CN114875046B - 一种丝状真菌复制子 - Google Patents

一种丝状真菌复制子 Download PDF

Info

Publication number
CN114875046B
CN114875046B CN202210598346.0A CN202210598346A CN114875046B CN 114875046 B CN114875046 B CN 114875046B CN 202210598346 A CN202210598346 A CN 202210598346A CN 114875046 B CN114875046 B CN 114875046B
Authority
CN
China
Prior art keywords
replicon
plasmid
fragment
anep8
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210598346.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114875046A (zh
Inventor
林峻
燕天鹤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fuzhou University
Original Assignee
Fuzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuzhou University filed Critical Fuzhou University
Priority to CN202210598346.0A priority Critical patent/CN114875046B/zh
Publication of CN114875046A publication Critical patent/CN114875046A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114875046B publication Critical patent/CN114875046B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/04—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on acid anhydrides; involved in cellular and subcellular movement (3.6.4)
    • C12Y306/04012—DNA helicase (3.6.4.12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2820/00—Vectors comprising a special origin of replication system
    • C12N2820/007—Vectors comprising a special origin of replication system tissue or cell-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2820/00—Vectors comprising a special origin of replication system
    • C12N2820/55—Vectors comprising a special origin of replication system from bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种丝状真菌复制子，所述复制子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述复制子是以19种真菌基因组为模板构建宏基因组文库，转化黑曲霉孢子筛选得到，来自厚孢根霉内生菌伯克霍尔德氏菌HKI454基因组。本发明的复制子可以在黑曲霉表达系统中发挥复制功能，并且可以提供比AMA1复制子更高的稳定性，为首次在除构巢曲霉以外的真菌中发现的复制子，丰富了复制子元件库，拓展了丝状真菌利用复制子的选择多样性。

Description

一种丝状真菌复制子
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丝状真菌复制子。
背景技术
在真菌自主复制序列未被发现之前，丝状真菌转化系统最主要的缺陷是没有类似于可以在酵母菌染色体外自主复制的质粒，导致整合转化的效率低下。自研究人员在酿酒酵母中发现ARS序列以来，关于复制子的研究在真菌中展开，最早在构巢曲霉中发现一段6.1Kb的序列AMA1，含有AMA1序列的质粒转化构巢曲霉可以将转化效率提高250倍，并且可以在染色体外自主复制，该序列也被应用于其他真菌，如产黄青霉、黑曲霉、寄生曲霉等。从1991年AMA1序列发现至今，有关丝状真菌的自主复制序列研究进展缓慢，因此筛选潜在的真菌复制子可为合成生物学的发展提供一定的参考价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丝状真菌复制子R75flank3.441，所述复制子是以19种真菌基因组为模板构建宏基因组文库，转化黑曲霉孢子筛选得到，来自厚孢根霉内生菌伯克霍尔德氏菌HKI454基因组。
本发明提供的丝状真菌复制，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述复制子R75flank3.411的构建方法如下：
1)以AnEp8-AnHyg质粒为模板，经Not I酶切除去AMA1复制子得到AnEp8-AnHyg-deleteAMA1载体；以19种真菌混合基因组为模板，经Tn5建库试剂盒进行DNA片段化处理，Altama-F/R引物扩增筛选4-5Kb目的片段，将扩增产物回收并纯化；将AnEp8-AnHyg-deleteAMA1线性载体与目的片段使用In-fusion法连接并转化至10β超级感受态细胞，提取质粒备用；
2)利用HDEN技术将步骤1)得到的质粒转化至黑曲霉孢子，Hyg抗性基因筛选到一个阳性转化子，以所述阳性转化子孢子为模板，Not I-F/R引物验证，sanger测序得到一段R75序列，包含部分核糖体大亚基蛋白L9和DNA复制解旋酶序列；
3)以19种真菌基因组为模板，R75-F/R引物扩增得出R75序列来源，以R75序列来源为模板，R75flank-F/R扩增得到R75flank3.441片段，与步骤1)中的AnEp8-AnHyg-deleteAMA1连接得到AnEp8-R75flank3.441质粒。
本发明的有益效果在于：本发明的R75flank3.441复制子可以在黑曲霉表达系统中发挥复制功能，并且可以提供比AMA1复制子更高的稳定性，为首次在除构巢曲霉以外的真菌中发现的复制子，丰富了复制子元件库，拓展了丝状真菌利用复制子的选择多样性。
附图说明
图1是不同扩增循环数、Tn5用量以及处理时间对目的片段的影响；
M：Takara 250bp DNA Ladder Marker；(A)泳道1-5：扩增循环数分别为15、20、25、30、35；(B)泳道1-2：Tn5用量分别为0.05U和0.03U；(C)泳道1-5：片段化处理时间分别为10sec、15sec、20sec、25sec、30sec。
图2是Tn5文库菌落PCR验证。
图3是Tn5文库黑曲霉菌落PCR验证。
图4是R75序列。
图5是PCR验证R75片段来源电泳图；
M：Takara DL500 DNA Ladder Marker；(A)泳道1-10模板分别为：GDMCC 3.605、CICC 40344、GDMCC 3.515、GDMCC 3.439、GDMCC 3.441、GDMCC 3.549、GDMCC 3.521、GDMCC3.510、CICC 40341、CBS 513.88；(B)泳道1-9模板分别为：ATCC 24919、GDMCC 3.405、CICC40359、GDMCC 3.97、GDMCC 3.548、CICC 2397、GDMCC 2.12、GDMCC 3.413、GDMCC 3.503。
图6是R75flank3.441/3.405片段扩增(A)及AnEp8-R75flank3.441/3.405质粒转化子验证(B)；
其中，M：Takara 250bp DNA Ladder Marker；(A)泳道1:R75flank3.405；泳道2:R75flank3.441片段.(B)泳道1-2模板：AnEp8-R75flank3.441两个转化子；泳道3模板：AnEp8-R75flank3.405一个转化子。
图7是R75flank3.441序列。
图8是Actin和Hyg基因熔解峰图。
图9是两种样品的Hyg基因相对表达量比例图。
图10是两种黑曲霉转接PDA若干次后潮霉素验证；
M：Takara 250bp DNA Ladder Marker；(A)泳道1-9：AnEp8-AnHyg黑曲霉转接1-9次；泳道10：阴性对照；(B)泳道1-9：AnEp8-R75flank3.441黑曲霉转接1-9次；泳道10：阴性对照。
图11是两种质粒连接4Kb外源片段菌落PCR验证；
M：Takara 250bp DNA Ladder Marker；(A)1-5:AnEp8-AnHyg质粒；6:阴性对照.(B)1-5:AnEp8-R75flank3.441质粒。
图12是两种质粒连接10Kb外源片段菌落PCR验证；
M：Takara 250bp DNA Ladder Marker；(A)1-5:AnEp8-AnHyg质粒；6:阴性对照.(B)1-5:AnEp8-R75flank3.441质粒；6:阴性对照.
图13是两种质粒连接16Kb外源片段菌落PCR验证；
M：Takara 250bp DNA Ladder Marker；(A)1-5:AnEp8-AnHyg质粒；6:阴性对照.(B)1-5:AnEp8-R75flank3.3.441质粒；6:阴性对照。
图14是含外源片段质粒的黑曲霉生长情况；
列1：原始质粒对照；列2：连接4Kb外源片段重组质粒；列3：连接10Kb外源片段重组质粒；列4：连接16Kb外源片段重组质粒；行A：AnEp8-AnHyg及其重组质粒；行B：AnEp8-R75flank3.441及其重组质粒。
图15AnEp8-AnHyg连接不同外源片段质粒的转化子验证；
M:Takara 250 bp DNA Ladder Marker；ABC为连接片段验证结果,泳道1为阴性对照；DEF为潮霉素验证结果,泳道1为阳性对照(A)泳道2-6:连接4Kb的五个转化子(B)泳道2-6:连接10Kb的五个转化子.(C)泳道2-4:连接16Kb的三个转化子.DEF中顺序同ABC。
图16AnEp8-R75flank3.441质粒连接4Kb外源片段的转化子验证；
M:Takara 250bp DNA Ladder Marker；(A)泳道1:阴性对照；泳道2:4K片段验证.(B)泳道1:阳性对照；泳道2:潮霉素验证。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
1真菌培养及基因组提取
1.1真菌培养
将菌株从-80℃冰箱拿出，冰上自然解冻，在超净工作台中使用酒精灯灼烧过的接种环蘸取菌液，一字法划线固体PDA培养基，按照表1培养条件暗培养至有单菌落长出，挑取部分菌体于无菌水中吹打混匀，取200μL孢子悬浮液于铺有玻璃纸的PDA固体培养基中暗培养至培养基上铺满菌丝，4℃冰箱保存。
表1真菌种类及培养条件
1.2真菌基因组提取方法
以培养好的真菌菌丝为模板提取基因组，具体步骤参照生工生物工程的真菌基因组DNA快速抽提试剂盒说明书。
2Tn5文库构建
本发明使用的线性载体为AnEp8-AnHyg-deleteAMA1，是在AnEp8-AnHyg穿梭质粒基础上去除AMA1序列所得。该质粒携带大肠杆菌筛选基因氨苄青霉素及真菌筛选基因潮霉素B，以便阳性转化子的筛选。
鉴于AMA1复制子序列为5Kb左右，因此将目的片段的筛选范围控制在4-5Kb。首先需要将真菌基因组进行片段化，目前使用最广泛的片段化酶为Tn5，其结合位点为Tn5转座子两端的倒置IS50序列外末端，形成两个转座酶外末端(Tnp-OE)复合体，复合体联会后随机插入双链DNA对基因组进行片段化处理。根据同源互补连接原理设计引物经Infusion法连接，转化超级感受态细胞得到Tn5文库。
2.1AnEp8-AnHyg质粒提取
从-80℃冰箱拿出AnEp8-AnHyg大肠杆菌菌株，冰上自然解冻，用接种环蘸取少量菌液，三区法划线于含有氨苄青霉素抗性(工作浓度100μg/mL)的LB固体平板，37℃过夜培养12-16h，挑取单菌落于5mL含有氨苄青霉素抗性(100μg/mL)的LB液体培养基，置于摇床37℃，220rpm振荡培养12-16h，按照1‰接种率接种于10mL含有氨苄青霉素抗性(100μg/mL)的LB液体培养基，置于摇床37℃，220rpm振荡培养12-16h后用于提取质粒，-20℃保存。质粒提取方法参照康为世纪EndoFree Plasmid Midi Kit试剂盒说明书。
2.2AnEp8-AnHyg-deleteAMA1线性载体获取
AMA1序列两端含有相同限制性酶切位点Not I，载体其他位置不含该酶切位点，根据NEB Not I-HF说明书进行酶切，反应体系如表2所示。
表2AnEp8-AnHyg质粒酶切体系
将上述配置好的体系吸打混匀后瞬时离心，置于PCR仪37℃恒温孵育3h，65℃孵育20min热失活，将全部酶切产物加6×Loading Buffer至终浓度为1×，上样于1％琼脂糖凝胶孔中，85V电泳20min，以λ-Hind III digest DNA Ladder Marker为参照切下目的条带，使用GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit对胶回收产物进行纯化回收得到线性载体AnEp8-AnHyg-deleteAMA1。
2.3目的片段获取
以19种真菌混合基因组为模板，加入Tn5转座酶打断基因组，反应体系如表3所示，以Altama-F/R引物扩增基因组片段，该引物含有测序接头S5(5’-TCGTCGGCAGCGTC-3’)/S7(5’-GTCTCGTGGGCTCGG-3’)序列以及与线性载体Not I酶切位点两端同源的15bp序列，可实现目的片段与载体无缝连接。扩增体系如表4所示，扩增程序如表5所示，对Tn5用量、处理时间、扩增循环数做条件探索。所有产物上样琼脂糖凝胶孔，以Takara 250bp DNA LadderMarker为参照，使用GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit对4-5 Kb大小的胶回收产物进行纯化回收。
表3Tn5片段化反应体系
将上述配好的体系吹打混匀后短暂离心，置于PCR仪55℃分别孵育10sec、15sec、20sec、25sec、30sec，取5μL反应体系加15μL ddH2O混合，置于PCR仪95℃孵育8min，冰上放置备用。
表4PCR扩增体系
表5PCR扩增程序
将上述配置好的体系吸打混匀后瞬时离心，置于PCR仪按照表5所示进行片段扩增，将全部酶切产物加6×Loading Buffer至终浓度为1×，所有产物上样于1％琼脂糖凝胶孔中，85V电泳20min，以Takara 250bp DNA Ladder Marker为参照切下4-5Kb目的条带，使用GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit对胶回收产物进行纯化回收。
2.4连接转化
将切胶回收的4-5Kb片段与纯化后的AnEp8-AnHyg-deleteAMA1线性载体通过In-Fusion Snap Assembly进行连接反应，反应体系参照Takara In-Fusion Snap Assembly试剂盒说明书，插入片段与线性化载体按照摩尔比2:1加至体系中，插入片段以5Kb计算，如表6所示，体系配置好后置于PCR仪50℃孵育15min。
为了提高转化效率，使用10β超级感受态细胞进行转化。相比于传统的氯化钙法制备感受态，超级感受态细胞转化效率可高出1-2个数量级。取10μL连接体系转化至10β超级感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素抗性(100μg/mL)的LB固体平板，37℃恒温培养箱过夜培养12-16h至单菌落长出，随机挑取单菌落，用Not I-F/R引物验证连接效率，菌落PCR体系如表7所示，PCR程序如表8所示。10β超级感受态细胞制作方法参照生工生物工程超级感受态细胞制备试剂盒。
表6Infusion连接体系
表7菌落PCR扩增体系
表8菌落PCR扩增程序
2.5质粒提取
将上述方法扩大连接体系转化10β超级感受态细胞，用200mL含有氨苄青霉素抗性(100μg/mL)的LB液体培养基刮下全部单菌落，置于37℃恒温培养振荡器220rpm培养数小时至OD600＝0.2，大提质粒，具体步骤如下。
(1)将200mL菌液分装至4个50mL离心管中，6000rcf离心15min，弃上清。
(2)在菌体中加入10mL提前冰育的BufferP1(50mM Tris-HCl，pH 8.0；10mM EDTApH 8.0，提前加入RNAseA至终浓度150μg/mL)，移液枪吹打混匀。
(3)加入10mL的BufferP2(200mM NaOH，1％SDS)，轻轻晃动至彻底混匀，室温放置5min。
(4)加入10mL提前冰育的BufferP3(3M乙酸钾，pH 5.4-5.6)，轻轻晃动至沉淀完全变白，7000rcf离心10min。
(5)安装过滤装置：将放有灭菌抽纸的漏斗架于新的50mL离心管上，抽纸一边一层一边三层放置。
(6)将离心过的菌液上清经过滤装置滤去沉淀，收集上清。
(7)在上清中加入提前冰育的Buffer ER，上下颠倒混匀，冰上孵育30min。
(8)将QIAGEN-tip500置于新的50mL离心管上，加入10mL Buffer QBT(750mMNaCl；50mM MoPS，pH 7.0；1％异丙醇；0.15％Triton)，让管中溶液通过重力滴下排空。
(9)将步骤7中冰育后的混合液加入平衡后的QIAGEN-tip500，使其透过树脂慢慢滴下。
(10)加入60mL的Buffer QC(1M NaCl；50mM MoPS，pH 7.0；15％异丙醇)清洗tip500。
(11)加入15mL的Buffer QN(1.6M NaCl；50mM MoPS，pH 7.0；15％异丙醇)洗脱DNA至新的50mL离心管中。
(12)加入10.5mL异丙醇至洗脱液中沉淀DNA，上下颠倒混匀，15000rcf，4℃离心30min，弃上清。
(13)加入1mL 70％乙醇轻轻吹打重悬沉淀，15000rcf，4℃离心10min，弃上清。
(14)室温放置15min晾干残余乙醇。
(15)加入100μL ddH2O溶解沉淀，提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
2.6文库构建结果
目的片段大小受到Tn5处理时间、Tn5用量及扩增循环数影响，用量越大、处理时间越久则目的片段越小。为了使目的片段含量最大化，对扩增循环数、Tn5用量及Tn5处理时间进行优化，琼脂糖凝胶电泳观察4-5 Kb片段量，结果如图1所示，A图中循环数最优为35循环，4-5 Kb片段最多；B图中Tn5用量最优为0.05U；C图中处理时间最优为25sec。
使用最佳条件对19种真菌基因组进行片段化，与线性化载体无缝连接并转化10β超级感受态细胞，随机挑取5个单菌落以Not I-F/R引物验证连接效率，电泳结果如图2所示，AnEp8-AnHyg-deleteAMA1载体Not I-F/R引物扩增条带为255bp，5个单菌落中有三个条带超过255bp，在500bp到1.5Kb之间。扩大反应体系至200μL，得到大约44000个单菌落并大提质粒，-20℃保存。
3转化子的筛选
传统的外源核酸转化方法主要包括原生质体转化法、农杆菌转化法、基因枪法等，但操作繁琐，对细胞损伤较大导致细胞存活量少，转化效率低。近年来，研究人员开发出一种可以转化外源核酸至哺乳动物细胞体内的电击转化法——HDEN技术，该方法可有效减少转化过程中对细胞的损伤，提高转化效率，但该技术在真菌孢子转化方面研究较少。基于本实验室已有使用HDEN技术成功转化黑曲霉的先例，并且对电击转化过程中的一些参数如电场强度、脉冲时间与电击次数、电容、缓冲液pH、细胞浓度与外源核酸含量进行了探究，在此基础上得到了电转黑曲霉孢子的最佳条件。具体转化步骤以下文献中实验方法：黄晓明.外源核酸直接转化真菌孢子的研究[D].福州:福州大学,2019.
3.1筛选方法
电转后生长4-5天观察菌落生长情况，正常情况下黑曲霉生长1-2天为白色分生孢子头，后变为黄色直至黑色厚绒状，背面为黄褐色。若平板上有黑曲霉单菌落长出，挑取部分孢子于裂解液中85℃裂解15min作为模板，infusionAnEp8-F/R引物做菌落PCR初步验证潮霉素片段，若转化子有正确条带，再挑取单菌落部分菌体于ddH2O中吹打得到孢子悬浮液，取200μL悬浮液涂布于含有潮霉素B(工作浓度200μg/mL)的PDA固体培养基扩大培养，培养基上铺玻璃纸便于收集菌丝。28℃避光培养1-2天至玻璃纸上铺满菌丝，枪头挑取适量菌丝，液氮法提取基因组。
以提取到的基因组为模板，Not I-F/R引物扩增目的片段，1％琼脂糖凝胶电泳验证，将有条带的PCR产物送Sanger测序，得到新复制子序列，同时对阳性转化子继续转接含有潮霉素B抗性的PDA平板若干次，验证复制子是否具备复制功能，若转接若干次后依然条带正确，以阳性转化子基因组为模板，Altama-F/R引物扩增出新复制子片段，Infusion法与AnEp8-AnHyg-deleteAMA1线性载体连接构建带有新复制子的质粒。
对筛选到的阳性转化子做保种处理：挑取阳性转化子部分菌体于适量ddH2O中获得孢子悬浮液，用酒精灯灼烧过的接种环蘸取孢子悬浮液，划线斜面固体PDA培养基(含200μg/mL潮霉素B)，28℃避光培养至长出黑色孢子，10％灭菌甘油轻轻刮下孢子，分装于1.5mL离心管中，-80℃保存。
3.2结果
3.2.1R75片段
将以Tn5转座酶法构建得到的Tn5文库大提质粒，转化黑曲霉后得到三个转化子，以Not I F/R引物扩增目的基因，电泳结果如图3所示，只有3号样品有1000bp左右条带。
对该样品PCR产物进行Sanger测序，测序结果如图4所示，插入序列全长753bp，经NCBI数据库Blast序列比对后发现该序列与AMA1不相似，与伯克霍尔德氏菌HKI454(Burkholderia rhizoxinica HKI454)基因组相似度达95％，可比对上709bp，位于伯克霍尔德氏菌HKI454基因组1272530-1273275bp位置，其中前190bp碱基中有173bp可比对基因组中的核糖体大亚基蛋白L9(RPL9)，后451bp碱基中有430bp可比对基因组中的DNA复制解旋酶(Replicative DNA helicase)，GC含量61％，为一段新序列。
伯克霍尔德氏菌HKI454是植物病原真菌——小孢根霉(Rhizopus microsporus)的胞内共生菌，在这种共生生命形式中，宿主真菌依赖于伯克氏菌的存在产生孢子囊和孢子，内生菌反过来为获取腐烂植物的营养产生内生毒素。核糖体蛋白(RP)是组成核糖体的重要成分，附着在核糖体RNA骨架上，形成完整的核糖体，参与蛋白质的生物合成。RPL9蛋白是核糖体大亚基的一个组分，外形细长，由α-螺旋连接N端和C端结构域，两端结构域都为α-β球蛋白，其中N端结构域含有56个残基，C端结构域含有92个残基。不同物种中RPL9蛋白α-螺旋长度不同，但都可以稳定两个23S rRNA结构域之间的距离，在核糖体中发挥重要的结构功能。同时RPL9蛋白也是与RNA结合最基本的蛋白之一，在翻译过程中可以对核糖体的快速移动起重要作用，保证翻译的准确性。DNA复制解旋酶在复制前期起到重要作用，核心部分为MCM复合体，由六个亚基组成(Mcm 2-7)，复制前期被装载在复制起点上，在装载因子的参与下环绕dsDNA(Double-Stardand DNA)形成未激活状态的MCM双六聚体复合物，S期在蛋白因子的参与下被激活为两个CMG(Cdc 45-MCM-GINS)复合体，环绕在ssDNA(Single-Stardand DNA)上，从先导链的3’方向到5’方向移动并组装复制体，在复制终止阶段解聚，复制结束。
将上述753bp序列命名为R75，并克隆至AnEp8-AnHyg-deleteAMA1载体上，得到全新质粒AnEp8-R75。为了比较两种复制子对黑曲霉的转化效率强弱，对AnEp8-AnHyg和AnEp8-R75两种质粒分别以6μg、12μg、24μg用量电转黑曲霉，转化结果显示AnEp8-AnHyg在质粒用量12μg时电转效果最佳，最高纪录可生长98个转化子，而AnEp8-R75在质粒用量6μg时转化效果最佳，最高纪录可生长128个转化子。为了再次确认R75复制子的稳定性，对AnEp8-R75质粒进行了多次电转，但重复实验结果不稳定。对其序列进行分析，发现R75序列249-259bp处AT含量高达91％(5’-TTTTTTTTGTT-3’)，与ARS中的11bp保守序列[5’-(A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T)-3’]仅相差3个碱基，这可能是其具有复制功能的活性区域，而与AMA1的特殊结构相比，R75序列并没有反向重复结构及其他特殊结构，同时序列较短，并不足以维持其在黑曲霉中的稳定复制功能。
3.2.2R75片段改进
经比对后发现R75序列来源于伯克霍尔德氏菌HKI454，因此尝试从真菌中分离出该种真菌内生菌。首先因为R75序列是在19中真菌基因组中筛选得到的，因此以R75序列为模板，设计引物R75-F/R，该引物可扩增出其中的373bp片段，以19种真菌基因组为模板分别用该引物扩增目的片段，电泳结果如图5所示，条带最亮的为GDMCC 3.441(图5A泳道5)，其次为GDMCC 3.405(图5B泳道2)，其余条带较弱不予考虑。
将筛选出的GDMCC 3.441划线不含抗生素的PDA平板，待长出菌丝后分别挑取部分菌丝于液体LB培养基中37℃摇瓶培养1-2天后取部分菌液离心收集菌体，16S rRNA验证，结果表明并没有成功分离出该内生菌。
AnEp8-R75质粒电转效果不稳定，因此尝试在R75序列两端添加部分RPL9序列以及DNA复制解旋酶序列得到新的序列R75flank，包含完整的RPL9及DNA复制解旋酶序列，位于伯克霍尔德氏菌HKI454基因组1272234-1274378bp位置。根据R75flank及线性载体设计连接引物R75flank-F/R，以GDMCC 3.441为模板扩增R75flank片段，如图6A泳道2所示得到2.25Kb片段，并将其克隆至AnEp8-AnHyg-deleteAMA1线性载体，得到新的质粒AnEp8-R75flank3.441(来源于GDMCC 3.441)并电转黑曲霉，转化后生长2个转化子，对这2个转化子以Not I-F/R引物验证，电泳结果如图6B泳道1和2所示，AnEp8-R75flank3.441的1号样品有2.5Kb左右条带，PCR产物进行Sanger测序。
测序结果如图7所示，R75flank3.441全长2153bp，比对R75flank序列相似度为94％，部分碱基突变，经NCBI数据库比对与伯克霍尔德氏菌HKI454基因组相似度同样为94％，在557-567bp下游链处(5’-ATTGTCGATTA-3’)、1953-1963bp处(5’-TTTTTCAAGTT-3’)、1599-1609bp下游链处(5’-TTTTTTTTGTT-3’)均与ARS保守序列仅相差3个碱基，无特殊结构。
4转化子验证
4.1质粒拷贝数验证
实时荧光定量PCR(qPCR)利用插入性染料如SYBR Green I监测PCR过程中的荧光信号，通过Ct值(起始阈值)对不同样品的起始DNA水平进行定量分析，Ct值越高，模板的初始量越少。加入到PCR体系中的荧光染料仅能与双链DNA结合激发绿色荧光，随着目的片段的增加，荧光信号也逐渐增强，但由于荧光染料可以与任何双链DNA结合，无法区分引物二聚体或非特异性扩增产物，就需要利用熔解曲线对引物特异性进行检测。熔解曲线为荧光信号变化与温度的关系图，在PCR过程中，当达到双链产物的熔解温度(Tm)时，随着双链解开，荧光信号会急速下降，随着温度继续升高，荧光信号逐渐减弱至最低，当引物为特异性扩增时，仅会出现单个熔解峰图，否则为非特异性扩增。为了分析四种质粒转化黑曲霉后的潮霉素基因相对表达差异，需要选择内参基因进行标准化。对于一些常见的样品类型如外周血、肺癌组织、肝癌组织等，内参基因的选择已经做了大量研究，常见的内参基因有Actin、GAPDH、18S rRNA等，而对黑曲霉基因组中的内参基因研究较少，K.Bolhe等比较了黑曲霉基因组中的10种候选基因，其中Actin、sarA、cox5这三种基因表达稳定，Actin在真核细胞中高度保守，也是细胞骨架的主要成分。
以Actin作为黑曲霉内参基因，针对该基因以及Hyg基因在NCBI上设计qPCR引物，以携带AMA1及R75flank3.441复制子质粒电转得到的阳性黑曲霉基因组为模板，参照Takara TBPremix DimerEraserTM(Perfect Real Time)试剂盒说明书，以Actin作为内参基因进行归一化处理，进行两个样品中的Hyg基因表达相对定量，每个样品做三个复孔，以ddH2O为模板做阴性对照，LightCyler 96软件进行数据分析，ΔΔCT法计算相对表达量差异。计算公式如公式1所示。
相对表达量＝2-ΔΔCT 公式1
式中，ΔΔCT＝[Ct Hyg(未知样品)-Ct Actin(未知样品)]-[Ct Hyg(对照样品)-CtActin(对照样品)]。qPCR体系如表9所示，qPCR程序如表10所示。
表9qPCR体系
表10qPCR扩增程序
/>
4.2质粒稳定性验证
将两种保种后的黑曲霉菌株从-80℃拿出，冰上自然解冻，划线不含潮霉素抗性的PDA平板，28℃暗培养至长出较大单菌落后，在超净工作台中用枪头挑取部分菌体至200μL无菌ddH2O中吹打混匀，吸取200μL孢子悬浮液涂布至铺有玻璃纸的PDA无抗固体培养基上，28℃暗培养1-2d至玻璃纸上长满白色菌丝，液氮研磨法提取基因组。
以提取的真菌基因组为模板，infusionAnEp8-F/R引物扩增，1％琼脂糖凝胶电泳验证潮霉素片段，若条带正确，挑取部分经第一次转化PDA后生长的菌丝至不含潮霉素的PDA固体培养基进行第二次转接，挑取菌丝提取基因组验证潮霉素片段，一直重复此步骤直到无潮霉素片段，验证两种质粒对潮霉素的药物抗性。
4.3质粒承载量验证
与细菌人工染色体(BAC)可承载300Kb外源片段相比，目前的真菌人工染色体(FAC)可连接的外源片段最大为150Kb，复制子可连接的外源片段越大，表达外源蛋白的种类及潜力也会越大。
4.3.1质粒构建
选取枯草芽孢杆菌基因组为模板设计Infusion引物扩增出4Kb、10Kb及16Kb片段，1％琼脂糖凝胶电泳验证并胶回收目的片段。4Kb目的片段使用M4i-F/R引物，10Kb目的片段使用M10i-F/R引物，16Kb目的片段使用M16i-F/R引物，引物序列见表13。使用STE法提取枯草芽孢杆菌基因组，具体步骤如下。
(1)取适量过夜培养的枯草芽孢杆菌菌液于1.5mL离心管中，12000rcf离心1min，弃上清，控制菌体湿重在30mg左右。
(2)向菌体中加入600μL 1×STE缓冲液及60μL溶菌酶(200mg/mL)，吹吸混匀，加入研磨管研磨20s(10s冰育1次)，短暂离心后取上清至新的离心管中。
(3)加入1％SDS、1.2μL RNAseA(100mg/mL)、9.6μL蛋白酶K(25mg/mL)至上清中，吹打混匀。
(4)将离心管置于65℃水浴锅中水浴30min，每5min间或混匀。
(5)加入等量苯酚于离心管中，20000rpm 4℃离心10min，取上清至新的离心管中。
(6)加入等量氯仿，20000rpm 4℃离心10min，取上清至新的离心管中。
(7)加入两倍体积的冷乙醇及4μL核酸助沉剂，20000rpm 4℃离心10min，弃上清。
(8)向沉淀中加入1mL 70％乙醇轻轻吹打沉淀，20000rpm 4℃离心1min，弃上清。
(9)开盖室温晾置沉淀至透明，100μL无菌ddH2O溶解，NanoDrop测浓度，-20℃保存。
对于AnEp8-AnHyg质粒使用Takara Mlu I内切酶做单酶切，AnEp8-R75flank3.441质粒使用Takara Kpn I内切酶做单酶切，酶切条件参考Takara说明书，使用Takara In-Fusion Snap Assembly cloning kits连接目的片段和线性载体，摩尔比为2：1。连接体系转化至stbl3化学感受态细胞，菌落PCR验证连接片段，4Kb片段验证使用Not I-F/R引物(4503bp)，10Kb片段验证使用10K-F/R引物(1102bp)，16Kb片段使用16K-F/R引物验证(1894bp)，引物序列见表13。
4.3.2转化黑曲霉及转化子验证
所有质粒构建成功后电击转化至黑曲霉孢子，每个处理重复3次，培养5-6天观察转化子生长情况及个数，对转化子进行潮霉素及连接片段验证，潮霉素验证使用infusionAnEp8-F/R引物(1366bp)，4Kb片段验证使用4K-F/R引物(1261bp)，10Kb及16Kb片段验证引物同4.3.1。
4.4质粒拷贝数分析
以两种黑曲霉基因组为模板，qPCR Act-F/R、qPCR Hyg-F/R引物分别扩增目的片段验证引物特异性，引物序列见表13，扩增产物分别为105bp和150bp，熔解峰图如图8所示，分别在83℃和88℃出现单峰，证明引物为特异性扩增。
对两种样品的内参基因及Hyg基因Ct值统计分析，结果如表11所示，阳性对照样品AnEp8-AnHyg黑曲霉中Hyg基因表达丰度最高，三次重复的平均Ct值为13.45±0.12，AnEp8-R75flank3.441黑曲霉中Hyg基因三次重复的平均Ct值为17.68±0.71。根据公式1计算得2-ΔΔCt(3.441/AnHyg)＝0.036。如图9所示，两种黑曲霉中Hyg基因表达量比例为1：0.036，结果表明R75flank3.441复制子同样可以在黑曲霉中发挥复制功能。
表11两种样品Actin和Hyg基因Ct值分析
4.5质粒稳定性分析
转接结果如图10所示，AnEp8-AnHyg质粒在不含潮霉素B筛选抗性的PDA平板上转接9次后抗性基因丢失，而AnEp8-R75flank3.441质粒在转接九次后抗性基因仍然存在，表明与AMA1复制子相比，R75flnk3.441复制子稳定性较强。
4.6质粒承载量分析
4.6.1质粒构建结果
质粒构建结果如图11、12、13所示，两种质粒都成功连接4Kb、10Kb及16Kb外源片段，目的片段条带均与理论大小相同，测序结果显示无碱基突变，使用康为EndoFreePlasmid Midi Kit提取质粒，备用。
4.6.2转化子生长情况
所有质粒都成功转化黑曲霉，生长五天后结果如图14所示，统计表如表12所示。从生长情况来看，携带4Kb、10Kb和16Kb外源片段的AnEp8-AnHyg质粒转化黑曲霉后分别长出72、13和3个转化子，与AnEp8-AnHyg原质粒转化后生长的112个转化子相比数量逐渐减少；而携带4Kb外源片段的AnEp8-R75flank3.441质粒转化后长出1个转化子，携带10Kb和16Kb的两种质粒转化黑曲霉后无转化子长出，原质粒转化后长出1个转化子。
表12含外源片段质粒的黑曲霉转化子个数
数据以平均值±标准差显示，＊表示具有统计学显著性，P分别＜0.05(＊)，＜0.01(＊＊)，＜0.001(＊＊＊)，＜0.0001(＊＊＊＊)，ns表示无显著性差异。
4.6.3转化子验证情况
验证结果如图15、16所示，挑取的五个AnEp8-AnHyg-4Kb和五个AnEp8-AnHyg-10Kb黑曲霉单菌落中均有四个为阳性转化子，潮霉素验证及连接片段验证都与目的片段理论大小一致，挑取的三个AnEp8-AnHyg-16Kb黑曲霉单菌落中潮霉素片段正确，片段验证中只有个1为阳性转化子，猜测16Kb片段过大，在转化黑曲霉过程中丢失；挑取的AnEp8-R75flank3.441-4Kb单菌落出现潮霉素片段正确但连接片段丢失的现象，但总体来说复制子可以承载4Kb外源片段。
表13引物序列
/>
/>
序列表
<110> 福州大学
<120> 一种丝状真菌复制子
<130> 2022
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctcgtgggc tcggtcacga atcaggacat cgccgtcgcg ctcaagcaac aaggcttcga 60
cgtcgaaaag gcacaggtgc gcctgtcgca aggtccgctg aagatcgtgg gtgatcatcc 120
ggtgcaagtg gcgctgcaca ccgacgtggt gacggacatt acggtgtcgg tgctcggcga 180
gcacgcgtaa gatcgctgcg caccttcggg tgtcgcatgc aagcaggatc cgggtaaccg 240
gttcctgctt ttttttgttt catgccattg cgtgaatggc tgaatgaccg ataatcggtg 300
cccatgaacg cttcaaatca cgatccgcaa cttgagtcac tgaaggtccc gccgcattcg 360
atcgaggccg agcagtcggt gcttggcggt ttactgctcg acaacggcgc gtgggaccgg 420
attgcggact tcctgggtca ccaggatttc tatcgctttg atcaccggct gatctacgag 480
cacatcggca agctgattgc cacgtcgcgg ccggccgatg tgatcacggt gttcgagtca 540
ttgtccaccg cgggcaaggc ggacgatgtc ggcggccttg cctatctgaa tgcgctcgcg 600
cagaacacgc cgagcgcggc gaacatccgc cggtatgccg agatcgtgcg cgaccgtgca 660
gtgttgcgca agctggtgac cgttgccgac gagattgccg gcgacgcgtt caatccgcag 720
ggcaaggagg tccggacgct gccgacgagg ccg 753
<210> 2
<211> 2153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatccctcgg aagtaatggg cgctgacaca aaagtgcagt attgtacctg ggcgttgcca 60
gcctgcgcga catacaatac gcgtgctgct gaggcacggc gcagcagcag ggtgacacgc 120
gcgatcgagc gagcataaat gagcgacgtt aaagacaaat cccagttatt cgctgtcgta 180
gaacgtcgac acgccagcaa aattatcgaa tttcgtgtac ggtcctagga acgtcaggcg 240
aacgggccca atgggtccgt tccgttgctt gccgataatg atctcggccg ttcccttgtc 300
ggggctgtcc gggttgtaaa cctcgtcgcg ataaataaac aggatcacgt ccgcatcctg 360
ttcgatcgcg ccagattcgc gcaggtccga catgaccgga cgcttgttcg gccgctgctc 420
caggccccgg ttcaactgag atagcgcgat gaccggcacg tcaagctcct tggccagtcc 480
cttgagtgag cgcgaaatct cggagatctc tgtcgcgcgg ttctcgcccg gcgacgagcc 540
agtcatgagt tgcagataat cgacaataat caagcctagc ttgccgcact gacgcgctag 600
ccgccgtgcc cgcgagcgca attccatcgg attgagcccg cccgtctcgt cgataaagat 660
ttgcgcttca ctcattttct gcaccgcgtg cgtgagcttg ggccaatcct cgtcggtcag 720
ccgcccggta cgcatccggt gttggtcgag ccggccaatc gagccgagca tccgcatcac 780
aagttgcgtg cccggcattt ccatcgaaaa caccgcgacc ggcaaaccat actcgactgc 840
gacgtattca ccgatgttca tcgaaaatgc agttttgccc atcgatggcc gtccggcaac 900
aatgatcaac tcgccgccgt gcatcccgga ggtcatccgg tccaggtcga taaagccggt 960
cggcgtgccg gtcacatcgc tcggattcgc cgtgtggtac agcgtgtcga tccgctcgac 1020
tacttgtgtc agcaacggcc caatttcgag aaacccttgc gtgccacgct gaccttcctc 1080
cgcgattgag aagacctttg cctcggcctc gtcgagcagc tgccggacct ccttgccctg 1140
cggattgaac gcgtcgccgg caatctcgtc ggcaacggtc accagcttgc gcaacactgc 1200
acggtcgcgc acgatctcgg cataccggcg gatgttcgcc gcgctcggcg tgttctgcgc 1260
gagcgcattc agataggcaa ggccgccgac atcgtccgcc ttgcccgcgg tggacaatga 1320
ctcgaacacc gtgatcacat cggccggccg cgacgtggca atcagcttgc cgatgtgctc 1380
gtagatcagc cggtgatcaa agcgatagaa atcctggtga cccaggaagt ccgcaatccg 1440
gtcccacgcg ccgttgtcga gcagtaaacc gccaagcacc gactgctcgg cctcgatcga 1500
atgcggcggg accttcagtg actcaagttg cggatcgtga tttgaagcgt tcatgggcac 1560
cgattatcgg tcattcagcc attcacgcaa tggcatgaaa caaaaaaaag caggaaccgg 1620
ttacccggat cctgcttgca tgcgacaccc gaaggtgcgc agcgatctta cgcgtgctcg 1680
ccgagcaccg acaccgtaat gtccgtcacc acgtcggtgt gcagcgccac ttgcaccgga 1740
tgatcaccca cgatcttcag cggaccttgc gacaggcgca cctgtgcctt ttcgacgtcg 1800
aagccttgtt gcttgagcgc gacggcgatg tcctgattcg tgaccgagcc gaacagacgg 1860
ccatcgacac ccgacttctg cgtaatctgc agcgttaggc cggccagctt ctcgccctga 1920
gcctgcgcag cggccagctt gtcggccgcg attttttcaa gttccgcacg gcgcacttcg 1980
aattcggcga tcgcgtcctt cgtcgcacgg cgagccttgc gcagcggaat caggaagtta 2040
cgtgcgtagc cgtccttgac cttgatgatg tcgcccagat taccgagttt agcgactttt 2100
tccaacaaaa taacttgcat tcgaattctc cttgatcgac gcccgcggcc gcg 2153

Claims (1)

1.一种丝状真菌复制子，其特征在于，所述复制子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
CN202210598346.0A 2022-05-30 2022-05-30 一种丝状真菌复制子 Active CN114875046B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210598346.0A CN114875046B (zh) 2022-05-30 2022-05-30 一种丝状真菌复制子

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210598346.0A CN114875046B (zh) 2022-05-30 2022-05-30 一种丝状真菌复制子

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114875046A CN114875046A (zh) 2022-08-09
CN114875046B true CN114875046B (zh) 2023-07-18

Family

ID=82680553

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210598346.0A Active CN114875046B (zh) 2022-05-30 2022-05-30 一种丝状真菌复制子

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114875046B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1259167A (zh) * 1997-04-07 2000-07-05 尤尼利弗公司 农杆菌介导的霉菌特别是属于曲霉菌属的霉菌的转化
CN1324402A (zh) * 1998-10-26 2001-11-28 诺维信公司 在丝状真菌细胞内构建和筛选目的dna文库
WO2003070956A1 (en) * 2002-02-19 2003-08-28 Novozymes A/S Expression cloning methods in filamentous fungi
CN103275981A (zh) * 2013-05-27 2013-09-04 华南理工大学 丝状真菌蛋白分泌压力反馈调控元件与抗反馈抑制的启动子、质粒及制备方法和转化细胞
CN109957576A (zh) * 2019-03-25 2019-07-02 华南理工大学 一种能实现碱基精确点突变的pFC330-BEC质粒及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1259167A (zh) * 1997-04-07 2000-07-05 尤尼利弗公司 农杆菌介导的霉菌特别是属于曲霉菌属的霉菌的转化
CN1324402A (zh) * 1998-10-26 2001-11-28 诺维信公司 在丝状真菌细胞内构建和筛选目的dna文库
WO2003070956A1 (en) * 2002-02-19 2003-08-28 Novozymes A/S Expression cloning methods in filamentous fungi
CN103275981A (zh) * 2013-05-27 2013-09-04 华南理工大学 丝状真菌蛋白分泌压力反馈调控元件与抗反馈抑制的启动子、质粒及制备方法和转化细胞
CN109957576A (zh) * 2019-03-25 2019-07-02 华南理工大学 一种能实现碱基精确点突变的pFC330-BEC质粒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114875046A (zh) 2022-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104560742A (zh) 农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株及其制备方法和应用
Liang et al. A high efficiency gene disruption strategy using a positive–negative split selection marker and electroporation for Fusarium oxysporum
WO2017186026A1 (zh) 一种高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法
CN114540406B (zh) 基因组编辑表达框、载体及其应用
CN104673819A (zh) 一种用于敲除l-乳酸脱氢酶1基因的载体及构建方法
CN114875046B (zh) 一种丝状真菌复制子
Liu et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation: An efficient tool for insertional mutagenesis and targeted gene disruption in Harpophora oryzae
CN104212787A (zh) 一种竹节参β-香树素合酶基因及其应用
EP2267126A1 (en) Process for the stable gene interruption in clostridia
CN114958899A (zh) 一种能在黑曲霉细胞内自主复制的复制子
CN108949784B (zh) 芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用
CN116103291B (zh) 一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的tsRNA及其应用
CN101525580B (zh) 一种双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母及其构建方法
CN105505933B (zh) 新型节杆菌启动子序列及其应用
AU2020102683A4 (en) Recombinant broad-spectrum Metarhizium and its use for promoting plant root growth
CN111349649B (zh) 一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用
Aimi et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of the white root rot ascomycete Rosellinia necatrix
CN117126818B (zh) 利用ABE构建gE基因缺失PRV毒株的方法和应用
CN109913378B (zh) 重组广谱性绿僵菌及其用于促进植物根系生长的用途
CN113913448B (zh) 一种提高甲基营养菌吡咯喹啉醌产量的方法及应用
CN112501171B (zh) 两条特异性靶向猪Pax7基因的sgRNA导向序列及应用
JP3910248B2 (ja) トランスポゼースを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法
CN107129996A (zh) 一种质粒载体及其构建方法和应用
CN115873884A (zh) 一种检测青枯菌种内侵染动态的等位基因标记方法
JP2986437B2 (ja) 新規ベクター

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant