CN115873868B - 水稻OsFIE1突变型基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明水稻OsFIE1突变型基因及其编码蛋白与应用，属于生物育种技术领域。OsFIE1突变型基因包括在OsFIE1野生型基因的第508‑514位核苷酸缺失，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1；或者，在OsFIE1野生型基因的第513‑514位和第627‑628位核苷酸同时缺失，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2。本发明还提供了上述两种OsFIE1突变型基因编码获得的水稻OsFIE1突变型蛋白。本发明发现水稻基因OsFIE1参与调控水稻籽粒糊粉层发育。通过CRISPR/Cas9技术定点编辑OsFIE1基因，使正常OsFIE1蛋白功能丧失，获得籽粒糊粉层稳定增厚的材料，提高稻米营养价值。
Description
技术领域
本发明属于生物育种技术领域，具体涉及水稻OsFIE1突变型基因及其编码蛋白与应用。
背景技术
水稻是我国最重要的粮食作物，其产量和品质一直是遗传育种重点。我国人口持续增长、经济持续发展，人均耕地面积与自然资源减少，以及高低温、干旱洪水等恶劣环境时有发生。因此，需要选育高产、高品质、适应性强、抗病的品种，保障我国粮食安全和人民的生活需求。
水稻籽粒(又称为糙米或全谷物)主要是由种皮、胚和胚乳组成，其中胚乳根据细胞形态和功能不同，可以分为糊粉细胞和内胚乳细胞。内胚乳细胞主要积累淀粉和蛋白质，而糊粉层富含贮藏蛋白、脂类、维生素、膳食纤维和矿物质等更为丰富的营养物质。市场上加工好的精米已经被去除种皮、胚和糊粉层，造成稻米营养的大量流失。随着经济发展以及对健康生活的追求，精白米和精白面已经不能完全满足人民群众对“吃得健康”的要求。《中国居民膳食指南(2022)》推荐成年人每人每天摄入谷类200-300g，其中包含全谷物和杂豆类50-150g，市场对具有更丰富、更均衡养分的粗粮需求日益加大。
对于一般水稻品种，在籽粒背侧通常有3-4层糊粉层，而腹侧仅有1-2层。通过增加糊粉层厚度，可以提高稻米的营养品质。寻找糊粉层增厚的优异种质并发掘其调控基因，对高营养稻米育种和遗传改良具有重要意义。此外，通过植物工程技术，可以加快常规育种的育种周期、提高定向选择效率。为了准确有效的开展现代分子遗传育种，需要对决定相关重要目标性状的基因进行精细准确的研究。故此，利用现代分子遗传技术开展水稻糊粉层相关研究，将有助于水稻分子遗传育种，为其提供精准的基因资源。
本发明通过对一个水稻基因OsFIE1的功能研究，发现其功能突变后可以显著增加水稻糊粉层厚度，对于提高稻米品质具有重要应用潜力。迄今为止，没有研究发表过有关水稻OsFIE1基因对糊粉层发育调控的内容，也未有其在水稻育种中的应用报导。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供水稻OsFIE1突变型基因及其编码蛋白与应用。本发明发现水稻基因OsFIE1参与调控水稻籽粒糊粉层发育。通过CRISPR/Cas9技术定点编辑OsFIE1基因，使正常OsFIE1蛋白功能丧失，获得籽粒糊粉层稳定增厚的材料，提高稻米营养价值。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供了水稻OsFIE1突变型基因，所述OsFIE1突变型基因包括在OsFIE1野生型基因的第508-514位核苷酸缺失，共7个核苷酸缺失；或者，在OsFIE1野生型基因的第513-514位和第627-628位核苷酸同时缺失，共4个核苷酸缺失。
所述的水稻OsFIE1突变型基因，所述在OsFIE1野生型基因的第508-514位核苷酸缺失突变形成的OsFIE1突变型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在OsFIE1野生型基因的第513-514位和第627-628位核苷酸同时缺失突变形成的OsFIE1突变型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，本发明提供了水稻OsFIE1突变型蛋白，由所述的水稻OsFIE1突变型基因编码获得的。
所述的水稻OsFIE1突变型蛋白，在OsFIE1野生型基因的第508-514位核苷酸缺失形成的OsFIE1突变型基因编码的OsFIE1突变型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，在OsFIE1野生型基因的第513-514位和第627-628位核苷酸同时缺失突变形成的OsFIE1突变型基因编码的OsFIE1突变型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
第三方面，本发明提供了OsFIE1基因突变型水稻，使水稻包含所述的OsFIE1突变型基因，或，使水稻表达所述的OsFIE1突变型蛋白。
所述的OsFIE1基因突变型水稻，所述OsFIE1基因突变型水稻的获得方法包括转基因、杂交、回交或无性繁殖。
所述的OsFIE1基因突变型水稻，所述转基因的方法包括：在诱导培养基上诱导水稻愈伤；同时采用CRISPR/Cas9方法对OsFIE1基因进行定点编辑，将获得的CRISPR/Cas9基因编辑载体转化到农杆菌，再通过农杆菌侵染水稻愈伤，随后在培养基上对愈伤进行筛选、分化、生根成苗；将完整的转基因苗移入稻田种植，并通过单株测序鉴定得到正确编辑OsFIE1的转基因植株；
其中，CRISPR/Cas9基因编辑载体包含OsFIE1突变型基因的前导靶向序列OsFIE1-SG。
CRISPR/Cas9技术定点编辑OsFIE1基因，使正常OsFIE1蛋白功能丧失，获得籽粒糊粉层稳定增厚的材料。本发明对所述OsFIE1编辑载体转化根癌农杆菌、含有载体的根癌农杆菌转化水稻两个试验方法上没有特殊限定，均采用常规转化方法。
所述的OsFIE1基因突变型水稻，所述OsFIE1突变型基因的前导靶向序列OsFIE1-SG的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
第四方面，本发明提供了任一项所述的OsFIE1基因突变型水稻在增加水稻糊粉层厚度中的应用。
第五方面，本发明提供了一种试剂盒，包含所述的水稻OsFIE1突变型基因或所述的OsFIE1突变型蛋白、核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的引物OsFIE1-cxF、核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物OsFIE1-cxR。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对OsFIE1(LOC_Os08g04290)进行定点编辑。通过对编辑材料的性状考察发现，相比于未编辑的野生型材料，编辑材料的营养生长未见异常，但是编辑材料的籽粒糊粉层显著增加，脂肪、维生素和矿质元素等营养成分的含量显著或极显著升高。本发明提供的基因编辑材料在不影响水稻其他农艺性状的前提下提高了稻米营养品质，为分子遗传育种提供了遗传种质资源，在选育高营养价值水稻品种中具有重要应用价值。
附图说明
图1为水稻OsFIE1的基因结构图；
图2为水稻OsFIE1基因编辑材料的测序峰图；
图3为OsFIE1功能缺失材料的推导编码蛋白序列与对照野生型Kitaake蛋白序列比对结果；
图4为水稻OsFIE1的基因的表达模式图；
图5为对照野生型Kitaake，OsFIE1功能缺失材料的植株株型比较，标尺＝10cm；
图6为对照野生型Kitaake，OsFIE1功能缺失材料水稻籽粒纵切碘染，标尺＝1mm；
图7为对照野生型Kitaake，OsFIE1功能缺失材料水稻籽粒糊粉层厚度统计。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本发明进行进一步详细说明。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规步骤进行，所用材料和试剂均为市售商品，本领域技术人员均可理解。
以下实施例是在合适的培养基上诱导水稻品种Kitaake的愈伤，同时将CRISPR/Cas9基因编辑载体转化到农杆菌EHA105(购买于唯地生物技术有限公司)，再通过农杆菌侵染水稻品种Kitaake愈伤，随后在合适的培养基上对愈伤进行筛选、分化、生根成苗；将完整的阳性转基因苗移入稻田种植，得到基因改良水稻材料。
实施例1CRISPR/Cas9-OsFIE1基因编辑载体构建
1、寻找基因定点编辑的特异性前导序列
OsFIE1位于水稻第八染色体，登录号为LOC_Os08g04290或Os08g0137250，基因序列位于2095644到2100604之间，有14个外显子，编码多梳抑制复合体的类Esc核心组件，如图1为水稻OsFIE1的基因结构图。
通过基因编辑靶标设计网站http://skl.scau.edu.cn/，输入目标基因号LOC_Os08g04290，选择靠基因前且特异性强的目标序列，且目标序列应在外显子上，即为OsFIE1的编辑所需的前导序列(Guide Sequence)，碱基为：OsFIE1-SG(SEQ ID NO.5)：ACTCCAGAGTTGCCAAGGAA(+498bp～+517bp，OsFIE1基因第498位碱基到517位碱基)。
2、载体构建与农杆菌转化保存
根据前导序列，设计并合成以下引物序列：
OsFIE1-SG-F(SEQ ID NO.6)：ACTCCAGAGTTGCCAAGGAAgttttagagctagaaat；
OsFIE1-SG-R(SEQ ID NO.7)：TTCCTTGGCAACTCTGGAGTcggcagccaagccagca；
OsFIE1-SG–F与OsFIE1-SG–R的大写核苷酸分别为前导序列的正反向互补序列；小写核苷酸为中间载体pYLsgRNA-OsU6a质粒DNA(来自华南农业大学刘耀光院士实验室)中序列。将这两条引物通过碱基互补形成带有粘性末端的片段，再通过无缝克隆将目的片段连接到中间载体pYLsgRNA-OsU6a。
然后用合适的限制性内切酶将最终载体pYLCRISPR/Cas9-pUbi-H载体(质粒DNA由华南农业大学刘耀光院士提供)与含有目的片段的中间载体线性化，最终通过T4连接酶将目的片段插入双元载体pYLCRISPR/Cas9-pUbi-H。连接反应液通过42℃热激转化进入大肠杆菌DH5a，在卡那霉素培养基上倒置培养过夜，挑选单克隆，通过摇菌提质粒送测序公司测序，测序正确即为阳性重组载体CRISPR/Cas9-OsFIE1。
将阳性重组载体CRISPR/Cas9-OsFIE1通过37℃热激转化到农杆菌EHA105菌株中，在利福平和卡那霉素培养基上倒置培养过夜，挑选单克隆摇菌并于-80℃保菌备用；保存的菌为CRISPR/Cas9-OsFIE1基因编辑载体的工程菌。
实施例2转基因水稻的获得
1、愈伤组织诱导：
取水稻植青黄交接种子(约20天)，42℃烘干后脱壳。选取完整的去壳种子用75％酒精反复翻转清洗1分钟，弃清洗液，重复2次；25％次氯酸钠(2滴表面活性剂TWEEN20，混合)反复翻转清洗40分钟，弃清洗液，后续操作均需在超净台上进行无菌操作。再用无菌水反复翻转清洗种子10分钟，弃清洗液，重复2-3次；均匀播种于MSD1(pH5.8，Sucrose 30g/L，MS Media 4.4g/L，Agar 0.8％，2,4-D 2mg/L)培养基，黑暗或光照培养在28℃恒温条件下，15天后切割下愈伤，并将愈伤组织播种于新的MSD1培养基。
2、农杆菌浸染：
CRISPR/Cas9-OsFIE1基因编辑载体的农杆菌在28℃摇菌过夜，获得新鲜的农杆菌。新鲜农杆菌按1：30比例接种于TY溶液(pH5.5，Yeast Extra 3g/L，Tryptone 5g/L，Acetos-yringone0.2M)，25℃避光摇菌3小时后，放入约30天的愈伤，避光浸染30分钟，将愈伤放到无菌纸上让其充分干燥，均匀转移到MSD2(pH5.8，Sucrose 30g/L，MS Media 4.4g/L，Sorbitol 50g/L，Agar 1.4％，2,4-D 2mg/L，Acetosyringone 0.2M)培养基，暗培养2-3天。
3、HYG筛选：
将MSD2培养基上没有粘液的黄褐色或者浅黄色愈伤挑取，放入MSD(pH5.8，Sucrose30g/L，MS Media 4.4g/L，Carbenicillin 400mg/L，Plant Preservative Mixture1ml/L)液体清洗10分钟，倒掉清洗液，重复3次。再将愈伤放到无菌纸上让其充分干燥，均匀转移到MSD3(pH5.8，Sucrose 30g/L，MS Media 4.4g/L，Agar 0.8％，2,4-D 2mg/L，Carbenicillin 250mg/L，Plant Preservative Mixture 1ml/L，Hygromycin B 50mg/L)培养基，放置于28℃恒温、不间断光照的培养箱30-50天，期间需更换2-3次MSD3培养基。除第一次MSD3培养基需要高浓度Cab，后面可逐步减半用量。在此期间如若有愈伤长菌，同一个培养基板子上其余正常愈伤需尽快转移至新的MSD3培养基。
4、诱导愈伤分化：
在MSD3培养基上30-50天，转化成功的愈伤会逐渐长大，分出一些小愈伤。此时需要转移愈伤至MSD4(pH5.8，Sucrose 30g/L，MS Media 4.4g/L，Sorbitol 50g/L，Agar1.4％，N-(Phenylmethyl)-9H-purin-6-amine 3mg/L，NAA 0.5mg/L，Carbenicillin 50mg/L，Hygromycin B 50mg/L)培养基，放置于28℃恒温、不间断光照的培养箱30-50天，期间需更换2-3次MSD4培养基。
5、生根成苗：
愈伤在MSD4培养基30天可能会变绿，变绿的愈伤转移至MSD4(pH5.8，Sucrose30g/L，MS Media 4.4g/L，Agar 1.4％，Carbenicillin 50mg/L，Hygromycin B 50mg/L)培养基，放置于28℃恒温、不间断光照的培养箱30天。在此期间变绿的愈伤会逐渐分化成为一株株完整的苗，同一个愈伤来源的苗只能算一个系。苗长10cm就可以转移出无菌环境，清洗掉残留的培养基与愈伤，在自来水或者基础培养液中过度2-3天后，转移至土壤环境中生长。最终移栽到土壤里正常生长得到12个转基因系的转基因材料。
实施例3测定基因编辑材料突变位置序列
利用CTAB法分别单株提取转基因材料和未编辑材料Kitaake幼嫩叶片的DNA，设计并使用下列引物将编辑位点序列扩增出来，引物序列为：
OsFIE1-cxF(SEQ ID NO.8)：(+401)GCACCGAATGAAGCCAAAC(+419)；
OsFIE1-cxR(SEQ ID NO.9)：(+754)GTGGCGAAGATGTCGTAGTAG(+774)。
将PCR扩增产物送擎科生物有限公司进行测序，并将测序结果进行比对分析。通过对基因编辑材料的叶片进行提取DNA，再PCR扩增测序；野生型为非转基因材料Kitaake(Kit，WT)得到如图2的水稻OsFIE1基因编辑材料的测序峰图。选择峰图单一的结果，与未编辑材料Kitaake的结果进行比对分析，图2中显示的“-”即为突变体中缺失的序列，选择插入和缺失非3碱基倍数的突变体，得到两个如下基因编辑成功的转基因材料：fie1-1(由于在OsFIE1野生型基因的第508-514位核苷酸缺失，共7bp缺失获得的转基因材料，碱基序列如SEQ ID NO.1所示)、fie1-2(由于在OsFIE1野生型基因的第513-514位和第627-628位核苷酸同时缺失获得的转基因材料，共4bp缺失，碱基序列如SEQ ID NO.2所示)。
根据测序结果，得到SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2的序列信息；在软件SnapGeneViewer上查看SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2的碱基序列，寻找突变位点后的终止密码子序列，得到预测突变蛋白序列，转基因材料fie1-1的在第508-514位核苷酸缺失的基因编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，转基因材料fie1-2的第513-514位和第627-628位核苷酸同时缺失的基因编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。将野生型OsFIE1蛋白序列、SEQID NO.3的蛋白序列、SEQ ID NO.4的蛋白序列，通过软件MEG7比对，得到图3关于OsFIE1功能缺失材料fie1-1和fie1-2的推导编码蛋白序列与对照野生型Kitaake蛋白序列比对结果。
实施例4OsFIE1在野生型水稻不同组织中的表达模式
首先是提取野生型材料Kitaake的根、幼苗、叶鞘、茎、叶片、幼穗、花药以及不同发育时期颖果的RNA，采用诺唯赞产品RNA-easy Isolation Reagent(https://www.vazyme.com/product/261.html)，流程为：液氮研磨样品→加入提取液裂解样本→加入RNase-free ddH2O→室温离心→吸取含有RNA的上清→加入异丙醇→室温离心→75％酒精洗涤→室温离心→干燥沉淀→加入RNase-free ddH2O→室温溶解。
下一步是RNA反转录，使用诺唯赞试剂HiScript Q RT SuperMix for qPCR(https://www.vazyme.com/product/95.html)。操作步骤遵循说明书，首先利用4×gDNAwiper Mix去除基因组DNA，再利用5×qRT SuperMix II进行cDNA第一链合成。合成的cDNA稀释10倍，可直接用于实时荧光定量PCR。荧光定量采用诺唯赞试剂盒AceQ qPCR SYBRGreen Master Mix(https://www.vazyme.com/product/65.html)，按说明书配置反应体系，采用BIO-RAD仪器CFX Connect Real-Time System进行定量反应与数据读取，数据采用ΔΔCT法计算相对表达量。
实时荧光定量PCR引物如下：
OsFIE1-qrt-F(SEQ ID NO.10)：TAACACCGAGTCGGGAGC
OsFIE1-qrt-R(SEQ ID NO.11)：CGAAGATGTCGTAGTAGCG
通过分析实时荧光定量PCR分析OsFIE1在不同组织和受精后不同时期颖果中的表达模式，结果如图4，在野生型中，OsFIE1仅在受精后(DAF)的颖果中表达，其他检测组织中表达量极低，数值代表的是3次独立生物学重复的实验平均值±标准差。在1、2、3、4、5DAF的颖果中，OsFIE1表达水平逐渐升高，OsFIE1表达水平在5DAF达到最高，随后逐渐下降。
实施例5水稻OsFIE1基因编辑材料应用可行性分析
首先评估实施例2获得的2个基因编辑材料fie1-1、fie1-2的植株营养生长，发现相比于未被编辑的野生型品种Kitaake(WT)，基因编辑材料fie1-1、fie1-2在株高、分蘖等性状均生长正常，如图5所示，OsFIE1功能缺失材料的植株株型未见明显差异。在生殖生长方面，基因编辑材料穗子发育和籽粒灌浆未见明显异常。但是通过对籽粒纵切碘染发现，相比于野生型，基因编辑材料籽粒糊粉层厚度比对照极显著提高如图6所示，与野生型对照材料相比，OsFIE1功能缺失材料籽粒糊粉层厚度显著增加。如图7所示，与野生型非转基因材料相比，OsFIE1功能缺失材料籽粒糊粉层厚度极显著增加；数据均以平均值±标准差表示，样品数n>50，t测验：*，P<0.05；**，P<0.01。通过代谢组分和元素测定发现，相比于野生型，基因编辑材料籽粒γ-氨基丁酸、总氨基酸、总酚、维生素B3、维生素E、总脂质、总氮、硼、钠、镁、磷、硫、钾、钙、铁、铜、锌、锶含量显著或极显著升高，植酸、镍含量均极显著降低(表1-2)。本发明提供的基因和基因工程技术手段在不影响水稻其他农艺性状的前提下，可显著提高水稻营养价值，具有很高的应用价值。
表1野生型和OsFIE1功能缺失材料水稻籽粒代谢组分含量统计比较
由表1可知，OsFIE1功能缺失导致水稻籽粒总酚、总氨基酸等代谢组分含量显著增加；数据均以平均值±标准差表示，t测验：*，P<0.05；**，P<0.01。
表2野生型和OsFIE1功能缺失材料水稻籽粒元素含量统计比较
由表2可知，相比于野生型，功能缺失材料籽粒的钙、铁、锌等诸多元素含量显著增加；数据均以平均值±标准差表示，t测验：*，P<0.05；**，P<0.01。
Claims (4)
1.一种增加水稻籽粒糊粉层厚度的方法，其特征在于，用OsFIE1突变型基因替换水稻基因组中OsFIE1野生型基因，所述OsFIE1突变型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或如SEQ ID NO.2所示，所述OsFIE1野生型基因的NCBI登录号为Os08g0137250。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，OsFIE1突变型蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，或如SEQ ID NO.4所示。
3.一种转基因水稻的制备方法，其特征在于，对水稻OsFIE1基因进行基因编辑，使OsFIE1基因编码的蛋白功能缺失，所述水稻OsFIE1基因的NCBI登录号为Os08g0137250，所述转基因水稻的籽粒糊粉层厚度增加。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述进行基因编辑采用CRISPR/Cas9系统。
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| CN108517356A (zh) * | 2018-04-16 | 2018-09-11 | 河北师范大学 | 一种避免转基因水稻育种败育的方法 |
-
2022
- 2022-12-07 CN CN202211565826.3A patent/CN115873868B/zh active Active
Patent Citations (4)
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| CN101698677A (zh) * | 2009-10-29 | 2010-04-28 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种植物株高相关蛋白及其编码基因与应用 |
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