CN111118034A - 一种苹果抗病相关基因MdHAL3及其应用 - Google Patents

一种苹果抗病相关基因MdHAL3及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种苹果抗病相关基因MdHAL3及其应用，所述苹果抗病相关基因MdHAL3的全长编码区序列如序列表SEQ NO:1所示；氨基酸序列如序列表SEQ NO:2所示。本方法提供苹果抗病相关基因MdHAL3并用于构建MdHAL3基因植物表达载体，构建的植物表达载体经农杆菌介导法转化苹果，获得的转基因植株抗病的能力明显提高，为利用基因工程技术，对提高苹果品种的抗病能力提供了理论依据与技术手段。

Description

一种苹果抗病相关基因MdHAL3及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体是涉及一种苹果抗病相关基因MdHAL3及其应用。
背景技术
苹果是蔷薇科苹果属的一种多年生落叶乔木，因其果实营养丰富、产量高，在我国种植范围较为广泛（李坤坤，2017）。
植物生长需要面临不同的环境，包括生物逆境胁迫（病菌、虫害等）及非生物逆境胁迫（干旱、高盐、机械损伤等）。其中生物胁迫严重制约着全球的果树生产，影响果树的产量和品质，使农业生产的可持续发展受到很大威胁，是目前果树育种及遗传改良研究中不可忽视的问题，但目前在苹果中还没有真正可用于抗逆遗传改良的基因。
在植物体内，通过转基因技术，过表达或干扰某个基因可以提高植物对环境胁迫的抗性。研究发现，在拟南芥中，过表达AtHAL3a基因的拟南芥植株与野生型植株相比，耐盐性和渗透作用都有所提高（Espinosa-Ruiz et al., 1999）。在烟草中，过表达NtHAL3a基因的烟草在盐胁迫下生长速率明显高于野生型(Yonamine et al.,2004)。目前，还没有苹果MdHAL3基因功能和作用的相关报道。
参考文献
（1）Espinosa-Ruiz A, Belles J M, Serrano R, Culianez-MacIIea Phe A (1999)Arabidopsis thaliana AtHALeu3: a flavoprotein related to salt and osmotictolerance and plant growth. Plant Journal 20: 529−539.
（2）Yonamine IIe, Yoshida Lys, Lysido Lys, Nakagawa A, Nakayama H, ShinmyoA (2004) Overexpression of NtHALeu3 genes confers increased levels of prolinebiosynthesis and the enhancement of salt tolerance in cultured tobacco cells.Journal of Experimental Botany 55: 387-395.
（3）Zhang F, Wang F, Yang S, Zhang Y, Xue H, Wang Y , Yan S, Ma Y (2019)MdWRKY100 encodes a group IIe WRLysY transcription factor in Malus domesticathat positively regulates resistance to Colletotrichum gloeosporioidesinfection. Plant Science. 286: 68-77.
（4）李坤坤, 徐昌杰. 蔷薇科果树离体再生与遗传转化研究进展. 园艺学报, 2017(9):1633-1644。
发明内容
为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的是提出一种苹果抗病相关基因MdHAL3及其应用，构建MdHAL3基因的植物过表达载体，通过农杆菌介导法，将该基因转化到苹果中，实现MdHAL3基因的功能分析，明确MdHAL3基因对提高苹果植株的抗病性及提早生根的应用，加快苹果品种改良进程。
本发明提出了一种苹果抗病相关基因MdHAL3，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述苹果抗病相关基因MdHAL3编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明提出了一种苹果抗病相关基因MdHAL3的应用，用于提高苹果植株抗病性。
本发明还提出了一种苹果抗病相关基因MdHAL3的应用，用于提高苹果植株生根能力。
本发明还提出一种苹果抗病相关基因MdHAL3的应用方法，包括以下步骤：
（1）MdHAL3基因的克隆
①RNA提取：采用改良CTAB法，提取苹果植株叶片的总RNA之后用反转录试剂盒以RNA为模板反转录得到cDNA第一条链；
②基因的克隆：以上述cDNA第一链为模板，利用引物 MdHAL3-F和MdHAL3-R进行PCR扩增，回收PCR产物，获得645bp的目的片段；
MdHAL3-F核苷酸序列见 SEQ ID NO:3；所述MdHAL3-R核苷酸序列见 SEQ ID NO:4；
（2）植物过表达载体的构建
①利用植物表达载体，选用EcoR I和BamH I限制性内切酶分别对pRI101-CaMV35S和含有目的基因的PMD18-T进行双酶切；回收载体大片段和目的基因小片段，用T4DNA连接酶过夜后转化大肠杆菌感受态DH5a，鉴定重组子后即可进行双酶切；
②选取双酶切验证正确的重组质粒，测序后转化农杆菌EH105感受态细胞，得到的含有MdHAL3重组质粒的农杆菌用于转化苹果植株；
（3）苹果遗传转化
当继代生长约20-28 d的试管苗用于转化材料，从酵母菌（YEP）固体培养基上挑取部分之前菌落PCR验证正确的MdHAL3重组质粒农杆菌菌落，将其加到25mL的YEP液体培养基中，28℃条件下、180 rpm振荡培养过夜；次日早上取1 mL摇好的菌液与新的不含抗生素的YEP液体培养基按照1：50的比例充分混合均匀，然后继续振荡培养至OD600为0.4-0.6之间，得到混合菌液；
所述酵母菌（YEP）固体培养基配方包括为：10 g·L-1胰蛋白胨，10 g·L-1酵母浸粉+5g·L-1 NaCl ，15 g·L-1琼脂粉；
所述YEP液体培养基配方包括：10 g·L-1胰蛋白胨，10 g·L-1酵母浸粉，5 g·L-1NaCl，卡那霉素50 mg·L-1，利福平100 mg·L-1；
所述不含抗生素的YEP液体培养基配方包括：10 g·L-1胰蛋白胨，10 g·L-1酵母浸粉，5 g·L-1 NaCl；
将所述混合菌液5000rpm，5min离心收集菌种，再用等体积的含有MS（B5 维生素）、15 gL-1 蔗糖、5 g L-1葡萄糖的液体培养基重悬农杆菌，对苹果试管苗叶片进行遗传转化，大约3-4 周后出现愈伤组织和不定芽，并将长出的愈伤组织转入到光下进行培养，在含有50mg/ml的卡那霉素的培养基上筛选出转入MdHAL3基因的阳性植株。
进一步的，所述植物过表达载体为pRI101-CaMV35S-MdHAL3。
本发明的有益效果是：利用现有的植物基因工程技术，本发明克隆了苹果抗病相关基因MdHAL3，并通过农杆菌介导的方法将该基因转入苹果，经过比较分析证明，转基因植株MdHAL3-OE4株系MdHAL3基因表达量是非转基因植株WT的6倍，MdHAL3-OE5株系MdHAL3基因表达量是WT的8倍；二者的抗病能力和提早生根能力明显提高。
附图说明
图1：MdHAL3基因全长cDNA序列的扩增结果，其中M为DL2000， WT为非转基因‘寒富’苹果；
图2：pRI101-CaMV35S-MdHAL3重组载体验证结果，其中M为DL2000， WT为非转基因‘寒富’苹果；
A：为SmaI和BamHI对pRI101-CaMV35S-MdHAL3重组载体双酶切验证结果；
B：为转化了的pRI101-CaMV35S-MdHAL3农杆菌的菌落PCR结果；
图3：pRI101-CaMV35S-MdHAL3测序结果比对结果；
图4：转基因苹果抗性筛选（MdHAL3-OE植株）；
图5：为接菌情况下转基因植株的叶片生长状况，其中WT为非转基因‘寒富’苹果植株，MdHAL3为过量表达MdHAL3基因‘寒富’苹果植株；
图6：转基因苹果的根系生长情况，其中WT为非转基因‘寒富’苹果植株，OE-4为过表达转基因苹果组培苗4号株系，OE-5为过表达转基因苹果组培苗5号株系；
图7：转基因苹果的根长，其中WT为‘寒富’苹果非转基因植株，OE-4为过表达转基因苹果组培苗4号株系，OE-5为过表达转基因苹果组培苗5号株系；
图8：转基因苹果的根系数量，其中WT为非转基因‘寒富’苹果植株，OE-4为过表达转基因苹果组培苗4号株系，OE-5为过表达转基因苹果组培苗5号株系；
图9：MdHAL3基因与其他物种氨基酸序列比对结果。
具体实施方式
实施例中所采用的试剂除特殊说明均为市场购买，所采用的常规操作方法除特殊说明参照参考文献方法。
实施例1 苹果抗病相关基因MdHAL3的克隆
所述苹果抗病相关基因MdHAL3核苷酸序列如下：
atgacgagct ctgaacctgc gagtccagag attgagcaac aagccaattc tgccccaaggaggcctcgga ttctacttgc tgctagcgga agtgtagctg ccataaagtt tggcaaccta tgccatagtttttcggaatg ggcagaagta aaagcagttg ccacaagagc atctttgcat ttcattgata gagcatcacttcccaaggat gtaatcctgt acaccgaaga ggatgaatgg tccacctgga acaaagttgg tgatagtgtgcttcacattg agctccgcag ttgggctgat atcttggtta tcgccccatt gtcagcaaac acactaggcaagattgctgg gggattgtgt gacaatctac tgacctgcat tgtacgagca tgggactaca gcaagcctttcttcgttgca ccagccatga acactttgat gtggaagaat cccttcacgg agcaacatat catgtcgattgatgaacttg gagtttcact catcccacct gtgacgaaga ggctggcttg tggagattac gggaatggagcaatggcaga accttctgtg atttattcca ctgtaaggct ctttttcgag tcacgagttc aacagagtggtaatatcgtt cagcaaccgg tataa
所述苹果抗病相关基因MdHAL3编码的蛋白质的氨基酸序列：MetThrSerSerGluProAlaSerProGluIIeGluGlnGlnAlaAnsSerAlaProArgArgProArgIIeLeuLeuAlaAlaSerGlySerValAlaAlaIIeLysPheGlyAnsLCysHisSerPheSerGluTrpAlaGluValLysAlaValAlaThrArgAlaSerLeuHisPheIIeAspArgAlaSerLeuProLysAspValIIeLTyrThrGluGluAspGluTrpSerThrTrpAnsLysValGlyAspSerValLeuHisIIeGluLArgSerTrpAlaAspIIeLValIIeAlaProLeuSerAlaAnsThrLeuGlyLysIIeAlaGlyGlyLeuCysAspAnsLeuLeuThrCysIIeValArgAlaTrpAspTyrSerLysProPhePheValAlaProAlaMetAnsThrLeuMetTrpLysAnsProPheThrGluGlnHisIIeMetSerIIeAspGluLeuGlyValSerLeuIIeProProValThrLysArgLeuAlaCysGlyAspTyrGlyAnsGlyAlaMetAlaGluProSerValIIeTyrSerThrValArgLeuPhePheGluSerArgValGlnGlnSerGluAnsIIeValGlnGlnProVal*
所述MdHAL3基因的克隆方法，包括以下步骤：
（1）以‘寒富’苹果叶片为试材
（2）RNA提取：采用改良CTAB法（Zhang et al., 2019），提取‘寒富’叶片的总RNA之后用反转录试剂盒以RNA为模板反转录得到cDNA第一条链。
（3）基因的克隆：以反转录的‘寒富’叶片cDNA第一链为模板，利用引物 MdHAL3-F和MdHAL3-R进行PCR扩增，回收PCR产物，获得645bp的目的片段。
MdHAL3-F:5’— ggtaccatgacgagctctgaacctgc—3’
MdHAL3-R:5’—ggatccttataccggttgctgaacgatatt—3’
其中，两条引物5’端的前6个碱基均为酶切位点，此6个碱基是构建过表达载体所需，不属于MdHAL3的基因序列。
实例2 植物过表达载体的构建
（1）利用植物表达载体pRI101-CaMV35S，选用EcoR I和BamH I限制性内切酶（购自TaKaRa公司）分别对pRI101-CaMV35S和含有MdHAL3的PMD18-T（PMD18-T购自TaKaRa公司）进行双酶切；回收载体大片段和目的基因小片段，用T4DNA连接酶过夜后转化大肠杆菌感受态DH5a（购自北京全式金生物科技有限公司），鉴定重组子后即可进行双酶切。
（2）选取双酶切验证正确的重组质粒，送金唯智生物科技有限公司测序。之后转化农杆菌EH105感受态细胞，得到的含有MdHAL3重组质粒的农杆菌用于转化苹果品种‘寒富’，所述有重组质粒的农杆菌置于YEP培养基平板上于4℃冰箱中保存。
实例3 转基因功能验证—苹果转化筛选及抗病表型分析
3.1苹果转化
当继代生长约20-28 d的试管苗用于转化材料，从酵母菌（YEP）固体培养基上挑取部分之前菌落PCR验证正确的MdHAL3重组质粒农杆菌菌落，将其加到25mL的YEP液体培养基中，28℃条件下、180 rpm振荡培养过夜；次日早上取1 mL摇好的菌液与新的不含抗生素的YEP液体培养基按照1：50的比例充分混合均匀，然后继续振荡培养至OD600为0.4-0.6之间，得到混合菌液；
所述酵母菌（YEP）固体培养基配方包括为：10 g·L-1胰蛋白胨，10 g·L-1酵母浸粉+5g·L-1 NaCl ，15 g·L-1琼脂粉；
所述YEP液体培养基配方包括：10 g·L-1胰蛋白胨，10 g·L-1酵母浸粉，5 g·L-1NaCl，卡那霉素50 mg·L-1，利福平100 mg·L-1；
所述不含抗生素的YEP液体培养基配方包括：10 g·L-1胰蛋白胨，10 g·L-1酵母浸粉，5 g·L-1 NaCl。
将所述混合菌液转入无菌的50ml离心管中，5000rpm，5min离心收集菌种，再用等体积的含有MS（B5 维生素）、15 g L-1 蔗糖、5 g L-1葡萄糖的液体培养基（不需要调PH值）重悬农杆菌。参照Zhang等（2019）的方法，对苹果试管苗叶片进行遗传转化，大约3-4 周后出现愈伤组织和不定芽，并将长出的愈伤组织转入到光下进行培养，在含有50mg/ml的卡那霉素的培养基上筛选出转入MdHAL3基因的阳性植株(Zhang et al., 2019)（见图4 MdHAL3-OE植株），用于炭疽病菌胁迫试验。
3.2苹果阳性株系抗病表型分析
提前在PDA培养基（马铃薯200g L-1，葡萄糖20g L-1，琼脂20g L-1）平板上活化苹果炭疽病菌，在生长5d左右时，用干净灭菌的棉花棒刮净全部菌丝，待真菌充分产出孢子后用蒸馏水清洗，用血球计数板计数，配置成孢子浓度为108个·mL-1的分生孢子悬浮液备用。
取生长20-30 d左右、生长程度基本一致的非转基因植株（WT）和MdHAL3-OE植株的苹果苗为试材，在每片叶片上的右上角滴10微升 1×108个·mL-1的孢子悬浮液进行炭疽病菌胁迫处理，分别在0、5、6、7和8 d观察表型（见图5）。
调查结果表明：接菌处理后，随着时间的推移，MdHAL3-OE植株叶片表现出受伤害症状，但叶片病斑扩展程度较轻，WT植株受到较大伤害，叶面病斑连接成片扩展形成大型枯死斑，且发病程度明显重于MdHAL3-OE植株叶片。这说明MdHAL3基因过表达可以增强苹果植株的抗病性。
实例4 转基因苹果生根情况分析
试验处理：非转基因植株（WT）和MdHAL3-OE植株的苹果组培苗；
试验方法：将获得的转基因组培苗与非转基因组培苗，同时移入生根培养基中，培养15天和35天，观察植株的根系生长情况，调查植株根长及根系数量。
所述生根培养基的配方为：MS+1.0 mg·L-1 IBA，20 g·L-1蔗糖，7 g·L-1琼脂。
调查结果表明：植株在生根培养基10天时，过表达转基因组培苗与野生型非转基因组培苗相比，过表达转基因组培苗更早的长出根系（见图6），植株在生根培养基35天时，过表达转基因组培苗5号株系的根长和根系数量是野生型植株的7.085倍和4.326倍（见图7、8），这些数据说明MdHAL3基因与苹果植株的根系生长发育相关，过表达转基因植株与野生型非转基因组培苗相比更易生根且根系生长情况更好。
序列表
<120> 一种苹果抗病相关基因MdHAL3及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 645
<212> DNA
<213> 苹果(Malus pumila)
<400> 1
atgacgagct ctgaacctgc gagtccagag attgagcaac aagccaattc tgccccaagg 60
aggcctcgga ttctacttgc tgctagcgga agtgtagctg ccataaagtt tggcaaccta 120
tgccatagtt tttcggaatg ggcagaagta aaagcagttg ccacaagagc atctttgcat 180
ttcattgata gagcatcact tcccaaggat gtaatcctgt acaccgaaga ggatgaatgg 240
tccacctgga acaaagttgg tgatagtgtg cttcacattg agctccgcag ttgggctgat 300
atcttggtta tcgccccatt gtcagcaaac acactaggca agattgctgg gggattgtgt 360
gacaatctac tgacctgcat tgtacgagca tgggactaca gcaagccttt cttcgttgca 420
ccagccatga acactttgat gtggaagaat cccttcacgg agcaacatat catgtcgatt 480
gatgaacttg gagtttcact catcccacct gtgacgaaga ggctggcttg tggagattac 540
gggaatggag caatggcaga accttctgtg atttattcca ctgtaaggct ctttttcgag 600
tcacgagttc aacagagtgg taatatcgtt cagcaaccgg tataa 645
<210> 2
<211> 229
<212> PRT
<213> 苹果(Malus pumila)
<400> 2
Met Thr Ser Ser Gly Pro Ala Ser Pro Gly Ile Ile Gly Gly Gly Ala
1 5 10 15
Ala Ser Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Ile Leu Leu Ala Ala Ser Gly
20 25 30
Ser Val Ala Ala Ile Ile Leu Pro Gly Ala Leu Cys His Ser Pro Ser
35 40 45
Gly Thr Ala Gly Val Leu Ala Val Ala Thr Ala Ala Ser Leu His Pro
50 55 60
Ile Ile Ala Ala Ala Ser Leu Pro Leu Ala Val Ile Ile Leu Thr Thr
65 70 75 80
Gly Gly Ala Gly Thr Ser Thr Thr Ala Leu Val Gly Ala Ser Val Leu
85 90 95
His Ile Ile Gly Leu Ala Ser Thr Ala Ala Ile Ile Leu Val Ile Ile
100 105 110
Ala Pro Leu Ser Ala Ala Thr Leu Gly Leu Ile Ile Ala Gly Gly Leu
115 120 125
Cys Ala Ala Leu Leu Thr Cys Ile Ile Val Ala Ala Thr Ala Thr Ser
130 135 140
Leu Pro Pro Pro Val Ala Pro Ala Met Ala Thr Leu Met Thr Leu Ala
145 150 155 160
Pro Pro Thr Gly Gly His Ile Ile Met Ser Ile Ile Ala Gly Leu Gly
165 170 175
Val Ser Leu Ile Ile Pro Pro Val Thr Leu Ala Leu Ala Cys Gly Ala
180 185 190
Thr Gly Ala Gly Ala Met Ala Gly Pro Ser Val Ile Ile Thr Ser Thr
195 200 205
Val Ala Leu Pro Pro Gly Ser Ala Val Gly Gly Ser Gly Ala Ile Ile
210 215 220
Val Gly Gly Pro Val
225
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 3
ggtaccatga cgagctctga acctgc 26
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 4
ggatccttat accggttgct gaacgatatt 30

Claims (6)

1.一种苹果抗病相关基因MdHAL3，其特征是：所述苹果抗病相关基因MdHAL3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述苹果抗病相关基因MdHAL3编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的一种苹果抗病相关基因MdHAL3的应用方法，其特征是：所述苹果抗病相关基因MdHAL3用于提高苹果植株抗病性。
3.根据权利要求2所述的一种苹果抗病相关基因MdHAL3的应用方法，所述苹果抗病相关基因MdHAL3用于提高苹果植株对苹果炭疽病的抗病性。
4.根据权利要求2所述的一种苹果抗病相关基因MdHAL3的应用方法，其特征是：所述苹果抗病相关基因MdHAL3用于提高苹果植株生根能力。
5.根据权利要求1所述的一种苹果抗病相关基因MdHAL3的应用方法，其特征是：所述MdHAL3基因的遗传转化方法，包括以下步骤：
（1）MdHAL3基因的克隆
①RNA提取：采用改良CTAB法提取苹果植株叶片的总RNA之后用反转录试剂盒以RNA为模板反转录得到cDNA第一条链；
②基因的克隆：以所述cDNA第一链为模板，利用引物 MdHAL3-F和MdHAL3-R进行PCR扩增，回收PCR产物，获得645bp的目的片段；
MdHAL3-F核苷酸序列见 SEQ ID NO:3；所述MdHAL3-R核苷酸序列见 SEQ ID NO:4；
（2）植物过表达载体的构建
① 利用植物表达载体，选用EcoR I和BamH I限制性内切酶分别对pRI101-CaMV35S和含有MdHAL3基因的PMD18-T进行双酶切；回收载体大片段和目的基因小片段，用T4DNA连接酶过夜后转化大肠杆菌感受态DH5a，鉴定重组子后即可进行双酶切；
②选取双酶切验证正确的重组质粒，测序后转化农杆菌EH105感受态细胞，得到的含有MdHAL3重组质粒的农杆菌用于转化苹果植株；
（3）苹果遗传转化
当继代生长约20-28 d的试管苗用于转化材料，从酵母菌（YEP）固体培养基上挑取部分之前菌落PCR验证正确的MdHAL3重组质粒农杆菌菌落，将其加到含抗生素的YEP液体培养基中，28℃条件下、180 rpm振荡培养过夜；次日早上取摇好的菌液与新的不含抗生素的YEP液体培养基按照1：50的比例充分混合均匀，然后继续振荡培养至OD600为0.4-0.6之间，得到混合菌液；所述含抗生素的YEP液体培养基配方包括：10 g·L-1胰蛋白胨，10 g·L-1酵母浸粉，5 g·L-1 NaCl，卡那霉素50 mg·L-1，利福平100 mg·L-1；
将所述混合菌液离心收集菌种，再用等体积的含有B5 维生素、15 g L-1 蔗糖、5 g L-1葡萄糖的液体培养基重悬农杆菌，对苹果试管苗叶片进行遗传转化， 3-4 周后出现愈伤组织和不定芽，并将长出的愈伤组织转入到光下进行培养，在含有50mg/ml的卡那霉素的培养基上筛选出转入MdHAL3基因的阳性植株。
6.根据权利要求5所述的一种苹果抗病相关基因MdHAL3的应用方法，其特征是：所述植物过表达载体为pRI101-CaMV35S-MdHAL3。
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