CN111440805B

CN111440805B - Nf-yb9突变型基因及其蛋白和应用

Info

Publication number: CN111440805B
Application number: CN202010459528.0A
Authority: CN
Inventors: 牛百晓; 张真雨; 张娟; 魏雪枫; 陈忱
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2020-05-26
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2040-05-26
Also published as: CN111440805A

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及水稻NF‑Y转录因子家族突变型基因NF‑YB9及其编码蛋白的功能和应用。本发明发现水稻基因NF‑YB9及其编码蛋白参与调控水稻籽粒发育，通过破坏NF‑YB9基因编码蛋白的生物学功能能够显著增加水稻籽粒长度。本发明利用CRISPR/Cas9技术实现了高效的NF‑YB9基因定点编辑，NF‑YB9功能缺失后，水稻籽粒长度显著增长。本发明提供的水稻NF‑Y转录因子家族基因NF‑YB9的新功能为植物育种提供了候选基因，在农业生产上具有十分重要的应用价值。

Description

NF-YB9突变型基因及其蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及NF-YB9突变型基因及其蛋白和应用。

背景技术

水稻是目前国内外最主要的粮食作物，提高水稻产量是植物科学研究的主要目的。随着我国人口的持续增加，耕地面积和自然资源减少，以及环境的恶化，提高水稻产量和品质仍是保障我国粮食安全和社会稳定的重大需求。

粒重、每穗粒数和每株穗数是决定水稻产量的三个组成部分，其中粒重又由粒长、粒宽和粒厚度决定。粒长不仅作为重要的产量性状成为育种目标，它还影响稻谷整精米率、烹煮特性和适口性等品质和外观，成为品质育种中的主要选择指标之一。

与传统育种相比，分子育种具有选择效率高、育种周期短等优势，而开展分子育种的基础是重要目标性状基因的克隆和功能研究，准确了解了目标基因的生物学功能和遗传效应才能开展分子育种。因此，挖掘和利用水稻籽粒长度发育相关基因的研究，有助于产量、品质的育种工作，为开展水稻高产分子育种提供重要遗传信息和基因资源。

到目前，没有转录因子NF-YB9功能缺失相关研究和在水稻育种的应用的报道。

发明内容

发明目的：本发明提供的水稻NF-Y转录因子家族基因NF-YB9的新功能为植物育种提供了候选基因，在农业生产上具有十分重要的应用价值。本发明通过对CRISPR/Cas9技术创制的编辑NF-YB9(LOC_Os06g17480)的水稻农艺性状评价，发现该基因的编辑不影响水稻的营养生长，但是能够显著增加水稻粒长。本发明提供的基因及操作技术在提高作物产量方面具有明显的作用，具有很高的应用价值。

本发明所要解决的第一个技术问题是提供了NF-YB9突变型基因。

本发明还要解决的技术问题是提供了扩增所述的NF-YB9突变型基因的前导基因。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的NF-YB9突变型基因的突变型蛋白。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述NF-YB9突变型基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的NF-YB9突变型基因、所述的突变型基因的前导基因、所述的突变型蛋白，所述的基因编辑载体在控制水稻粒型中的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了基因改良的转基因水稻的获得方法以及鉴定所述基因改良的转基因水稻的方法。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：NF-YB9突变型基因，所述NF-YB9突变型基因在NF-YB9野生型基因的第14～17位核苷酸缺失；或第17～18位核苷酸缺失同时第20～45位核苷酸缺失；或第17～45位核苷酸缺失；或第14～17位核苷酸缺失以及第19位核苷酸缺失同时第43～49位核苷酸缺失。

其中，所述NF-YB9突变型基因其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。

本发明内容还包括扩增所述的NF-YB9突变型基因的前导基因，其碱基序列包括如序列表中SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。

本发明内容还包括含有所述的NF-YB9突变型基因的突变型蛋白。

其中，所述的突变型蛋白，其氨基酸序列如如序列表中SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。

本发明内容还包括所述的NF-YB9突变型基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体。

本发明内容还包括所述的NF-YB9突变型基因、所述的突变型基因的前导基因、所述的突变型蛋白，所述的基因编辑载体在控制水稻粒型中的应用。

本发明内容还包括一种基因改良的转基因水稻的获得方法，包括如下步骤：

1)使水稻包含所述的NF-YB9突变型基因；或

2)使水稻表达所述的突变型蛋白。

其中，所述的方法包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。

具体地，所述转基因水稻获得方法是利用农杆菌将CRISPR/Cas9基因编辑载体转化到水稻品种Kitaake中，并筛选得到基因改良的水稻植株；

具体方法如下：

(1)利用水稻品种Kitaake成熟种子诱导愈伤；

(2)用含有CRISPR/Cas9基因编辑载体转化农杆菌EHA105侵染水稻愈伤组织，并于22℃光照培养箱中共培养2天，再用液体培养基洗去农杆菌后，将水稻愈伤放置在含有合适潮霉素HPT的筛选培养基上培养。经过一周培养后，可获得抗性愈伤，将抗性愈伤转移分化培养基，等愈伤组织上生成小苗，将小苗种植于转基因水稻田中即得基因改良的转基因水稻。

本发明对所述表达载体转化根癌农杆菌的方法没有特殊限定，采用常规转化根癌农杆菌的方法即可。本发明对所述转化后的根癌农杆菌转化水稻的方法没有特殊限定，采用常规转化水稻的方法即可。

本发明内容还包括鉴定所述的方法获得的转基因水稻的方法，包括以下步骤：

1)测定所述水稻是否包含所述的NF-YB9突变型基因；或，

2)测定所述水稻是否表达所述的突变型蛋白。

本发明还提供检测CRISPR/Cas9定点编辑转基因材料突变体的鉴定：具体地，通过设计引物将CRISPR/Cas9编辑位点区域扩增出来，引物序列为：

NF-YB9-sF：GTAGTGAAGGAAGTGCAATAAA：

NF-YB9-sR：CCATGGCCCAGACGAGGT。

有益效果：本发明公开了水稻NF-YB9基因在改变水稻粒形中的应用，利用CRISPR/Cas9技术水稻NF-YB9进行定点编辑，获得了NF-YB9突变型基因和突变型蛋白，通过农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织，获得转基因水稻，与对照相比，转基因水稻的粒长增加、本发明提供的基因和基因工程技术手段在不影响水稻其他农艺性状的前提下具有很大的应用价值。

附图说明

图1水稻NF-YB9的基因结构；NF-YB9位于水稻第六染色体基因组序列位点10137823到10138746之间，登录号为LOC_Os06g17480，无内含子，编码类组蛋白结构蛋白；

图2水稻NF-YB9的基因的表达模式。取野生型材料Kitaake的根、茎、叶、穗、愈伤组织以及不同发育时期的颖果和胚，利用荧光定量PCR(qRT-PCR)分析NF-YB9组织表达模式。NF-YB9主要在胚乳中表达，在授粉后3天的颖果中表达激活，在授粉后5天表达达到最高峰；其中ubiquitin基因的表达水平作为内参，数值代表的是3次独立实验的平均值±标准差(**，P＜0.01)；

图3本发明中基于CRISPR/Cas9技术水稻基因NF-YB9定点编辑转基因水稻叶片PCR检测，测序峰图；WT为非转基因野生型(kitaake，日本品种类型粳型常规水稻)对照；

图4本发明中CRISPR/Cas9技术编辑水稻基因NF-YB9定点突变推导编码蛋白序列与野生型蛋白序列比对结果；

图5野生型kitaake和CRISPR/Cas9技术编辑水稻基因NF-YB9定点突变体nf-yb9-1和nf-yb9-2基因表达检测，检测材料为不同发育时期的水稻籽粒；

图6对照野生型kitaake，NF-YB9功能缺失材料的植株株型比较，NF-YB9功能缺失材料的营养生长没有受到影响，标尺＝10cm；

图7对照野生型kitaake，NF-YB9功能缺失材料水稻籽粒形态，与野生型非转基因材料相比，NF-YB9功能缺失材料籽粒长度明显增加；标尺＝1em；

图8野生型和NF-YB9功能缺失材料水稻粒长，粒宽，粒厚，千粒重等统计比较，NF-YB9功能缺失导致水稻籽粒宽度和籽粒厚度显著降低，籽粒长度增加，但千粒重没有显著差异；数据均以平均值±标准差表示(n≥15)，t测验：*，P＜0.05；**，P＜0.01。

图9野生型和突变体稻米的理化性质，总淀粉含量，表观直链淀粉含量(AAC)和胶稠度(GC)比较；与野生型相比，NF-YB9功能缺失材料总淀粉含量和表观直链淀粉含量(AAC)显著降低，胶稠度在4bp缺失材料nf-yb9-1中显著下降，在28bp缺失材料nf-yb9-2中影响不大。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规步骤进行，所用材料和试剂均为市售商品。

以下实施例采用粳型常规水稻品种Kitaake为例，利用农杆菌EHA105(购买于唯地生物技术有限公司)将构建好的CRISPR/Cas9载体转化侵染Kitaake水稻愈伤组织，并筛选获得转基因阳性苗，得到基因改良水稻材料。

实施例1 CRISPR/Cas9-NF-YB9载体的基因工程菌的获得

1、CRISPR/Cas9靶标设计

利用刘耀光实验开发的CRISPR Primer Designer在线软件包(http：//skl.scau.edu.cn/)进行靶标优选。

为了高效的获得敲除突变体材料，本发明同时合成利用两段针对NF-YB9的编辑所需的前导序列(Guide Sequence)对NF-YB9进行定点编辑，所用前导序列碱基为：

NF-YB9-gRNA1：ATGGAGCCCGCATTTCCCAA(+1bp～+20bp，NF-YB9基因第1位碱基到20位碱基)

以及NF-YB9-gRNA2：CGAACGTGATCCGCATCATG(-17bp～+3bp，NF-YB9基因起始密码字ATG上游17位碱基到第NF-YB9基因3位碱基)

2、CRISPR/Cas9载体构建

利用重叠PCR(Overlapping)将目的片段连接到中间载体pYLsgRNA-OsU6a质粒DNA(质粒DNA由华南农业大学刘耀光院士提供)上，具体操作如下：设计目的片段扩增引物，基于中间载体pYLsgRNA-OsU6a序列合成无缝连接扩增引物，引物序列如下：

NF-YB9-gRNA1-F：ATGGAGCCCGCATTTCCCAAgttttagagctagaaat；

NF-YB9-OsU6aT1-R：TTGGGAAATGCGGGCTCCATcggcagccaagccagca；

以及

NF-YB9-gRNA2-F：CGAACGTGATCCGCATCATGgttttagagctagaaat；

NF-YB9-OsU6aT2-R：CATGATGCGGATCACGTTCGcaacacaagcggcagc；

以上序列所示大写字母为编辑靶基因NF-YB9向导序列，小写字母为pYLsgRNA-OsU6a质粒DNA载体序列；然后以线性化的pYLsgRNA-OsU6a为模板，进行PCR扩增；进一步利用无缝克隆(参照诺唯赞ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit)的方法将扩增片段连接到双元载体pYLCRISPR/Cas9-pUbi-H载体(质粒DNA由华南农业大学刘耀光院士提供)中，连接产物转化大肠杆菌DH5a(商业购买，购自全式金生物有限公司)。培养过夜后，将单克隆送测序公司测序，保存阳性质粒和菌液；得到了阳性重组载体CRISPR/Cas9-NF-YB9-gRNA1-gRNA2。

3、CRISPR/Cas9-NF-YB9载体的基因工程菌的获得

将构建的CRISPR/Cas9-NF-YB9-gRNA1-gRNA2载体通过热激法(42℃)转化到农杆菌EHA105菌株中，在平板上通过卡那霉素和利福平筛选，获得含有CRISPR/Cas9-NF-YB9-1、CRISPR/Cas9-NF-YB9-2、CRISPR/Cas9-NF-YB9-3、CRISPR/Cas9-NF-YB9-4载体的基因工程菌。

实施例2转基因水稻的获得

1、本发明中培养基配方：

诱导培养基MSD(pH5.8)：MS media，4.4g/L；Sucrose，30g/L；2，4-D，2.0mg/L；Agar，0.8％；

侵染液Liquid MSD(pH5.8)：MS media，4.4g/L；Sucrose，30g/L；2，4-D，2.0mg/L；

羧苄西林400mg/L；PPM 1ml/L；

共培养基MSD+S+AS(pH5.8)：MS media，4.4g/L；Sucrose，30g/L；2，4-D，2.0mg/L；Sorbitol，5％；Agar，1.4％；

筛选培养基MSD+CH+PPM(pH5.8)：MS media，4.4g/L；Sucrose，30g/L；2，4-D，2.0mg/L；Agar，0.8％；Hygromycin B，50mg/L；羧苄西林，250mg/L；PPM，1ml/L；

分化培养基BN+S+CH(pH5.8)：MS media，4.4g/L；Sucrose，30g/L；Sorbitol，5％；BAP，3mg/L；NAA，0.5mg/L；Agar，0.8％；Hygromycin B，50mg/L；羧苄西林，125mg/L。

根生长培养基MS+H(pH5.8)；MS media4.4g/L；Sucrose30g/L；Agar0.8％；Hygromycin B50mg/L；羧苄西林50mg/L；

2、愈伤组织诱导，收获用于转基因的材料Kitaake成熟的种子，对其脱壳后用70％乙醇灭菌1分钟，然后在15％次氯酸钠中灭菌30分钟，然后在超净工作台上用无菌水冲洗3-5分次；将种子接种在无菌的愈伤组织诱导培养基(MSD)中；在25℃的黑暗环境中放置约15天后，可见到从种子胚的盾片中分离出淡黄色愈伤组织。

3、农杆菌介导的水稻遗传转化

愈伤组织预培养：选择致密且相对干燥的胚性愈伤组织，并接种在新的诱导培养基(MSD)上，在25℃的黑暗中放置4天，进行预培养。

侵染菌液的准备：将构建的载体CRISPR/Cas9-NF-YB9-gRNA1-gRNA2转化到农杆菌EHA105中，之后在28℃下，用适当的抗生素在LB培养液上接种农杆菌2天。将农杆菌转移到悬浮培养基中并振荡培养2小时，直到OD值达到1.0左右。

侵染：将预培养的愈伤组织转移至无菌管中，并将愈伤组织浸入农杆菌悬浮液(Liquid MSD)中30分钟。用无菌滤纸将其干燥，并接种在共培养培养基(MSD+S+AS)上，并在黑暗中于19℃下培养约3天。

共培养：用无菌水清洗愈伤组织几次，直到看不到农杆菌，然后将其浸入含浓度0.05％植物培养抗菌剂ppm(plant culture preservative)的无菌水中30分钟。将愈伤组织转移至筛选培养基(MSD+CH+PPM)中并培养3周；再次转移含量低至0.5‰植物培养抗菌剂ppm的新鲜培养基中进行第二次选择，共培养2周。

筛选：将共培养的愈伤组织在黑暗中转移至分化培养基(BN+S+CH)中7-10天；将好的愈伤组织转移至烧瓶中的分化培养基中，并置于26℃的光照下。此时这些愈伤组织大约一个月之后会变绿。

分化：切掉原始根，然后将小植物转移到根生长培养基(MS+H)中。移出根部旺盛的小苗；清理掉根部的培养基，并在前几天把苗插入水中炼苗，然后便可以移栽到土壤里正常生长得到17个转基因系的转基因材料。

实施例3鉴定靶基因突变位置和突变形式

设计引物将CRISPR/Cas9编辑位点区域扩增出来，引物序列为：

NF-YB9-sF：(-204)GTAGTGAAGGAAGTGCAATAAA(-183)；

NF-YB9-sR：(+270)CCATGGCCCAGACGAGGT(+298)；

分别提取以上17个转基因系的转基因材料和野生型未转化材料Kitaake叶片DNA，利用上述引物进行PCR扩增，对PCR产物测序，对比野生型Kitaake材料和CRISPR/Cas9编辑的上述转基因材料的DNA序列，根据测序峰图判断突变位点和突变类型，如果测序峰图单一，与对照相比具有碱基的缺失、插入或者替换，则为相应的碱基缺失、插入和替换纯合突变体；如果测序峰图具有杂峰，则可能为杂合突变体，具体见图3。选取纯和突变体，且缺失和插入不是3个碱基倍数的突变，得到四个如下基因编辑突变体的转基因材料：nf-yb9-1(4bp缺失，对应于SEQ ID NO：1)、nf-yb9-2(28bp缺失，对应于SEQ ID NO：2)、nf-yb9-3(29bp缺失、对应于SEQ ID NO：3)、nf-yb9-4(1bp+3bp+7bp缺失，对应于SEQ ID NO：4)。

实施例4NF-YB9功能缺失影响水稻的种子大小

1、水稻组织总RNA提取

使用诺唯赞生物有限公司的RNA-easy Isolation Reagent试剂盒提取不同新鲜组织胚胎，根，茎，叶以及不同发育阶段的水稻种子(野生型品种kitaake(WT)和转基因材料nf-yb9-1、nf-yb9-2、nf-yb9-3、nf-yb9-4)的总RNA，具体步骤如下：

(1)将新鲜组织经过液氮速冻之后，迅速转移到液氮预冷的研钵中磨碎，期间不断加入液氮，直到研磨成粉末状。

(2)将研磨成粉的样品转移到离心管中，大约每50mg组织加1mL的4度的RNA-easyIsolation Reagent buffer，震荡或洗打使样品充分混匀裂解。

(3)向上步的样品混夜中加入2/5体积的RNase-free ddH₂O，剧烈震荡15秒后室温静置5分钟。

(4)使用12000g室温离心15分钟。

(5)取出离心管，此时溶液分成上层含有RNA的水相和下层含有蛋白质多糖等杂质的沉淀，吸取上层水相到新的离心管中。

(6)加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后温室静置10分钟。

(7)使用12000g离心10分钟，看见沉淀后小心弃去上清液。

(8)加入500μl用RNase-free ddH₂O配制的75％酒精，上下颠倒并充分洗涤管壁和管盖，轻弹管底让沉淀悬浮。再用8000g离心3分钟，弃去上清。并将第八步整个重复一次。

(9)加入预热的DEPC水60ul溶解样品。溶解后的RNA产物分装保存在-80度。

2、RNA逆转录成第一链cDNA

利用诺唯赞生物有限公司的HiScript Q-RT SuperMix for qPCR试剂盒对样品RNA进行逆转录的合成第一链cDNA。首先第一步基因组DNA去除，在RNase-free离心管中加入1pg-1μg的模板RNA，再加入4μl的4*gDNAwiper Mix和RNase-free ddH₂O补足配制成16μl的混合液，在42度加热2分钟用于gDNA去除。第二步配制逆转录反应体系，用第一步的16ul的反应液再加入4μl的5*qRTSuperMixII配成20μl混合液。第三步进行逆转录反应，在PCR仪里50度15分钟之后85度2分钟即可完成反应，cDNA产物稀释适宜浓度-20度保存。

3、实时定量PCR

使用诺唯赞生物有限公司的AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒去进行实时定量PCR实验，在qPCR管中配制以下混合液，2*AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10μl，前引物0.4μl，后引物0.4ul，cDNA2μl以及ddH₂O7.2μl的总体积20μl反应体系。在本实验室的Bio-Rad CFX Connect PCR仪上运行程序。不同样品设置生物学重复，且以相应的组织选定合适的内参基因。最后通过ΔΔCT法计算出相对表达量。qPCR引物如下：

NF-YB9-RT-F：CTACGTGCAGGTCCATCATC

NF-YB9-RT-R：GCGCTCCTCCGTAGTAGACA

通过定量PCR结果显示，NF-YB9主要在发育的颖果中表达，野生型kitaake(WT)在受精后第3天(Day after feritilized，DAF)的颖果中表达被激活，其表达水平在受精后第5天时达到高峰，但是在其他的器官中几乎检测不到NF-YB9的表达；相比野生型kitaake(WT)，突变体nf-yb9-1和nf-yb9-2在受精后的第3天、第5天、第7天、第9天的种子中NF-YB9基因表达水平显著下降(图5)。

实施例5转基因材料表型分析

对实施例2获得的4个转基因材料nf-yb9-1、nf-yb9-2、nf-yb9-3、nf-yb9-4，进行植株营养生长和生殖生长评估，分别对比野生型kitaake(WT)和nf-yb9-1、nf-yb9-2、nf-yb9-3、nf-yb9-4功能缺失材料的植株生长状态，包括株高、分蘖等性状，以及生殖生长过程中的水稻小穗发育，籽粒灌浆和籽粒形态等性状。结果显示：对比野生型，nf-yb9-1、nf-yb9-2、nf-yb9-3、nf-yb9-4功能缺失材料植株营养生长正常(图6)，但是其籽粒长度比对照提高，籽粒厚度和宽度比对照小，总淀粉含量下降，直链淀粉含量下降。转基因材料nf-yb9-1、nf-yb9-2、nf-yb9-3、nf-yb9-4基因突变体和对照粒长的统计，以及千粒重比较见图7，千粒重见图8所示，稻米品质分析见图9。本发明提供的基因和基因工程技术手段在不影响水稻其他农艺性状图的前提下，可显著提高水稻产量，具有很大的应用价值。

序列表

<110> 扬州大学

<120> NF-YB9突变型基因及其蛋白和应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 749

<212> DNA

<213> nf-yb9-1 (Artificial Sequence)

<400> 1

atggagcccg catcaacgga ggtgcggctg ctccaccacc gcccatggcg gcggagcagc 60

tgccgccggc ggcggcggtg gtccgggagc aggaccgcct gatgccgatc gcgaacgtga 120

tccgcatcat gcggcgcgtg ctcccgccgc acgccaagat ctccgacgac gccaaggagg 180

tgatccagga gtgcgtgtcg gagttcatca gcttcgtcac cggcgaggcc aacgaccggt 240

gccaccgcga gcaccgcaag acggtcaccg ccgaggacct cgtctgggcc atggaccgcc 300

tcggcttcga cgactacgtc ccgccgctca ccgcctacct ccgccgcatg cgcgagtacg 360

agggcggcgg atcaggtggt ggtggtggtg gtggccgtgg cgccgccgcc gcccccgccg 420

tcgtgccgcc gccgccgccg ccgcctcccg aggacgcgtt ccgctacgtg caggtccatc 480

atcccgtgta cgcggcgcca ggtgagccgg tgcaggggta cggttacccc gtggccatgt 540

cgtctgctct gccggcgccg cacgtgcacg tcggcgtccg cggcggcggg cagcacgagg 600

tgttcggtgg cgggccggcg cccctggctg tctactacgg aggagcgccg tacggcgagg 660

ccagcagccg cggcggctgc tctgccgccg acgaggggag ctcgtcgtcg agcgcctcgc 720

cggcgccggt cggccccaac tatgagtaa 749

<210> 2

<211> 725

<212> DNA

<213> nf-yb9-2(Artificial Sequence)

<400> 2

atggagcccg catttcaccc atggcggcgg agcagctgcc gccggcggcg gcggtggtcc 60

gggagcagga ccgcctgatg ccgatcgcga acgtgatccg catcatgcgg cgcgtgctcc 120

cgccgcacgc caagatctcc gacgacgcca aggaggtgat ccaggagtgc gtgtcggagt 180

tcatcagctt cgtcaccggc gaggccaacg accggtgcca ccgcgagcac cgcaagacgg 240

tcaccgccga ggacctcgtc tgggccatgg accgcctcgg cttcgacgac tacgtcccgc 300

cgctcaccgc ctacctccgc cgcatgcgcg agtacgaggg cggcggatca ggtggtggtg 360

gtggtggtgg ccgtggcgcc gccgccgccc ccgccgtcgt gccgccgccg ccgccgccgc 420

ctcccgagga cgcgttccgc tacgtgcagg tccatcatcc cgtgtacgcg gcgccaggtg 480

agccggtgca ggggtacggt taccccgtgg ccatgtcgtc tgctctgccg gcgccgcacg 540

tgcacgtcgg cgtccgcggc ggcgggcagc acgaggtgtt cggtggcggg ccggcgcccc 600

tggctgtcta ctacggagga gcgccgtacg gcgaggccag cagccgcggc ggctgctctg 660

ccgccgacga ggggagctcg tcgtcgagcg cctcgccggc gccggtcggc cccaactatg 720

agtaa 725

<210> 3

<211> 724

<212> DNA

<213> nf-yb9-3 (Artificial Sequence)

<400> 3

atggagcccg catttcccca tggcggcgga gcagctgccg ccggcggcgg cggtggtccg 60

ggagcaggac cgcctgatgc cgatcgcgaa cgtgatccgc atcatgcggc gcgtgctccc 120

gccgcacgcc aagatctccg acgacgccaa ggaggtgatc caggagtgcg tgtcggagtt 180

catcagcttc gtcaccggcg aggccaacga ccggtgccac cgcgagcacc gcaagacggt 240

caccgccgag gacctcgtct gggccatgga ccgcctcggc ttcgacgact acgtcccgcc 300

gctcaccgcc tacctccgcc gcatgcgcga gtacgagggc ggcggatcag gtggtggtgg 360

tggtggtggc cgtggcgccg ccgccgcccc cgccgtcgtg ccgccgccgc cgccgccgcc 420

tcccgaggac gcgttccgct acgtgcaggt ccatcatccc gtgtacgcgg cgccaggtga 480

gccggtgcag gggtacggtt accccgtggc catgtcgtct gctctgccgg cgccgcacgt 540

gcacgtcggc gtccgcggcg gcgggcagca cgaggtgttc ggtggcgggc cggcgcccct 600

ggctgtctac tacggaggag cgccgtacgg cgaggccagc agccgcggcg gctgctctgc 660

cgccgacgag gggagctcgt cgtcgagcgc ctcgccggcg ccggtcggcc ccaactatga 720

gtaa 724

<210> 4

<211> 741

<212> DNA

<213> nf-yb9-4 (Artificial Sequence)

<400> 4

atggagcccg catcaacgga ggtgcggctg ctccccatgg cggcggagca gctgccgccg 60

gcggcggcgg tggtccggga gcaggaccgc ctgatgccga tcgcgaacgt gatccgcatc 120

atgcggcgcg tgctcccgcc gcacgccaag atctccgacg acgccaagga ggtgatccag 180

gagtgcgtgt cggagttcat cagcttcgtc accggcgagg ccaacgaccg gtgccaccgc 240

gagcaccgca agacggtcac cgccgaggac ctcgtctggg ccatggaccg cctcggcttc 300

gacgactacg tcccgccgct caccgcctac ctccgccgca tgcgcgagta cgagggcggc 360

ggatcaggtg gtggtggtgg tggtggccgt ggcgccgccg ccgcccccgc cgtcgtgccg 420

ccgccgccgc cgccgcctcc cgaggacgcg ttccgctacg tgcaggtcca tcatcccgtg 480

tacgcggcgc caggtgagcc ggtgcagggg tacggttacc ccgtggccat gtcgtctgct 540

ctgccggcgc cgcacgtgca cgtcggcgtc cgcggcggcg ggcagcacga ggtgttcggt 600

ggcgggccgg cgcccctggc tgtctactac ggaggagcgc cgtacggcga ggccagcagc 660

cgcggcggct gctctgccgc cgacgagggg agctcgtcgt cgagcgcctc gccggcgccg 720

gtcggcccca actatgagta a 741

<210> 5

<211> 33

<212> PRT

<213> nf-yb9-1(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Glu Pro Ala Ser Thr Glu Val Arg Leu Leu His His Arg Pro Trp

1 5 10 15

Arg Arg Ser Ser Cys Arg Arg Arg Arg Arg Trp Ser Gly Ser Arg Thr

20 25 30

Ala

<210> 6

<211> 25

<212> PRT

<213> nf-yb9-2(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Glu Pro Ala Phe His Pro Trp Arg Arg Ser Ser Cys Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Trp Ser Gly Ser Arg Thr Ala

20 25

<210> 7

<211> 79

<212> PRT

<213> nf-yb9-3(Artificial Sequence)

<400> 7

His Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly His Gly Pro Pro Arg Leu Arg Arg

1 5 10 15

Leu Arg Pro Ala Ala His Arg Leu Pro Pro Pro His Ala Arg Val Arg

20 25 30

Gly Arg Arg Ile Arg Trp Trp Trp Trp Trp Trp Pro Trp Arg Arg Arg

35 40 45

Arg Pro Arg Arg Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Arg Gly Arg

50 55 60

Val Pro Leu Arg Ala Gly Pro Ser Ser Arg Val Arg Gly Ala Arg

65 70 75

<210> 8

<211> 246

<212> PRT

<213> nf-yb9-4(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Glu Pro Ala Ser Thr Glu Val Arg Leu Leu Pro Met Ala Ala Glu

1 5 10 15

Gln Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Val Arg Glu Gln Asp Arg Leu Met

20 25 30

Pro Ile Ala Asn Val Ile Arg Ile Met Arg Arg Val Leu Pro Pro His

35 40 45

Ala Lys Ile Ser Asp Asp Ala Lys Glu Val Ile Gln Glu Cys Val Ser

50 55 60

Glu Phe Ile Ser Phe Val Thr Gly Glu Ala Asn Asp Arg Cys His Arg

65 70 75 80

Glu His Arg Lys Thr Val Thr Ala Glu Asp Leu Val Trp Ala Met Asp

85 90 95

Arg Leu Gly Phe Asp Asp Tyr Val Pro Pro Leu Thr Ala Tyr Leu Arg

100 105 110

Arg Met Arg Glu Tyr Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Arg Gly Ala Ala Ala Ala Pro Ala Val Val Pro Pro Pro Pro Pro

130 135 140

Pro Pro Pro Glu Asp Ala Phe Arg Tyr Val Gln Val His His Pro Val

145 150 155 160

Tyr Ala Ala Pro Gly Glu Pro Val Gln Gly Tyr Gly Tyr Pro Val Ala

165 170 175

Met Ser Ser Ala Leu Pro Ala Pro His Val His Val Gly Val Arg Gly

180 185 190

Gly Gly Gln His Glu Val Phe Gly Gly Gly Pro Ala Pro Leu Ala Val

195 200 205

Tyr Tyr Gly Gly Ala Pro Tyr Gly Glu Ala Ser Ser Arg Gly Gly Cys

210 215 220

Ser Ala Ala Asp Glu Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser Pro Ala Pro

225 230 235 240

Val Gly Pro Asn Tyr Glu

245

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> NF-YB9-gRNA1(Artificial Sequence)

<400> 9

atggagcccg catttcccaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> NF-YB9-gRNA2(Artificial Sequence)

<400> 10

cgaacgtgat ccgcatcatg 20

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> NF-YB9-gRNA1-F(Artificial Sequence)

<400> 11

atggagcccg catttcccaa gttttagagc tagaaat 37

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> NF-YB9-OsU6aT1-R(Artificial Sequence)

<400> 12

ttgggaaatg cgggctccat cggcagccaa gccagca 37

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> NF-YB9-gRNA2-F(Artificial Sequence)

<400> 13

cgaacgtgat ccgcatcatg gttttagagc tagaaat 37

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> NF-YB9-OsU6aT2-R(Artificial Sequence)

<400> 14

cgaacgtgat ccgcatcatg gttttagagc tagaaat 37

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> NF-YB9-sF(Artificial Sequence)

<400> 15

gtagtgaagg aagtgcaata aa 22

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> NF-YB9-sR(Artificial Sequence)

<400> 16

ccatggccca gacgaggt 18

Claims

1.NF-YB9突变型基因，其特征在于，所述NF-YB9突变型基因在NF-YB9野生型基因的第14~17位核苷酸缺失；或第17~18位核苷酸缺失同时第20~45位核苷酸缺失；或第17~45位核苷酸缺失；或第14~17位核苷酸缺失以及第19位核苷酸缺失同时第43~49位核苷酸缺失，所述NF-YB9突变型基因其核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4所示。

2.权利要求1所述的NF-YB9突变型基因编码的突变型蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。

3.含有权利要求1所述的NF-YB9突变型基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体。

4.权利要求1所述的NF-YB9突变型基因、权利要求2所述的突变型蛋白，权利要求3所述的基因编辑载体在控制水稻粒型中的应用。

5.一种基因改良的转基因水稻的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）使水稻包含权利要求1所述的NF-YB9突变型基因；或

2）使水稻表达权利要求2所述的突变型蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，其包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。

7.鉴定权利要求6所述的基因改良的转基因水稻的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）鉴定所述水稻是否包含权利要求1所述的NF-YB9突变型基因；或，

2）鉴定所述水稻是否表达权利要求2所述的突变型蛋白；

所述鉴定方法通过设计引物将CRISPR/Cas9编辑位点区域扩增出来，所述引物序列为：NF-YB9-sF：GTAGTGAAGGAAGTGCAATAAA；

NF-YB9-sR：CCATGGCCCAGACGAGGT。