CN117534743A - OsJAB1蛋白及其在提高水稻盐胁迫耐性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了OsJAB1蛋白及其在提高水稻盐胁迫耐性中的应用。其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。OsJAB1蛋白通过调控植物抗氧化物维生素C合成关键酶稳定性，提高植物光合系统抗氧化能力，提高植物盐胁迫耐性。研究结果表明OsJAB1蛋白在提高植物盐胁迫耐性中具有重要作用。本发明对于培育高盐胁迫耐性植物和高产作物品种具有重大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及OsJAB1蛋白及其在提高水稻盐胁迫耐性中的应用。
背景技术
盐胁迫是影响作物产量的重要环境胁迫之一，对水稻等粮食作物生产具有重要影响。盐胁迫不仅可以干扰植物体内离子平衡，影响植物体内正常的生理反应，对植物造成离子毒害。高盐胁迫也诱导大量活性氧的生产，对植物不同细胞成分造成氧化胁迫伤害，并影响正常的生理生化过程，对植物生长发育具有严重伤害。
发明人研究发现利用RNA干扰技术降低水稻OsJAB1基因表达，可以有效激活水稻活性氧清除基因表达，提高水稻盐胁迫下活性氧清除能力，有效降低盐胁迫下活性氧积累，提高水稻盐胁迫耐性，对探索提高水稻盐胁迫耐性提供一种新途径和新方法。
发明内容
本发明公开了OsJAB1蛋白及其在提高水稻盐胁迫耐性中的应用。
OsJAB1蛋白，其氨基酸序列为如下(a)或(b)或(c)所示：
(a)序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
(b)将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物盐胁迫耐性提高相关的由其衍生的蛋白质；
(c)来源于水稻且与(a)具有95％以上同一性且与水稻盐胁迫耐性增加相关的蛋白质。
编码OsJAB1蛋白的基因，其为如下(1)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子：
(1)编码区如序列表SEQ ID NO：2所示的DNA分子；
(2)与(1)具有75％以上同一性且编码与提高植物盐胁迫耐性相关的蛋白的DNA分子；
(3)来源于水稻且与(1)具有90％以上同一性且编码与提高植物盐胁迫耐性相关的蛋白的DNA分子；
(4)在严格条件下与(1)杂交且编码植物与提高植物盐胁迫耐性相关的蛋白的DNA分子。
含OsJAB1基因的表达载体。
含OsJAB1基因的表达载体的工程菌。
OsJAB1蛋白在提高水稻盐胁迫耐性中的应用。
所述水稻为水稻中花11(Oryza sativa L.中花11)或者水稻中花17。
一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入OsJAB1基因，得到与所述出发植物相比增加了盐胁迫耐性的转基因植物；所述OsJAB1基因为编码权利要求1中所述的OsJAB1蛋白的基因。
一种植物育种方法，包括如下步骤：提高目的植物中权利要求1所述蛋白质的活性和/或含量，从而提高植物盐胁迫耐性。
以上任一所述方法中，“在出发植物中导入OsJAB1基因”是通过将重组表达载体导入出发植物实现的。所述重组表达载体为将所述OsJAB1基因插入植物表达载体得到的可以表达所述OsJAB1基因的质粒。所述重组表达载体具体可为：在pCAMBIA2300载体的多克隆位点Pst I插入序列为序列2第196-480位核苷酸所示双链DNA分子得到的重组质粒pCAMBIA2300-dsOsJAB1。
本发明的有益效果：本发明的发明人发现抑制OsJAB1基因表达，可提高植物盐胁迫耐性。理论分析为OsJAB1蛋白通过调控植物抗氧化物维生素C合成关键酶稳定性，提高植物光合系统抗氧化能力，提高植物盐胁迫耐性。研究结果表明OsJAB1蛋白在提高植物盐胁迫耐性中具有重要作用。本发明对于培育高盐胁迫耐性植物和高产作物品种具有重大的应用价值。
附图说明
图1为重组质粒pCAMBIA2300-OsJAB1的元件示意图。
图2为转基因株系中OsJAB1基因的相对表达水平。
图3为OsJAB1水稻转基因株系盐胁迫耐性。
图4为OsJAB1水稻转基因株系中H2O2含量。
图5为转基因株系中活性氧清除基因表达水平。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。将序列表SEQ IDNO：1所示的蛋白质命名为OsJAB1蛋白。水稻cDNA中，OsJAB1蛋白的编码区如序列表SEQ IDNO：2所示，将其命名为OsJAB1基因。
pCAMBIA2300载体，全称为pCAMBIA2300植物双元表达载体：上海联迈生物工程有限公司，产品目录号为LM1383。农杆菌LBA4404：行知生物科技有限公司，产品目录号为AABV02-03。
实施例1转基因植物的获得
一、重组质粒的构建
1、提取水稻中花11的总RNA，然后反转录得到cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
F1:5'-ATCTCCTCGAGGCGCTCCTCAAGATGGTC-3'
R1:5'-ATCTCAGATCTGCATCTGAGTAGACACAT-3'
3、用限制性内切酶XhoⅠ与BglⅡ双酶切步骤2得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶XhoⅠ与BglⅡ双酶切链接到pUCCRNAi载体，回收载体骨架。
5、用SalⅠ与BamHⅠ酶切构建好的含单向插入序列的pUCCRNAi载体，与XhoⅠ与BglⅡ双酶切的PCR扩增产物连接(XhoⅠ与BamHⅠ，BglⅡ与SalⅠ是同尾酶)，转化，阳性克隆鉴定；
6、用PstⅠ单酶切含有双向插入序列的pUCCRNAi质粒，琼脂糖回收试剂盒回收目的片段；
7、用PstⅠ单酶切pCAMBIA2300，酶切产物去磷酸化，琼脂糖回收试剂盒回收；
8、将步骤6得到的酶切产物和步骤7得到的载体骨架连接，得到重组质粒pCAMBIA2300-OsJAB1。根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA2300-OsJAB1进行结构描述如下：在pCAMBIA2300载体的PstⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列1第196-476位核苷酸所示的双链DNA分子。重组质粒pCAMBIA2300-OsJAB1的元件示意图见图1。
二、转基因OsJAB1基因水稻的获得
1、将重组质粒pCAMBIA2300-OsJAB1导入农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌。
2、将步骤1得到的重组农杆菌悬浮于液体ASAA培养基中，得到OD600nm值＝0.3的菌液。
液体ASAA培养基：含2mg/L 2，4-D和100μM/LAS的液体NB培养基。
3、取水稻中花11的种子，用75％乙醇灭菌，然后置于固体NB培养基平板上，28℃暗培养2周，然后将愈伤组织转移到新的固体NB培养基平板上28℃暗培养2周，然后将愈伤组织转移到新的固体NB培养基平板上28℃暗培养2周。
4、完成步骤3后，将愈伤组织中自然分散、颜色淡黄的胚性愈伤颗粒置于继代培养基平板上，28℃暗培养3天。
继代培养基：含2mg/L2，4-D的固体NB培养基。
5、完成步骤4后，取愈伤组织，置于步骤2得到的菌液中浸泡15分钟，其间轻轻摇动。
6、完成步骤5后，取愈伤组织，用滤纸吸干表面菌液，然后置于共培养培养基平板上，22℃暗培养3天。
共培养培养基：含2mg/L 2,4-D和100μM AS的固体NB培养基。
7、完成步骤6后，取愈伤组织，置于筛选培养基平板上28℃暗培养2周，然后将愈伤组织转移到新的筛选培养基平板上28℃暗培养2周，然后将愈伤组织转移到新的筛选培养基平板上28℃暗培养2周。
筛选培养基:含2mg/L 2,4-D和50mg/LG418的固体NB培养基。
8、完成步骤7后，取生长旺盛，呈乳白色或微黄色的新鲜愈伤组织，置于预分化培养基平板上，先28℃暗培养1周再28℃光照培养2周，然后转移到分化培养基平板上，28℃光照培养，得到分化苗。
预分化培养基：含5mg/L ABA和0.5mg/L NAA的固体NB培养基。
分化培养基：含0.5mg/L NAA和3mg/L6-BA的固体NB培养基。
9、完成步骤8后，将长势好的分化成苗转移至装有固体MS培养基的三角瓶内，28℃光照培养2周后移栽至温室，持续培养至收获种子，即为T1代种子。
10、将T1代种子培育为植株，即为T1代植株，T1代植株自交，得到T2代种子。
12、将T2代种子培育为植株，即为T2代植株，T2代植株自交，得到T3代种子。
13、将T3代种子培育为植株，即为T3代植株。
对于某一T1代植株来说，如果满足如下两个条件，该T1代植株即为单拷贝插入的转基因植株：①该T1代植株具有G418抗性；②该T1代植株自交得到的T2代植株中，G418抗性植株与非G418抗性植株的数量比基本符合3:1。
对于某一T2代植株来说，如果满足如下三个条件，该T2代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系：①该T2代植株具有G418抗性；②其T1代植株为单拷贝插入的转基因植株；③其抽样检测的T3代植株均具有G418抗性。
三、PCR鉴定
随机从步骤三得到的纯合的转基因株系中取2个株系，OE1株系和OE2株系，对T3代植株进行鉴定。将水稻中花11作为转基因株系的野生型对照。
提取植株幼穗(抽穗前1周)中的总RNA，反转录为cDNA,将cDNA作为模板，通过定量PCR鉴定OsJAB1基因的表达水平。
PCR鉴定OsJAB1基因的引物如下：
F2：5'-GGTAACTCGGGATAGCTC-3'；
R2：5'-TGCTTCAACCATAGGCTCAG-3'。
将水稻中花11植株幼穗中OsJAB1基因的表达水平作为1,计算转基因株系的植株幼穗中OsJAB1基因的相对表达水平。
结果见图2。
实施例2转基因株系中OsJAB1基因及活性氧清除相关基因表达水平检测
供试植株：OE1株系的T3代植株、OE2株系的T3代植株和水稻中花11植株(WT)。
提取供试幼苗(抽4周龄)的总RNA，反转录为cDNA,将cDNA作为模板，通过定量PCR鉴定各个相关基因的表达水平。将水稻中花11幼苗中基因的表达水平作为1,计算转基因株系中该基因的相对表达水平。结果见图5。转基因植株幼苗中的各个活性氧清除合成相关基因的相对表达量均高于水稻中花11植株中的表达量，表明抑制OsJAB1基因转录水平可以显著提高OsAPX1等水稻活性氧清除相关基因表达。上述结果显示OsJAB1基因表达水平对水稻活性氧清除相关基因的表达有重要的影响，抑制OsJAB1基因表达可以通过增加水稻活性氧清除相关基因的表达，进而提高对水稻盐胁迫耐性。
实施例3转基因植株水稻盐胁迫耐性分析
供试植株：水稻中花11植株(WT)、RI1株系的T3代植株和RI2株系的T3代植株。供试植株种植于试验场田间，按生产规范要求种植。
图3中A是不同材料水稻盐胁迫耐性的照片。图3中B是不同材料水稻盐胁迫耐性的统计分析。与水稻中花11相比，转基因植株的发病程度均小于野生型对照，转基因植株发病的严重性也显著低于对照野生型，表明过表达OsJAB1基因对提高水稻纹枯病抗病性有重要作用。OsJAB1基因可以通过增加水稻抗病相关基因表达，提高水稻盐胁迫耐性。
实施例4为转基因株系中H2O2含量检测
供试植株：RI1株系的T3代植株、RI2株系的T3代植株和水稻中花11植株(WT)。
取供试幼苗(3周龄)叶片50毫克，在200mM每氯酸(HClO4)中匀浆。在4℃、10000g离心15分钟后，将500μL上清液转移到1.5mL试管中。取上述提取液中100μL体积的上清液来测量H2O2含量。然后用上海酶联生物科技有限公司H2O2检测试剂盒(货号:ml095171)检测H2O2的含量。利用标准检测纯度H2O2获得每个独立实验的H2O2的标准曲线，利用标准曲线计算H2O2的含量。上述结果显示OsJAB1基因表达水平对水稻活性氧含量有重要的影响，抑制OsJAB1基因表达可以有效降低水稻活性氧清含量，进而提高对水稻盐胁迫耐性。结果见图4-5。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.OsJAB1蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为如下(a)或(b)或(c)所示：
(a)序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
(b)将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物盐胁迫耐性提高相关的由其衍生的蛋白质；
(c)来源于水稻且与(a)具有95％以上同一性且与水稻盐胁迫耐性增加相关的蛋白质。
2.编码OsJAB1蛋白的基因，其特征在于，其为如下(1)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子：
(1)编码区如序列表SEQ ID NO：2所示的DNA分子；
(2)与(1)具有75％以上同一性且编码与提高植物盐胁迫耐性相关的蛋白的DNA分子；
(3)来源于水稻且与(1)具有90％以上同一性且编码与提高植物盐胁迫耐性相关的蛋白的DNA分子；
(4)在严格条件下与(1)杂交且编码植物与提高植物盐胁迫耐性相关的蛋白的DNA分子。
3.含OsJAB1基因的表达载体。
4.含OsJAB1基因的表达载体的工程菌。
5.OsJAB1蛋白在提高水稻盐胁迫耐性中的应用。
6.根据权利要求5所述OsJAB1蛋白在提高水稻盐胁迫耐性中的应用，其特征在于，所述水稻为水稻中花11或者水稻中花17。
7.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：在出发植物中导入OsJAB1基因，得到与所述出发植物相比增加了盐胁迫耐性的转基因植物；所述OsJAB1基因为编码权利要求1中所述的OsJAB1蛋白的基因。
8.一种植物育种方法，其特征在于，包括如下步骤：提高目的植物中权利要求1所述蛋白质的活性和/或含量，从而提高植物盐胁迫耐性。
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