测序结果与基因组序列比对，序列比对结果显示克隆的核苷酸序列与原数据相似度100％，得到质粒pEASY-Erg20。
S2、Erg20F96W-N127W双突变基因制备：前期研究显示Erg20基因的双突变可增强甲羟戊酸途径中GPP的积累，于是本次构建了双突变的Erg20F96W-N127W基因用于后续融合基因的构建。
S21、双突变片段的制备：引物设计，引物包含5’端重叠区和3’端延伸区，突变位点位于重叠区内。将pEASY-Erg20分为2个片段制备，其中两对引物都包含F96W和N127W两个位点，其中F96W将TCC突变为TGG，N127W将AAT突变为TGG，引物序列见表2。使用Q5高保真DNA聚合酶对2个片段分别扩增，PCR体系及扩增程序同上。PCR产物进行琼脂糖凝胶纯化。
S22、突变片段的组装：使用Fast MultiSite Mutagenesis System多点突变试剂盒进行片段组装(全式金，FM201)。片段组装体系总体积为10μL：2XAssembly Mix 5μL，片段一和片段二各0.5pmols(pmols＝(需要加入的片段质量/ng)1000/(碱基数量650daltons))，补水至10μL。轻轻混匀后，置于50℃反应15分钟。结束后立即置于冰上冷却。
S23、连接片段转化：将5μL连接产物转入50μL的Trans1-T1感受态细胞，加入1mL的SOC培养基，在37℃、220r/min下复苏1h，转入含有载体相应抗性的LB固体培养基，37℃过夜。
S24、阳性克隆检测：如(1)中所述进行菌落PCR挑取阳性克隆，得到阳性克隆后进行Sanger测序验证是否突变成功，经测序结果比对，得到双突变Erg20F96W-N127W基因的载体pEASY-Erg20F96W-N127W。
S3、滇龙胆香叶醇合酶基因的合成：植物基因直接进行异源表达可能存在密码子偏好导致表达量低，本发明通过密码子优化来提高异源基因在宿主细胞中的蛋白表达量。优化提高了翻译启动和终止的效率，基因合成由华大基因完成。得到片段后克隆到载体pEASY上，操作如(1)中所述，最后得到质粒pEASY-GES。
S4、GES-Erg20F96W-N127W融合基因载体的构建：对于融合基因的2个基因需要共用启动子和终止子，且需要去除第一个基因的终止密码子和第二个基因的起始密码子，最后将2个基因使用一段Linker连接起来。Linker是两个融合蛋白间起连接作用的氨基酸链，具有一定的柔性以允许两侧的蛋白完成各自独立的功能。本发明选用了常用的柔性Linker，将氨基酸链“GGGS”加到GES和Erg20F96W-N127W中间。使用吉布森组装(NEB，E2611)的方法将两个片段连接起来，首先进行引物设计，引物5’端需包含15-25bp重叠区和10bp左右的延伸区，分别设计片段一GES、片段二Erg20WW的引物。其中，在片段一正向引物的5’端和片段二反向引物的3’端分别加上限制性内切酶NotI的位点，片段一的反向引物和片段二代正向引物的5’端重叠区需要包含Linker序列(GGTGGTGGTAGC)(引物序列见表2)。使用Q5高保真DNA聚合酶进行片段扩增，反应体系和程序如(1)中所述。以pEASY-GES为模板扩增片段一，以pEASY-Erg20F96W-N127W为模板扩增片段二，使用引物将载体pEASY线性化。连接反应总体积10μL：2X Gibson Assembly MasterMix 5μL，片段1-2各0.5pmols(pmols＝(需要加入的片段质量/ng)1000/(碱基数量650daltons))，载体0.1pmols，补水至10μL。在冰上配置完以上反应体系后将离心管置于PCR仪中，50℃孵育30分钟，反应完成后立即置于冰上。
取2μL连接产物转入50μL的DH5感受态细胞中，用菌落PCR挑阳性克隆并进行Sanger测序验证(操作方法如前所述)。最终得到质粒1(pEASY-GES-Linker-Erg20WW)。
S5、GES-Erg20F96W-N127W融合基因表达载体的构建：将整个融合好的片段与酿酒酵母表达载体pYES2连接，进行表达载体构建。首先将质粒1使用限制性内切酶NotI(NEB，R3189)酶切并用琼脂糖凝胶电泳回收载体pYES2和片段GES-Linker-Erg20WW，反应体系总体积50μL：10rCutSmarBuffer 5μL、2μg质粒1或pYES2、NotI-HF 2μL、补水50μL，37℃孵育2h。回收后将载体和片段使用T4 DNA连接酶(NEB，M0202)进行连接，连接反应体系总体积10μL：1μL 10T4 DNA Ligase Reaction Buffer、0.5μL T4 DNA Ligase、50ng线性化的载体pYES2、100ng片段GES-Linker-Erg20WW、补水至10μL，37℃孵育过夜。取2μL连接产物转入50μL的DH5感受态细胞中，用菌落PCR挑阳性克隆并进行Sanger测序验证(操作方法如前所述)。最终得到质粒2(pYES2-GES-Linker-Erg20WW)。
S6、重组酿酒酵母菌株构建：采用LiAc/PEG质粒转化法将质粒2转入酿酒酵母BY4742中。
S61、BY4742感受态制备：首先进行菌株活化，-80℃保存的菌种在YPDA培养基平板上划线，30℃培养2-4天。挑取酵母单菌落在YPDA培养基平板上划3-5mm的短线，30℃培养2-4天。待酵母单菌落长至直径2mm时，把酵母细胞接种到3mL YPDA液体培养基中，30℃过夜培养。次日转接到含有30-50mL YPDA液体培养基的三角瓶中继续培养，待OD600达到0.4-0.5，3000rpm离心5min，弃上清。沉淀用30-50mL的无菌的去离子水悬浮。3000rpm离心5min，弃上清。沉淀用1.5mL 1×LiAc(150μL 10×LiAc Solution加1350μL无菌水)重悬后转移至1.5mL离心管中，3000rpm离心5min，弃上清。加入1mL 1×LiAc重悬，小体积转化按照每管100μL分装，用于质粒转化。3000rpm离心5min，弃上清，BY4742感受态细胞即制备完毕。
S62、质粒转化：将360μL预混液(PEG Solution 240μL，10×LiAc Solution36μL，Carrier DNA 10μL，1μg质粒2，补水至360μL)加入1支感受态细胞中，反复吹吸沉淀，使酵母细胞彻底悬浮于预混液中。置于30℃的水浴锅中孵育30min，每10min混匀一次。42℃的水浴锅中热击30min，每10min混匀一次。12000rpm离心15s，弃上清液。用1mL YPD重新悬浮，30℃摇床震荡培养30-60min。12000rpm离心15s，弃上清液。加入0.1-1mL无菌去离子水或0.9％氯化钠溶液重悬沉淀，取100μL涂SD-Ura营养缺陷型固体培养基(含2％葡萄糖)，30℃倒置培养2-4天。待转化子长出，使用进行菌落PCR挑选阳性克隆，使用真菌基因组DNA提取试剂盒(BioFlux，BSC14M1)提取全基因组进行目标区域的PCR扩增和Sanger测序验证，得到重组酿酒酵母菌株1，然后用同样的方式获得重组酿酒酵母菌株2。(BY4742pYES2-GES-Linker-Erg20WW)
S7、重组酿酒酵母菌发酵：挑选菌株1和2分别接种于SD-Ura营养缺陷型液体培养基中，先用30℃，220r/min，48h培养种子液。随后将种子液按照1％的比例接种于YPD的培养基(50mL)中，在30℃，220r/min震荡培养2天后，将含有葡萄糖的YPD换成半乳糖YPD，在30℃下诱导48h。
S8、重组酿酒酵母工程菌产物提取及检测：摇瓶发酵结束后，将发酵液3000rpm离心，分离上清和菌体沉淀，只留上清，使用等体积乙酸乙酯充分萃取，吸取上层有机相，重复萃取3次，合并提取物。使用旋转蒸发仪从上清液中蒸馏出乙酸乙酯，得到浓缩的提取物。使用高效液相色谱检测所得的发酵提取物(图1)，液相条件：流速0.8ml/min，进样量5μL，柱温35℃，最大吸收波长210nm；A:乙腈，B:0.1％甲酸水，0min 40％A，60％B；15min 80％A，20％B。
表1ProtoScript反转录程序
表2本发明所用到的引物序列
表3Q5高保真DNA聚合酶PCR反应程序
表4菌落PCR反应程序
表5重叠延伸PCR反应程序
本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种融合蛋白，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。
2.一种融合基因表达载体，其结构如图1所示。
3.如权利要求2所述表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、克隆酿酒酵母Erg20基因；
S2、制备Erg20F96W-N127W基因；
S3、合成滇龙胆香叶醇合酶基因；
S4、构建GES-Erg20F96W-N127W融合蛋白；
S5、构建GES-Erg20F96W-N127W融合基因表达载体。
4.权利要求2所述表达载体的构建方法，其特征在于，克隆酿酒酵母Erg20基因包括：
S11、挑选酿酒酵母BY4742单菌落于50mL的YPD培养基中，220r/min，30℃条件下培养48h；3000rpm/5min收集菌株，利用真菌RNA提取试剂盒提取BY4742的RNA，提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳及Nanodrop 2000质量检测合格后，进行去除污染DNA及DNase；
S12、使用反转录试剂盒获得cDNA，ProtoScript反转录总体积为50μL：包括0.1M DTT 5μL，10mM dNTP 2.5μL，50mM MgCl25μL，750mM KCl 5μL，60μM Random Primer Mix 5μL，5XProtoScript II buffer 10μL，ProtoScript II RT 0.625μL，RNase Inhibitor 1.25μL，加入1μg模板后补水至50μL；
S13、以cDNA为模板，使用Q5高保真DNA聚合酶扩增BY4742的Erg20基因片段，Q5高保真DNA聚合酶PCR体系为25μL：包括Q5 High-Fidelity 2XMaster Mix 12.5μL，10μM正向引物1.25μL，10μM反向引物1.25μL，cDNA模板1μL，水9μL；
S14、将得到的Erg20片段连入pEASY-Blunt载体，连接体系总体积为5μL：pEASY-Blunt载体1μL和PCR纯化产物4μL，25℃连接反应2h；连接完成后将5μL连接反应体系全部转入50μL的Trans1-T1感受态细胞，加入1mL的SOC培养基，在37℃、220r/min下复苏1h，转入含有载体相应抗性的LB固体培养基，37℃过夜；
运用菌落PCR挑选阳性克隆进行Sanger测序，菌落PCR体系总体积为20μL：2×TaqPCRMix 10μL，模板2μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，补水7μL；挑选的阳性克隆测序结果与基因组序列比对。
5.根据权利要求3所述的表达载体的构建方法，其特征在于，制备Erg20F96W-N127W基因包括：
S21、双突变片段的制备：引物设计，引物包含5’端重叠区和3’端延伸区，突变位点位于重叠区内；将pEASY-Erg20分为2个片段制备，其中两对引物都包含F96W和N127W两个位点，其中F96W将TCC突变为TGG，N127W将AAT突变为TGG，使用Q5高保真DNA聚合酶对2个片段分别扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶纯化；
S22、突变片段的组装：使用Fast MultiSite Mutagenesis System多点突变试剂盒进行片段组装；片段组装体系总体积为10μL：2XAssemblyMix 5μL，片段一和片段二各0.5pmols，补水至10μL，轻轻混匀后，置于50℃反应15分钟。结束后立即置于冰上冷却；
S23、连接片段转化：将5μL连接产物转入50μL的Trans1-T1感受态细胞，加入1mL的SOC培养基，在37℃、220r/min下复苏1h，转入含有载体相应抗性的LB固体培养基，37℃过夜；
S24、阳性克隆检测：进行菌落PCR挑取阳性克隆，得到阳性克隆后进行Sanger测序验证是否突变成功，得到双突变Erg20F96W-N127W基因的载体pEASY-Erg20F96W-N127W。
6.根据权利要求3所述的表达载体的构建方法，其特征在于，滇龙胆香叶醇合酶基因的合成包括：植物基因直接进行异源表达可能存在密码子偏好导致表达量低，本发明通过密码子优化来提高异源基因在宿主细胞中的蛋白表达量。优化提高了翻译启动和终止的效率，基因合成由华大基因完成。得到片段后克隆到载体pEASY上，最后得到质粒pEASY-GES。
7.根据权利要求3所述的表达载体的构建方法，其特征在于，构建GES-Erg20F96W-N127W融合蛋白包括：选用了常用的柔性Linker，将氨基酸链“GGGS”连接到去除终止密码子的GES和去除起始密码子的Erg20F96W-N127W中间，使用吉布森组装(NEB，E2611)的方法将两个片段连接起来；
引物5’端需包含15-25bp重叠区和10bp左右的延伸区，分别设计片段一GES、片段二Erg20WW的引物。其中，在片段一正向引物的5’端和片段二反向引物的3’端分别加上限制性内切酶NotI的位点，片段一的反向引物和片段二代正向引物的5’端重叠区需要包含Linker序列，Linker序列为GGTGGTGGTAGC；
使用Q5高保真DNA聚合酶进行片段扩增，以pEASY-GES为模板扩增片段一，以pEASY-Erg20F96W-N127W为模板扩增片段二，使用引物将载体pEASY线性化；
连接反应总体积10μL：2X Gibson Assembly Master Mix 5μL，片段1-2各0.5pmols；冰上配置完以上反应体系后将离心管置于PCR仪中，50℃孵育30分钟，反应完成后立即置于冰上；取2μL连接产物转入50μL的DH5感受态细胞中，用菌落PCR挑阳性克隆并进行Sanger测序验证，获得质粒1，pEASY-GES-Linker-Erg20WW，并将其作为融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的表达载体的构建方法，其特征在于，首先将质粒1使用限制性内切酶NotI(NEB，R3189)酶切并用琼脂糖凝胶电泳回收载体pYES2和片段GES-Linker-Erg20WW，反应体系总体积50μL：10rCutSmar Buffer 5μL、2μg质粒1或pYES2、NotI-HF 2μL、补水50μL，37℃孵育2h，回收后将载体和片段使用T4 DNA连接酶(NEB，M0202)进行连接，连接反应体系总体积10μL：1μL 10T4 DNA Ligase Reaction Buffer、0.5μL T4 DNA Ligase、50ng线性化的载体pYES2、100ng片段GES-Linker-Erg20WW、补水至10μL，37℃孵育过夜；
取2μL连接产物转入50μL的DH5感受态细胞中，用菌落PCR挑阳性克隆并进行Sanger测序验证最终得到质粒2，pYES2-GES-Linker-Erg20WW，作为融合基因表达载体。
9.权利要求2-9任一项所述的融合蛋白表达载体在提高香叶醇生物合成产量中的应用，其特征在于，包括：采用LiAc/PEG质粒转化法将质粒2转入酿酒酵母BY4742中，获得重组酿酒酵母菌株1和重组酿酒酵母菌株2；
挑选菌株1和2分别接种于SD-Ura营养缺陷型液体培养基中，先用30℃，220r/min，48h培养种子液；随后将种子液按照1％的比例接种于YPD的培养基中，在30℃，220r/min震荡培养2天后，将含有葡萄糖的YPD换成半乳糖YPD，在30℃下诱导48h，获得重组酿酒酵母菌发酵液。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：还包括将重组酿酒酵母菌发酵液3000rpm离心，分离上清和菌体沉淀，只留上清，使用等体积乙酸乙酯充分萃取，吸取上层有机相，重复萃取3次，合并提取物。使用旋转蒸发仪从上清液中蒸馏出乙酸乙酯，得到浓缩的提取物，使用高效液相色谱检测所得的发酵提取物，液相条件：流速0.8ml/min，进样量5μL，柱温35℃，最大吸收波长210nm；A:乙腈，B:0.1％甲酸水，0min 40％A，60％B；15min 80％A，20％B。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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