CN115976043A - 调控桃抗蚜性的PpWRKY4基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了调控桃抗蚜性的PpWRKY4基因及应用，所述PpWRKY4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述PpWRKY4基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。本发明以蚜虫接种前后的抗蚜桃品种叶片为材料进行转录组测序，首次发现PpWRKY4基因对于蚜虫抗性的影响。同时本发明通过将PpWRKY4过表达载体转化到拟南芥中进行验证，结果证明过表达PpWRKY4基因的拟南芥上蚜虫数目明显少于野生型。本发明为培育抗蚜桃品种奠定了基础。

Description

调控桃抗蚜性的PpWRKY4基因及应用

技术领域

本发明涉及调控桃抗蚜性的PpWRKY4基因及应用，属于农业生物技术领域。

背景技术

桃蚜(Myzuspersicae Sülzer)，又叫桃赤蚜、腻虫、烟蚜、油汉，属同翅目，蚜科。桃蚜分布范围广，在朝鲜、日本、印度尼西亚、印度以及北美、欧洲、非洲等地均有发生，是世界上分布最广的蚜虫之一，在我国桃主要产区均有分布。桃蚜寄主范围广，可以在50多科400多种植物上取食，主要包括桃、李等蔷薇科植物，油菜等十字花科植物，烟草、马铃薯等茄科植物。并且，桃蚜的传毒能力强，可传播115种植物病毒，占整个蚜虫传播的植物病毒的67.7％。桃蚜会对作物产生严重危害。受桃蚜侵食后的植物幼叶向反面横卷或不规则卷曲，阻碍叶片的营养吸收，使叶片营养恶化，甚至黄落。蚜虫排泄在叶片上的蜜露易诱发霉污病，干扰植物的光合作用，严重影响作物的产量和品质。桃蚜的繁殖力很强，世代重叠现象突出，孤雌繁殖，适应性强，是最难防治的害虫之一。

目前，对于桃蚜的防治主要依赖于杀虫剂。但由于近年来烟碱类杀虫剂的广泛使用，桃蚜已经对其产生抗药性，防治难度增加；另外，广谱型杀虫剂的大量使用对授粉昆虫和天敌昆虫也产生严重危害，并对果园的生态环境造成破坏。因此挖掘抗性资源的抗蚜基因、培育抗桃蚜新品种，是桃资源和育种研究工作的重要环节。本发明利用抗蚜资源挖掘到一个参与桃抗蚜过程的WRKY基因，为培育抗蚜桃品种奠定了基础。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一个首次从桃中获得的PpWRKY4基因，该基因具有调控抗蚜的功能。

为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是提供：

调控桃抗蚜性的PpWRKY4基因，所述PpWRKY4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述PpWRKY4基因为完整的编码547个氨基酸的ORF。

所述PpWRKY4基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。

本发明的技术方案之一是提供：PpWRKY4基因在调控桃抗蚜性中的应用。

具体的，在蚜虫侵染后，所述PpWRKY4基因在桃叶片中被诱导表达。

具体方法为：所述PpWRKY4基因与载体pRI101-AN正向连接后得到pRI101-PpWRKY4重组表达载体，将所述pRI101-PpWRKY4重组表达载体转化到DH5α大肠杆菌中，筛选阳性菌提取质粒，将测序验证过表达载体中的PpWRKY4基因序列正确的质粒转化农杆菌菌株GV3101，制备侵染液，将拟南芥植株的地上部位倒置于侵染液中，暗培养过夜，即可正常栽培管理。

本发明的有益效果：

本发明以蚜虫接种前后的抗蚜桃品种叶片为材料进行转录组测序，首次发现PpWRKY4基因对于蚜虫抗性的影响。同时本发明通过将PpWRKY4过表达载体转化到拟南芥中进行验证，结果证明过表达PpWRKY4基因的拟南芥上蚜虫数目明显少于野生型。本发明为培育抗蚜桃品种奠定了基础。

附图说明

图1为桃PpWRKY4基因与其他物种同源基因蛋白系统进化树。

图2为蚜虫侵染前后，抗蚜单株(R32)和感蚜单株(S27)的桃叶片中PpWRKY4基因的表达量。图中，R0、R6、R12、R24、R48分别代表R32接种蚜虫后0、6、12、24、48h的PpWRKY4基因的表达量。S0、S6、S12、S24、S48分别代表S27接种蚜虫后0、6、12、24、48h的PpWRKY4基因的表达量。小写字母的不同表示具有显著性差异(p<0.05)。

图3为转基因拟南芥与野生型拟南芥中PpWRKY4基因的表达量。图中，小写字母的不同表示具有显著性差异(p<0.05)。

图4为转基因拟南芥与野生型拟南芥上蚜虫的数量变化。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例

一、基因筛选

以蚜虫接种前后的帚形山桃杂交F₂群体中抗蚜山桃叶片为材料，参考通用植物RNA提取试剂盒(北京华越洋生物)说明书提取总RNA，用Nanodrop 1000微量紫外可见光分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量RNA浓度及OD₂₆₀/₂₈₀值，然后使用FastKingcDNA第一链合成试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)反转录成cDNA，反应体系及程序见说明书。

以蚜虫接种前后的帚形山桃杂交F₂群体中抗蚜山桃叶片为材料进行转录组测序，通过比较抗蚜前后的基因表达水平，筛选到与抗蚜相关的PpWRKY4基因。桃PpWRKY4基因编码的蛋白序列与其它物种同源基因蛋白系统进化关系见图1。

二、实时荧光定量PCR验证

以蚜虫侵染后0、6、12、24、48h的帚形山桃杂交F₂群体中抗蚜单株(R32)和感蚜单株(S27)的桃叶片为材料，参考步骤一的方法合成cDNA。

以cDNA为模板，设计引物，用SYBR Green I法进行Real-time PCR(荧光定量PCR)扩增，定量分析蚜虫侵染前后，抗蚜和感蚜品种的桃叶片中PpWRKY4基因的表达量。

通过NCBI设计荧光定量PCR的引物，序列如下：

上游引物：5’-ATTTGATGGTGGCTCGGTCG-3’(SEQ ID NO.3)

下游引物：5’-TTCCAAATGGACTCGGAGGTG-3’(SEQ ID NO.4)

以桃Actin基因作为内参基因，其引物序列如下：

上游引物：5’-GATTCCGGTGCCCAGAAGT-3’(SEQ ID NO.5)

下游引物：5’-CCAGCAGCTTCCATTCCAA-3’(SEQ ID NO.6)

PCR扩增体系如表1：

表1 Real-time PCR扩增体系

所用仪器为Roche 480II实时荧光定量PCR系统，扩增程序如表2。

表2 Real-time PCR扩增程序

相对表达量的计算采用2^-ΔΔCt法。用SPSS软件对蚜虫侵染前后，抗蚜和感蚜品种的桃叶片中PpWRKY4基因的表达量进行方差分析，具体结果见图2。从图2中可以看出，在接种蚜虫后的0、6、12、24、48h，抗蚜品种中的PpWRKY4基因的表达量显著高于感蚜品种。

三、基因CDS全长序列克隆

采用同源重组的方法进行克隆，依据桃Lovell基因组(Prunus persica Genomev2.0.a1)中PpWRKY4基因的参考序列设计带同源臂的克隆引物，限制性酶切位点选择NdeI/BamHI，其在引物中的位置用下划线标出。

参考步骤一的方法克隆R32的cDNA，以cDNA为模板，利用引物，采用Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase超保真酶(诺唯赞

)进行PCR扩增。

引物序列如下：

上游引物：5’-gggaattccatatgATGACAGAAAAAGAAAAAAGGTGCT-3’(SEQ ID NO.7)

下游引物：5’-cgcggatccTTACACAAAGATTTGCTCTTCTTTTAGC-3’(SEQ ID NO.8)

PCR扩增体系见表3。

表3 PCR扩增体系

将上述配制好的体系转移到PCR管或板中，放入PCR仪器，进行PCR扩增，扩增程序如表4。

表4 PCR扩增程序

PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行跑电泳，PCR产物纯化用DNA凝胶回收试剂盒(诺唯赞

)进行回收。

回收的PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行Sanger测序，其核苷酸序列所测结果如SEQ ID NO.1所示。经软件BioXM(v2.7)翻译得到其氨基酸序列如SEQ IDNO.2。

四、过表达载体的构建

利用限制性内切酶NdeI/BamHI对pRI101-AN载体进行酶切，然后用T4连接酶连接回收的PpWRKY4基因的PCR产物，得到pRI101-PpWRKY4重组表达载体，再将pRI101-PpWRKY4重组表达载体转化到DH5α大肠杆菌中，将其涂布到含有卡那霉素的LB培养基上进行阳性筛选，将阳性菌落置于含卡那霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒，送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序检验。

五、农杆菌介导法转基因

1、农杆菌转化

将测序验证过表达载体中的PpWRKY4基因序列正确的质粒用于转化农杆菌GV3101感受态细胞。转化后的农杆菌GV3101感受态细胞涂布到含有卡那霉素和利福平的LB筛选培养基上，28℃培养2-3天进行阳性筛选，将阳性单菌落置于含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，28℃，220rpm震荡培养1天，得到含有目的质粒的农杆菌GV3101菌液。

2、制备侵染液

在含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中培养含有目的质粒的农杆菌GV3101(每5mL液体培养基中加10μL上述农杆菌GV3101菌液)，28℃、220rpm过夜培养；取2-3mL液体培养物于50mL含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，28℃、220rpm震荡培养4-5h，4000rpm离心20min，弃上清液，收集沉淀菌体，将菌体重悬于侵染介质(l/2MS培养基)中，使OD₆₀₀＝0.8左右，加0.02％表面活化剂silweetl-77，制得侵染液。

3、侵染

将野生型拟南芥植株的地上部位倒置于侵染液中1-2min，暗培养过夜，于光照培养箱(黑暗23℃，14h/光照18℃，10h)中培养，观查其生长表型，一周以后可再侵染一次，等待收获T0代转基因种子。

六、转基因拟南芥表型鉴定

收获拟南芥T0代转基因种子，消毒后点种于含100mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上筛选阳性植株。8天后观察发现，阳性植株生长势强，呈深绿色，根系旺盛，而非阳性植株黄化枯萎直至死亡。取在含卡那霉素的1/2MS培养基上生长势良好的阳性苗(转基因拟南芥)叶片提取RNA并反转录成cDNA，利用荧光定量时所用引物进行Real-time PCR验证，用SPSS软件对转基因拟南芥与野生型拟南芥中PpWRKY4基因的表达量进行方差分析，结果见图3。从图3可以看出，过表达PpWRKY4基因的拟南芥株系(OE1、OE2、OE3)中PpWRKY4基因的表达量显著高于野生型(WT)。

当转基因拟南芥和野生型拟南芥长到抽薹时，每株拟南芥接种10头蚜虫，每天记录蚜虫数目的变化，连续记录了7天，用SPSS软件对转基因拟南芥与野生型拟南芥上蚜虫的数量进行方差分析，结果如图4。从图4可以看出，接种蚜虫7天后，过表达PpWRKY4基因的拟南芥株系(WRKY-OE1、WRKY-OE2、WRKY-OE3)上蚜虫数目明显少于野生型(WT)。

Claims (6)

1.调控桃抗蚜性的PpWRKY4基因，其特征在于，所述PpWRKY4基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的PpWRKY4基因，其特征在于，所述PpWRKY4基因为完整的编码547个氨基酸的ORF。

3.根据权利要求2所述的PpWRKY4基因，其特征在于，所述PpWRKY4基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。

4.PpWRKY4基因在调控桃抗蚜性中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在蚜虫侵染后，所述PpWRKY4基因在桃叶片中被诱导表达。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具体方法为：所述PpWRKY4基因与载体pRI101-AN正向连接后得到pRI101-PpWRKY4重组表达载体，将所述pRI101-PpWRKY4重组表达载体转化到DH5α大肠杆菌中，筛选阳性菌提取质粒，将测序验证过表达载体中的PpWRKY4基因序列正确的质粒转化农杆菌菌株GV3101，制备侵染液，将拟南芥植株的地上部位倒置于侵染液中，暗培养过夜，即可正常栽培管理。

Images