CN116103291B - 一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的tsRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的tsRNA及其应用。本发明提供一种用于调控斑点落叶病抗性的tsRNA，其为mdm‑tsRVal，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供所述mdm‑tsRVal在改良苹果品种的应用，通过将mdm‑tsRVal改良为人工miRNA(amitsRVal)，将其序列构建到植物表达载体上，导入苹果斑点落叶病感病苹果品种中，可提高转基因植株的抗病性。由于mdm‑tsRVal是苹果内源非编码RNA，并通过调控苹果本身的基因发挥功能，相比转入外源抗性基因的苹果植株所生产的苹果更安全，易被消费者接受。

Description

一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的tsRNA及其应用
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域，具体说是一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的tsRNA及其应用
背景技术
转运RNAs(tRNAs)在细胞核中由前体tRNAs(pre-tRNAs)通过RNA聚合酶III的转录产生，除了在蛋白质合成中的经典功能外，tRNA可以被裂解产生tRNA衍生的小RNA，即tsRNAs。tsRNAs可以作为重要的调控因子在植物体内发挥作用，在植物生物胁迫、非生物胁迫等逆境下被诱导，然而tsRNAs在调控真菌病害抗性的相关研究较少。
苹果早期落叶病严重威胁着全球苹果产业的可持续发展。其中，Alternariaalternata sp.mali(ALT1)是苹果产区常见的引起苹果斑点落叶病病原物，会引起苹果叶片的黑褐色斑点和提前落叶。当真菌侵染苹果时，通常会产生毒素和效应子激活植物抗病途径，叶片上会出现褐色或黑色的叶斑，迅速蔓延，导致叶片提前脱落。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的tsRNA及其应用。本发明以感病品种‘金冠’为试材，利用small RNAs二代高通量测序筛选出接种苹果斑点落叶病A1ternaria alternata sp.mali(ALT1)前后表达差异2倍以上的tsRNA，获得一个新的tsRNA，将其命名为mdm-tsRVal。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的tsRNA(命名为mdm-tsRVal)，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0：1所示。
一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的tsRNA的初级转录本(命名为Md-tRNA-Val)，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的tsRNA的靶基因(命名为MdTIR)，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
一种包含用于调控苹果斑点落叶病抗性的tsRNA的人工miRNA(命名为amitsRVal)，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
一种基因表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求4中所述的人工miRNA。
一种表达载体，其特征在于，所述表达载体上携带有权利要求5所述的表达盒。该表达盒用于吸附并沉默mdm-tsRVal，即抑制mdm-tsRVal在苹果斑点落叶病感病植株中的表达。
一种工程菌，其特征在于，所述工程菌中含有权利要求6所述的表达载体。
一种提高苹果植株对苹果斑点落叶病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将上述人工miRNA(amitsRVal，序列如SEQ ID NO:4所示)插入pFGC5941载体上的BamHI和NcoI两个酶切位点中，即将上述人工miRNA构建到pFGC5941载体的NcoI和BamHI酶切位点之间得到质粒；
S2：将S1构建的质粒转入农杆菌中，涂布于加有抗生素的固体YEP培养基上，将平板于28℃倒置培养24-48h；上述抗生素包含50mg/L Km，20mg/L RifS7：经S6培养的农杆菌挑取单斑，加入包含50mg/L Km，20mg/L Rif的YEP液体培养基2ml，28℃，180rpm培养过夜；
S3：取80μL经S3培养的农杆菌菌液，加入包含50mg/L Km，20mg/L Rif及10μM乙酰丁香酮的YEP液体培养基4ml，28℃，180rpm培养12-16h；
S4：将经S3培养的农杆菌菌液室温10000rpm离心1min，除去培养基；用1-2ml悬浊液经涡旋震荡悬浮上述菌液；取经震荡悬浮的菌液10μL加入990μL悬浊液得菌体悬浊液，中用分光光度计测定其OD600，将菌体悬浊液调整至OD600＝1.0，室温静置2-5h；上述悬浊液中包括：pH调至5.2的10mM MES-KOH，10mM MgCl2，100μM乙酰丁香酮；
S5：将S4得到的菌液使用前经涡旋震荡或移液枪吸打悬浮菌体，然后用没有针头的1mL注射器吸取上述菌液，避开叶脉，用上述1mL注射器针在苹果叶片上开小孔后，将菌体液注射入叶片中，每个叶片注射1-2个孔；
S6：注射农杆菌3天后观察叶片。
一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的tsRNA的初级转录本的应用，其特征在于，包括以下步骤：
采用上述提高苹果植株对苹果斑点落叶病抗性的方法，将上述初级转录本构建到pFGC5941载体的NcoI和BamHI酶切位点之间，采用农杆菌介导的方法，在感病苹果品种中瞬时表达。
一种人工miRNA在改良苹果品种中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
采用上述提高苹果植株对苹果斑点落叶病抗性的方法，将上述人工miRNA构建到pFGC5941载体的NcoI和BamHI酶切位点之间，采用农杆菌介导的方法，在感病苹果品种中瞬时表达。
本发明所述的一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的tsRNA及其应用，其有益效果为：
通过将人工miRNA(amitsRVal)序列构建到植物表达载体上，导入苹果斑点落叶病感病苹果品种中，可提高转基因植株的抗病性。mdm-tsRVal是苹果的内源非编码RNA，通过调控苹果本身的基因发挥功能，相比转入抗性基因的苹果植株生产的苹果更安全，易被消费者接受。本发明提供的方法快速、灵敏，准确性高，简便，能够应用于苹果属植物。
附图说明
本发明有如下附图：
图1为本发明实施例1mdm-tsRVal在感病品种‘金冠’里接菌后的积累实验结果图；
图2为本发明实例1mdm-tsRVal的前体Md-tRNA-Val二级结构以及克隆凝胶电泳图；
图3为发明实例1mdm-tsRVal的靶基因MdTIR图；
图4为为本发明实例2中利用amitsRVal沉默mdm-tsRVal提高感病品种‘金冠’抗病性实验结果图；
图5为本发明实施例2沉默mdm-tsRVal增强感病品种‘金冠’抗病性实验结果图；
图6为本发明实例2在感病品种‘金冠’中过表达mdm-tsRVal的前体Md-tRNA-Val实验结果图；
图7为本发明实施例2过表达mdm-tsRVal的前体OE-Md-tRNA-Val降低感病品种‘金冠’抗病性实验结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，MolecularCloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
各实验所需引物包括：
mdm-tsRVal克隆引物：
mdm-tsRVal特异反转录引物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCGACT-3’。
mdm-tsRVal克隆引物：F 5’-CCGGTCTGGGTGGTGTAG-3’R5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。
Northern blot使用的探针：
mdm-tsRVal northern blot使用的探针：5’-CCGACTACACCACCCAGAC-3’。
内参U6 northern blot使用的探针：5’-CTCGATTTATGCGTGTCATCCTTGC-3’。
PCR克隆使用的引物：
Md-tRNA-Val克隆引物：F 5’-GTCTGGGTGGTGTAGTCG-3’和R 5’-TGTCTAAGCCCGGTTTCG-3’。
MdTIR克隆引物：F 5’-ATGAGTTTGTATGCTTCTTCTG-3’和R 5’-TCAGTGAGCTCTTGTCGTCC-3’。
5’RACE使用的引物：
5’RACE使用的引物，Adaptor 5’-TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGG-3’，F 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’，R1 5’-TCAGTGAGCTCTTGTCGTCC-3’，R2 5’-CTCCCAGCAATTCCCCTGAT-3’。
荧光定量PCR使用的引物：
Md-tRNA-Val引物：F 5’-GTCTGGGTGGTGTAGTCG-3’和R 5’-TGTCTAAGCCCGGTTTCG-3’。
MdTIR引物：F 5’-TCACCTGCCCTTTTGGAAGC-3’和R 5’-TATGGCCCCACGACATTTGA-3’。
内参Md-ACTIN：F 5’-TGACCGAATGAGCAAGGAAATTACT-3’和R 5’-TACTCAGCTTTGGCAATCCACATC-3’。
实施例1mdm-tsRVal的发现：
以感病品种‘金冠’为试材筛选接种苹果斑点落叶病Alternaria alternatasp.Mali(ALT1)前后表达差异2倍以上的small RNAs，获得一个新的tsRNA，将其命名为mdm-tsRVal(SEQ ID NO：1)，如图1A(Small RNAs二代测序中mdm-tsRVal在未接菌与接种ALT1的‘金冠’里的读数)所示，并获得mdm-tsRVal初级转录本初级转录本Md-tRNA-Val(SEQ IDNO：2)，其二级结构如图2A(mdm-tsRVal的前体Md-tRNA-Val的二级结构示意图)所示。由于苹果感病品种叶片接种ALT1后mdm-tsRVal的表达会明显升高，因此可利用mdm-tsRVal序列开发一种提高苹果抗病性的方法。
具体方法如下：
1、植物总RNA提取
(1)苹果‘金冠’各组织样品取1g在液氮中快速研磨，然后转入装有预热的CTAB(990μL)和β-巯基乙醇(10μL)的2mL离心管中，震荡混匀后65℃水浴10min；
(2)加入1000μL CI(氯仿/异戊醇体积比＝24:1)，颠倒混匀1min；
(3)4℃13000rpm 10min；
(4)取上清，加入等体积的CI，颠倒混匀1min；
(5)4℃13000rpm 10min；
(6)将上清转入另一个1.5mL的离心管中，再加入1mL的异丙醇，-20℃存放1小时以上。
(7)4℃10000rpm 10min，然后弃上清并将液体吹干；
(8)加入75％乙醇清洗沉淀2次；
(9)13000rpm离心10min，弃上清并将离心管倒扣在吸水纸上晾干，最终溶解在40μL无菌水中。
总RNA中DNA的去除：
(1)在1.5mL PCR管中加入以下成分：
RNA：2μg；DNA酶缓冲液：5μL；RNA酶抑制剂：2μL；DNA酶：2μL；DEPC水：补足至40μL。
(2)按照以上体系混匀后37℃处理30min；加入100μL无RNase水(0.1％DEPC处理后的水)；加入等体积CI混匀；
(3)4℃13000rpm离心20min；取上清加入等体积CI颠倒混匀，4℃13000rpm离心20min；
(4)取上清，2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀2h；4℃，13000rpm离心20min；弃上清，沉淀吹干后加入75％乙醇清洗，13000rpm离心5min；
(5)低温下吹风机吹干沉淀，然后溶于30-50μL DEPC水或无RNase水中，-80℃保存；
(6)1％琼脂糖凝胶电泳检测完整性，紫外分光光度计测260nm处吸光度计算RNA浓度。
2、逆转录反应体系及步骤
(1)逆转录反应体系如下：RNA 2μg，oligo dT反转引物(10μM)0.5μL，5×RTBuffer 2μL，dNTPs 1μL，RNase Inhibitor 0.5μL，gDNA Pure 0.5μL，ReverseTranscriptase：0.5μL，DEPC水：补足至10μL。
(2)冰上加样并混匀，短暂离心，42℃30min。
(3)反转录产物冷却后放入-20℃冰箱保存或直接用于PCR反应。
3、PCR反应体系及步骤
(1)设计Md-tRNA-Val特异引物(F GTCTGGGTGGTGTAGTCG RTGTCTAAGCCCGGTTTCG)和MdTIR特异引物(FATGAGTTTGTATGCTTCTTCTG R TCAGTGAGCTCTTGTCGTCC)。
(2)PCR反应体系如下：2×taq PCR Mix 25μL，引物F和R各1μL，反转录产物2μL，DEPC水补足至50μL。冰上加样并混匀，短暂离心。
(3)在Bio-RAD PCR仪进行反应，程序如下：95℃3min，94℃15s，60℃30s，72℃30s，72℃5min，共36个循环。
(4)PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测，Md-tRNA-Val检测结果如图2B所示，MdTIR检测结果如图3A所示。
4、tsRNA northern blot法检测
合成5’端修饰地高辛标记的mdm-tsRVal和U6探针(mdm-tsRVal_probe：CCGACTACACCACCCAGAC；U6_probe：CTCGATTTATGCGTGTCATCCTTGC)。取60μg RNA(CTAB提取)加入2×loading buffer，95℃5min，然后4℃冷却，上样于15％聚丙烯酰胺凝胶(含7M尿素)，1×TBE buffer中100V电泳3h；1×TBE buffer中300mA，4℃电转于尼龙膜上；1200mJ紫外交联2min，利用地高辛杂交检测试剂盒(Mylab corporation)进行预杂交、杂交、洗膜和信号检测，检测结果如图1B(Northern Blot检测接种ALT1后48小时，mdm-tsRVal在‘金冠’里的表达量，以不接菌和接种无菌水48小时表达量作为对照)所示。
5、5’RACE验证切割靶基因
(1)总RNA经基因特异性引物R1逆转录，获得cDNA，加乙醇沉淀1小时。4℃，12000rpm，离心20min。
(2)用50μL DEPC水溶解，将cDNA纯化，去除其中的dNTP及其他离子。
(3)纯化后的cDNA进行末端磷酸化酶(TdT)处理。加150μLDEPC水后再加入等体积200μL CI混匀，4℃12000rpm离心10min。
(4)取上清加入等体积CI颠倒混匀，4℃12000rpm离心10min。
(5)取上清，加入5μL的3M NaOAC(PH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀1小时。
(6)4℃12000rpm离心20min。
(7)弃上清，用75％的冷乙醇清洗沉淀，吹干后溶于20μL无菌水中，-70℃保存备用。
(8)TdT处理后的加C尾产物为模板进行巢式PCR反应。
(9)PRC反应体系如下：2×taq PCR Mix 25μL，引物Adaptor和R1各1μL，TdT处理后的加C尾产物2μL，DEPC水补足至50μL。冰上加样并混匀，短暂离心。
(10)在Bio-RAD PCR仪进行反应，程序如下：95℃3min，94℃15s，60℃30s，72℃30s，72℃5min，共36个循环。
(11)以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR反应，反应体系如下：2×taq PCRMix 25μL，引物F和R2各1μL，第一轮PCR产物2μL，DEPC水补足至50μL。冰上加样并混匀，短暂离心。
(12)在Bio-RAD PCR仪进行反应，程序如下：95℃3min，94℃15s，60℃30s，72℃30s，72℃5min，共36个循环。
(13)PCR产物经琼脂糖凝胶回收，T-A克隆到pMD19-T中，送样测序。结果如图3B(mdm-tsRVal切割MdTIR的5’RACE示意图)。
实施例2用于调控苹果斑点落叶病抗性的基因mdm-tsRVal的获得
按照所提供的mdm-tsRVal序列的人工miRNA序列(amitsRVal，序列如SEQ ID NO:4所示)，在生物公司合成此核酸序列，将此序列插入到pFGC5941载体的NcoI和BamHI酶切位点之间，即将上述人工miRNA构建到pFGC5941载体的NcoI和BamHI酶切位点之间得到质粒，如图4A(沉默mdm-tsRVal的amitsRVal载体示意图)用来沉默内源mdm-tsRVal。农杆菌介导(GV3101)的瞬时表达感病品种‘金冠’苹果组培苗叶片，3d后检测结果表明，mdm-tsRVal表达量降低，接种ALT1 2d后，叶片发病率显著降低并且病症较轻。说明在感病品种‘金冠’中沉默mdm-tsRVal可以增强感病品种抗病性。
具体方法如下：
1、PCR扩增：
(1)设计amitsRVal带有同源臂的引物(F ttacatttacaattaccatggAGGTATGGGTGGTATCGTAGTCG R ctctagactcacctaggatccAGGTCTGGGTGGTATGGTAGTCG)。
(2)PCR反应体系如下：2×taq PCR Mix 25μL，引物F和R各1μL，合成amitsRVal质粒2μL，DEPC水补足至50μL。冰上加样并混匀，短暂离心。
(3)在Bio-RAD PCR仪进行反应，程序如下：95℃3min，94℃15s，60℃30s，72℃30s，72℃5min，共36个循环。
(4)PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测回收。
2、目的片段回收：
使用诺维赞公司回收试剂盒，方法参照说明书。
(1)切取含有目的序列片断的琼脂糖，尽量切除多余凝胶，加入600μLBuffer B2，60℃水浴10min，直至凝胶块完全熔化。
(3)将混合液转移到柱形分离纯化柱中，12,000×g离心60s，倒掉收集管中的废液。
(4)向纯化柱中加入300μl Buffer B2,静置1min，12,000×g离心30s，倒掉收集管中的废液。
(5)向纯化柱中加入500μl Wash Buffer,12,000×g离心30s，倒掉收集管中的废液。
(6)重复一次。
(7)空离2min后置于通风橱吹5min。
(8)取一新的1.5ml离心管，将纯化柱放于新1.5ml离心管中，加入55℃预热好的TEBuffer 30μL，室温放置2min，12,000×g离心60s。
(9)弃去吸附柱，回收产物插于冰上用于后续连接。
3、酶切：
使用Thermo公司快切酶NcoⅠ和BamHⅠ对载体pFGC5941进行酶切，具体酶切反应体系如下：
短暂离心后在37℃水浴反应3h后按步骤2进行回收。
4、同源重组连接：
使用诺维赞公司同源重组试剂盒，连接体系如下：
短暂离心后在37℃水浴反应30min，插于冰上。
5、大肠杆菌DH5α转化流程：
将连接后的载体10μL加入30μL大肠杆菌DH5α中，冰浴30min，42℃热激30s，冰浴2min后添加液体LB培养基200μL，置于37℃摇床，200rpm摇40-60min后，室温10,000rpm离心1min。吸去上清200μL，利用剩余液体悬浮菌体，涂布于LB+Amp固体培养基上，至于37℃烘箱过夜培养。
6、挑斑：
挑取过夜培养后的单一菌落于200μL LB+Amp液体培养基中，置于37℃摇床，200rpm摇3h。
7、菌液PCR：
上述体系以95℃，3min；95℃，1min；60℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；16℃，1min；35个循环。
1％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下检测PCR产物片段大小，挑选条带大小正确的菌液进行测序，经比对序列正确后即可得到用来沉默内源mdm-tsRVal的人工miRNA载体。参照上述人工miRNA构建到pFGC5941载体的NcoI和BamHI酶切位点之间得到质粒的方法，将Md-tRNA-Val(序列如SEQ ID NO:2所示)序列构建到pFGC5941载体上(NcoI和BamHI酶切位点之间)，如图6A(过表达Md-tRNA-Val载体模式图)，用来过表达内源mdm-tsRVal。农杆菌介导(GV3101)的瞬时表达感病品种‘金冠’苹果组培苗叶片，3d后检测结果表明，mdm-tsRVal表达量升高，接种ALT1 2d后，叶片发病率显著升高并且病症严重。说明在感病品种‘金冠’中过表达mdm-tsRVal可以降低感病品种抗病性。
具体方法如下：
1、农杆菌转化
(1)取一管制备好的感受态细胞，冰上完全溶解后轻轻悬浮细胞。
(2)加入5-10μL植物表达载体质粒，轻轻混匀，冰上放置30min。
(3)液氮中冷激1min。
(4)37℃热激5min，冰上放置2min。
(5)加入500μL YEP培养基，于28℃140rpm振荡培养4-6h。
(6)室温4000rpm离心3min，去除约400μL上清液，用剩余的培养基悬浮细胞。
(7)将细菌涂布在加有抗生素(50mg/L Kan，20mg/L Rif)的固体YEP培养基上。
(8)将平板于28℃倒置培养(48h)。
2、农杆菌介导的瞬时表达
苹果‘金冠’组培苗苗培养于25℃，50％湿度的光照培养箱中，昼夜长度保持为16-8h，光照强度为200μmol·m-2·s-1。待植株5-6片真叶展开时对每个单株编号并取一片真叶保存后进行农杆菌注射。农杆菌注射方法参见Bai等(Bai et al.2011)。
(1)预培养：YEP 2ml(50mg/L Kan，20mg/L Rif)，农杆菌菌斑或甘油菌28℃，180rpm培养过夜。
(2)本培养：YEP培养基4ml(加对应的抗生素和10μM乙酰丁香酮)，加入1/50体积的菌液(80μL)，28℃180rpm培养12-16h。
(3)室温8000rpm，5min离心，除去培养基，用1-2ml悬浊液悬浮菌体(可以涡旋震荡)。
(4)取10μL菌液加入990μL悬浊液中，用分光光度计测定OD600，将菌体悬浊液调整至OD600＝1.0。室温静置2-5h。
(5)悬浊液：(10mM MES-KOH(pH5.2)，10mM MgCl2,100μM乙酰丁香酮)。
(6)菌液使用前涡旋震荡或用枪吸打悬浮菌体，用没有针头的1mL注射器吸取菌液。
(7)避开叶脉，用注射器针在叶片上开小孔后，用装有菌液的注射器压住小孔，另一只手的手指在叶片反方向压住小孔，慢慢用力，将菌液注射入叶片中，注射好的部分的颜色会变浅。每个叶片注射1-2个孔。
(8)3天检测。mdm-tsVal Northern blot结果见图4B(农杆菌介导的瞬时表达感病品种‘金冠’组培苗3天后mdm-tsRVal的表达量，WT代表不进行瞬时表达‘金冠’组培苗；EV代表pFGC5941空载进行瞬时表达‘金冠’组培苗；amitsRVal代表沉默mdm-tsRVal的pFGC5941载体进行瞬时表达‘金冠’组培苗)。
3、荧光定量PCR反应体系及步骤
设计Md-tRNA-Val特异引物(F GTCTGGGTGGTGTAGTCG R TGTCTAAGCCCGGTTTCG)和MdTIR特异引物(F TCACCTGCCCTTTTGGAAGC R TATGGCCCCACGACATTTGA)用SYBR Green荧光定量预混液(TIANGEN，FP121221)在Applied Biosystems 7500进行荧光定量，PCR反应程序如下：95℃，15mins；95℃10sec，60℃30sec，共40个循环。结果利用2-ΔΔCt方法进行统计分析(Livak and Schmittgen，2001)。检测结果见图5A(农杆菌介导的瞬时表达amitsRVal感病品种‘金冠’组培苗3天后，其靶基因MdTIR的表达量),图6B(农杆菌介导的瞬时表达感病品种‘金冠’组培苗3天后Md-tRNA-Val的表达量，WT代表不进行瞬时表达‘金冠’组培苗；EV代表pFGC5941空载进行瞬时表达‘金冠’组培苗；OE-Md-tRNA-Val代表过表达的Md-tRNA-Val的pFGC5941载体进行瞬时表达‘金冠’组培苗)及图7A(农杆菌介导的瞬时表达OE-Md-tRNA-Val感病品种‘金冠’组培苗3天后，其靶基因MdTIR的表达量)所示。
4、对苹果叶片接菌
(1)在PDA培养基上暗培养7天ALT1。
(2)加入2mL无菌水，用涂布棒轻轻刮下孢子悬浮液，装入2mL离心管。
(3)用没有针头的1mL注射器吸取孢子悬浮液。
(4)避开叶脉，用注射器针在叶片上开小孔后，用装有菌液的注射器压住小孔，另一只手的手指在叶片反方向压住小孔，慢慢用力，将菌液注射入叶片中，注射好的部分的颜色会变浅。每个叶片注射1-2个孔。
(5)暗培养两天后观察。
(6)用ImageJ软件统计病斑面积。结果见图5B(农杆菌介导的瞬时表达amitsRVal感病品种‘金冠’组培苗3天后，接种ALT1，48小时后病斑面积统计图及其表型图，WT代表不进行瞬时表达‘金冠’组培苗；EV代表pFGC5941空载进行瞬时表达‘金冠’组培苗；amitsRVal代表沉默mdm-tsRVal的pFGC5941载体进行瞬时表达‘金冠’组培苗)，图7B(农杆菌介导的瞬时表达OE-Md-tRNA-Val感病品种‘金冠’组培苗3天后，接种ALT1，48小时后病斑面积统计图及其表型图，WT代表不进行瞬时表达‘金冠’组培苗；EV代表pFGC5941空载进行瞬时表达‘金冠’组培苗；OE-Md-tRNA-Val代表过表达Md-tRNA-Val的pFGC5941载体进行瞬时表达‘金冠’组培苗)所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (7)

1.一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的tsRNA，其特征在于，其编码的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.权利要求1所述的一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的tsRNA的初级转录本，其特征在于，其编码的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
3.一种抑制权利要求1所述用于调控苹果斑点落叶病抗性的tsRNA的人工miRNA，其特征在于，其编码核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
4.一种基因表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求3中所述的人工miRNA。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体上携带有权利要求4所述的表达盒。
6.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌中含有权利要求5所述的表达载体。
7.一种提高苹果植株对苹果斑点落叶病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将权利要求3所述的人工miRNA插入pFGC5941载体上的BamHI和NcoI两个酶切位点中，即将上述人工miRNA构建到pFGC5941载体的NcoI和BamHI酶切位点之间得到质粒；
S2：将S1构建的质粒转入农杆菌中，涂布于加有抗生素的固体YEP培养基上，将平板于28℃倒置培养24-48h；上述抗生素包含50mg/L Kan，20mg/LRif；
S3：经S2培养的农杆菌挑取单斑，加入包含50mg/L Kan，20mg/LRif的YEP液体培养基2ml，28℃，180rpm培养过夜；
S4：取80μL经S3培养的农杆菌菌液，加入包含50mg/L Kan，20mg/LRif及10μM乙酰丁香酮的YEP液体培养基4ml，28℃，180rpm培养12-16h；
S5：将经S4培养的农杆菌菌液室温10000rpm离心1min，除去培养基；用1-2ml悬浊液经涡旋震荡悬浮上述菌液；取经震荡悬浮的菌液10μL加入990μL悬浊液得菌体悬浊液，用分光光度计测定其OD600，将菌体悬浊液调整至OD600＝1.0，室温静置2-5h；上述悬浊液中包括：pH调至5.2的10mMMES-KOH，10mM MgCl2,100μM乙酰丁香酮；
S6：将S5得到的菌体悬浊液使用前经涡旋震荡或移液枪吸打悬浮菌体，然后用没有针头的1mL注射器吸取上述菌体悬浊液，避开叶脉，用上述1mL注射器针在苹果叶片上开小孔后，将菌体悬浊液注射入叶片中，每个叶片注射1-2个孔；
S7：注射农杆菌3天后观察叶片。
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CN106754926A (zh) * 2016-12-23 2017-05-31 中国农业大学 用于调控苹果斑点落叶病抗性的miRNA及其应用
CN111118034A (zh) * 2020-02-24 2020-05-08 沈阳农业大学 一种苹果抗病相关基因MdHAL3及其应用

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苹果miRNA调控斑点落叶病抗性的分子机制研究;张秋雷;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》(第09期);D046-31 *

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