CN116103423A

CN116103423A - 抗除草剂转基因玉米事件nCX-1、核酸序列及其检测方法

Info

Publication number: CN116103423A
Application number: CN202210538032.1A
Authority: CN
Inventors: 沈志成; 于小星; 郑挺; 林朝阳; 王鹏飞; 许超
Original assignee: Hangzhou Ruifeng Bio Tech Co ltd
Current assignee: Hangzhou Ruifeng Bio Tech Co ltd
Priority date: 2022-05-17
Filing date: 2022-05-17
Publication date: 2023-05-12
Also published as: WO2023221554A1

Abstract

本发明公开了一种抗除草剂转基因玉米事件nCX‑1、核酸序列及其检测方法，所述转基因玉米事件nCX‑1是将外源DNA分子插入玉米基因组七号染色体获得的DNA分子；特异性检测转基因玉米事件nCX‑1的核酸序列包括SEQ ID NO.1或其互补序列、和/或SEQ IDNO.2或其互补序列。转基因玉米事件nCX‑1的转化植株对除草剂啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4‑D和草甘膦具有较好的耐受性。本发明提供的DNA检测方法能应用核酸扩增方法准确、稳定鉴定nCX‑1转基因事件的存在，对实现nCX‑1的研究、生产加工和应用进行溯源和全流程监管具有重要意义。

Description

抗除草剂转基因玉米事件nCX-1、核酸序列及其检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种抗除草剂转基因玉米事件及检测，具体的说，涉及一种耐除草剂转基因玉米事件nCX-1和用于检测生物样品中是否包含特定转基因玉米事件nCX-1的核酸序列及其检测方法。

(二)背景技术

玉米是世界上种植最广泛的粮食作物之一，具有粮食、饲料、能源等多种用途，不仅是主要的粮食作物，也是畜牧业和工业生产的主要原料。玉米的产量和品质对农业生产和全球经济发展起着重要的作用。但是在玉米种植过程中，杂草与玉米竞争营养和生长空间，影响玉米生长导致玉米产量降低，杂草防治是玉米生产中的重要环节。利用除草剂控制杂草可以减少杂草对玉米生长的影响，稳定和提高玉米产量。通过基因工程方法将耐除草剂基因导入到玉米中，获得耐除草剂转基因玉米可以提高玉米杂草防治效率，降低生产成本，为农业生产带来巨大的经济效益，从而实现积极的社会和生态效益。

农作物可以通过遗传改良技术获得耐除草剂性状。例如，通过农杆菌介导转化法将来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens sp strain CP4)CP4菌株的cp4 epsps基因导入农作物，表达5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的农作物获得了对除草剂草甘膦的耐受性。但长时间使用单一除草剂往往造成抗性杂草的大量产生。美洲推广耐草甘膦作物超过二十年，已经产出大量草甘膦抗性杂草，单独使用草甘膦难以实现田间杂草的有效防治。培育耐受两种或两种以上除草剂的转基因农作物可以为杂草控制提供多样化的选择，也能够有效延缓抗性杂草的产生。

细胞色素P450是一个庞大的基因家族。研究发现，部分P450基因可以降解除草剂。狗牙根中的一种P450基因N-Z1(美国专利：US9657303、加拿大专利：CA2818581C和巴西专利：BR112013012678B1)编码的蛋白质能够赋予农作物对多种除草剂的耐受性。本发明提供一种转基因玉米事件nCX-1，该事件同时表达了N-Z1和CP4 EPSPS两种蛋白，对啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4-D和草甘膦具有高耐受力、稳定遗传、而且对农艺性状没有不良影响。

转化事件(event)是由外源DNA序列在基因组插入位点的上下游侧翼区和外源基因构成的分子结构。在遗传转化时，由于外源DNA序列可以随机插入到植物基因组的任何一条染色体上的任何位点，因此获得的每个事件都是独特的。外源DNA在植物中的表达受到外源DNA所插入的染色体位置的影响。外源DNA在染色体上的位置不同，外源DNA的表达水平、表达空间和时间模式上会存在巨大差异，从而对植物的农艺性状的影响也各不相同。相同外源基因转化得到的不同转化事件间往往性状差异巨大，因此，通常需要筛选大量转化事件，才能够筛选出目标基因表达水平、表达模式和功能性状都能够满足生产应用需要的转化事件。筛选得到的理想转化事件可以采用有性杂交的常规育种方法将转基因渗入到其他遗传背景中，通过杂交方式产生的后代可以保持原始事件的转基因特征。

鉴定外源基因在基因组中的整合位点对转基因作物的杂交育种、生产应用、商业化注册和法律法规监管上具有重要的价值。提供转化事件外源基因整合位点信息，才能够通过现有的多核苷酸的检测方法来检测植物中转化事件的存在。常规的多核苷酸和蛋白检测的方法可以检测是否为转基因，但不能有效区别不同的转化事件，特别是使用相同基因或相同转化载体产生的转化事件。因此，只有针对插入基因和侧翼序列的检测才能够准确判断是否存在目标转基因事件。

(三)发明内容

本发明提供一种外源基因单拷贝插入、遗产稳定性良好、高抗啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4-D和草甘膦等优秀性状的转基因玉米事件nCX-1及用于检测所述转基因玉米事件nCX-1的核酸分子及其特异性检测方法，本发明能够准确快速地鉴定生物样品中是否包含转基因玉米事件nCX-1的DNA分子。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种抗除草剂转基因玉米事件nCX-1，所述转基因玉米事件nCX-1是将外源DNA分子(即T-DNA)插入玉米基因组7号染色体上SEQ ID NO.22的3’端和SEQID NO.23的5’端之间获得的DNA分子；所述玉米基因组核酸序列来源于数据库MaizeGenetics and Genomics Database(Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0)；所述外源DNA分子包括N-Z1基因表达盒和cp4 epsps基因表达盒；所述N-Z1基因表达盒包括：用作N-Z1基因启动的Actin启动子、N-Z1基因编码框、用作N-Z1基因终止的CaMV35S终止子；所述cp4 epsps基因表达盒包括：用作cp4 epsps基因启动的源自玉米polyubiquitin-1基因的ZmUbi启动子、cp4 epsps基因编码框、作为cp4 epsps基因终止的CaMV35S终止子。

SEQ ID NO.22

SEQ ID NO.23

优选的，所述转基因玉米事件nCX-1核酸序列如SEQ ID NO.7所示。

优选的，所述除草剂包括草甘膦、啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯或2,4-D中一种或者多种。

本发明所述转基因玉米事件nCX-1以玉米(Zea mays L.)nCX-1种子的形式保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO.P202213，保藏日期2022年4月20日，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072。

特别需要指出的是，本发明所述的转基因玉米事件nCX-1参考的基因组数据库来源于Maize Genetics and Genomics Database(Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0)。本领域的研究人员都知道，玉米基因组中存在大量活跃的转座子序列，不同遗传背景下的玉米基因组中可能存在序列位置的偏移。本领域的研究人员可以通过杂交等方式获得的本发明的后代，任意事件的基因组中外源T-DNA的旁侧序列为SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23的玉米事件都应视为本发明的内容。

第二方面，本发明提供一种用于检测所述转基因玉米事件nCX-1的核酸序列，所述核酸序列包括SEQ ID NO.1或其互补序列、和/或SEQ ID NO.2或其互补序列。

所述SEQ ID NO.1或其互补序列为转基因玉米事件nCX-1在插入序列的5’末端位于插入接合部位的一个长度为26个核苷酸序列，其中依次包括13个来自玉米基因的核苷酸和13个来自于插入的T-DNA的核苷酸，因此，所述SEQ ID NO.1或其互补序列跨越了转基因玉米事件nCX-1中外源DNA分子插入位点的侧翼基因组DNA序列和外源DNA分子的5’末端序列，包含所述SEQ ID NO.1或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件nCX-1的存在。

所述SEQ ID NO.2或其互补序列为转基因玉米事件nCX-1在插入序列的3’末端位于插入接合部位的一个长度为26个核苷酸序列，其中依次包括13个来自插入的T-DNA的核苷酸和13个来自玉米基因的核苷酸，因此，所述SEQ ID NO.2或其互补序列跨越了转基因玉米事件nCX-1中外源DNA分子插入位点的外源DNA分子的3’末端序列和侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ ID NO.2或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件nCX-1的存在。

进一步地，本发明提供的核酸序列还包括SEQ ID NO.3或其互补序列、和/或SEQID NO.4或其互补序列。

所述SEQ ID NO.3或其互补序列为转基因玉米事件nCX-1在插入序列的5’末端位于插入接合区的一个长度为362个核苷酸序列，其中SEQ ID NO.3的碱基1-225bp为插入结合部位附近的侧翼玉米基因组DNA序列，碱基226-362bp为插入结合部位附近的T-DNA的核苷酸的5’末端序列，包含所述SEQ ID NO.3或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件nCX-1的存在。

所述SEQ ID NO.4或其互补序列为转基因玉米事件nCX-1在插入序列的3’末端位于插入接合区的一个长度为494bp的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.4第1-48bp为插入结合部位附近的T-DNA的核苷酸的3’末端序列，49-494bp为插入结合部位附近的侧翼玉米基因组DNA序列，包含所述SEQ ID NO.4或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件nCX-1的存在。

进一步地，本发明提供的核酸序列还包括SEQ ID NO.5或其互补序列、和/或SEQID NO.6或其互补序列。

所述SEQ ID NO.5或其互补序列为转基因玉米事件nCX-1在插入序列的5’末端位于插入接合区的一个长度为957个核苷酸序列，其中SEQ ID NO.5的碱基1-729bp为插入结合部位附近的侧翼玉米基因组DNA序列，碱基730-957bp为插入结合部位附近的T-DNA的核苷酸的5’末端序列，包含所述SEQ ID NO.5或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件nCX-1的存在。

所述SEQ ID NO.6或其互补序列为转基因玉米事件nCX-1在插入序列的3’末端位于插入接合区的一个长度为946bp的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.6第1-265bp为插入结合部位附近的T-DNA的核苷酸的3’末端序列，266-946bp为插入结合部位附近的侧翼玉米基因组DNA序列，包含所述SEQ ID NO.6或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件nCX-1的存在。

更进一步地，本发明提供的核酸序列包括SEQ ID NO.7或其互补序列。

所述SEQ ID NO.7或其互补序列是转基因玉米事件nCX-1特有的长度为8695个核苷酸的序列，其包括了整个T-DNA序列及其5’和3’末端的侧翼玉米基因型序列。具体包含的基因组和遗传元件如表1所示。包含所述SEQ ID NO.7或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件nCX-1的存在。

表1.SEQ ID NO.7包含的基因组和遗传元件

本发明提供了转基因玉米事件nCX-1所特有的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列可用于表征转基因玉米事件nCX-1，从而可用于检测样品中是否存在转基因玉米事件nCX-1。具体而言，样品中SEQ ID NO.1-7中的一者或者多者所示的核酸分子中至少13个连续的核苷酸的存在表明该样品中存在转基因玉米事件nCX-1。

样品中SEQ ID NO.1或其互补序列和/或SEQ ID NO.2或其互补序列的存在表明该样品中存在转基因玉米事件nCX-1。

进一步地，样品中SEQ ID NO.3或其互补序列和/或SEQ ID NO.4或其互补序列的存在表明该样品中存在转基因玉米事件nCX-1。

进一步地，样品中SEQ ID NO.5或其互补序列和/或SEQ ID NO.6或其互补序列的存在表明该样品中存在转基因玉米事件nCX-1。

进一步地，样品中SEQ ID NO.7或其互补序列的存在表明该样品中存在转基因玉米事件nCX-1。

本领域技术人员容易理解的是，与上述方案类似，样品中SEQ ID NO.1或其互补序列和SEQ ID NO.4或其互补序列的存在也可以表明该样品中存在转基因玉米事件nCX-1，或者，样品中SEQ ID NO.1或其互补序列和SEQ ID NO.6或其互补序列的存在也可以表明该样品中存在转基因玉米事件nCX-1，或者，样品中SEQ ID NO.2或其互补序列和SEQ ID NO.3或其互补序列的存在也可以表明该样品中存在转基因玉米事件nCX-1；或者，样品中SEQ IDNO.2或其互补序列和SEQ ID NO.5或其互补序列的存在也可以表明该样品中存在转基因玉米事件nCX-1；或者，样品中SEQ ID NO.3或其互补序列和SEQ ID NO.6或其互补序列的存在也可以表明该样品中存在转基因玉米事件nCX-1；或者，样品中SEQ ID NO.4或其互补序列和SEQ ID NO.5或其互补序列的存在也可以表明该样品中存在转基因玉米事件nCX-1。

第三方面，本发明提供了一种检测样品中转基因玉米事件nCX-1的DNA分子存在的方法，包括：(1)将待检测样品与第一引物和第二引物在核酸扩增反应液中接触；所述第一引物为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.14中的一种；所述第二引物为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15中的一种；(2)进行核酸扩增反应；(3)检测扩增产物的存在；所述扩增产物包括SEQ ID NO.1或其互补序列、SEQ IDNO.2或其互补序列。

优选的，所述扩增产物包括SEQ ID NO.3或其互补序列中至少13个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO.4或其互补序列中至少13个连续的核苷酸。

更优选的，所述扩增产物包括SEQ ID NO.5或其互补序列中至少13个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO.6或其互补序列中至少13个连续的核苷酸。

进一步地，扩增产物包括SEQ ID NO.1或其互补序列、SEQ ID NO.2或其互补序列、SEQ ID NO.3或其互补序列、SEQ ID NO.4或其互补序列、SEQ ID NO.5或其互补序列、SEQID NO.6或其互补序列、和/或SEQ ID NO.7或其互补序列中至少13个连续的核苷酸，即可鉴定为转基因玉米事件nCX-1的存在。

在上述技术方案中，所述引物包括至少一种所述核苷酸序列。具体地，所述第一引物分别由SEQ ID NO.3(引物名称：RB-F1，对应编号：SEQ ID NO.8)、SEQ ID NO.4(引物名称：LB-F1，对应编号：SEQ ID NO.10)、SEQ ID NO.5(引物名称：RB-F2，对应编号：SEQ IDNO.12)和SEQ ID NO.6(引物名称：LB-F2，对应编号：SEQ ID NO.14)设计而成；所述第二引物分别由SEQ ID NO.3(引物名称：RB-R1，对应编号：SEQ ID NO.9)、SEQ ID NO.4(引物名称：LB-R1，对应编号：SEQ ID NO.11)、SEQ ID NO.5(引物名称：RB-R2，对应编号：SEQ IDNO.13)和SEQ ID NO.6(引物名称：LB-R2，对应编号：SEQ ID NO.15)设计而成。

第四方面，本发明还提供了一种培育耐除草剂的含所述转基因玉米事件nCX-1的玉米植物的方法，所述方法包括：种植含有特定区域核酸序列的玉米种子，使所述玉米长成玉米植株，用除草剂喷洒所述玉米植株，收获与其他不含有所述特定区域核酸序列的玉米植株相比，耐除草剂能力显著提高了的植株；所述特定区域核酸序列来自转基因玉米事件nCX-1，所述特定区域的核酸序列包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或者SEQ ID NO.7所示核苷酸序列中的一种或其互补序列；所述除草剂为草甘膦、啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯或2,4-滴异辛酯(2,4-D)中一种或者多种。

第五方面，本发明还提供了一种获得耐除草剂的含所述转基因玉米事件nCX-1的玉米植株的方法，所述方法包括将含有特定区域核酸序列的玉米植株，与另一种玉米植株杂交，从而产生子代植株；收获与其他不含有所述特定区域核酸序列的植株相比，对除草剂的耐受性显著提高；所述特定区域核酸序列来自转基因玉米事件nCX-1，所述特定区域的核酸序列包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.7所示核苷酸序列中的一种或其互补序列；所述除草剂为草甘膦、啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4-D中一种或者多种。

第六方面，本发明提供一种控制含所述转基因玉米事件nCX-1的转基因玉米田间杂草的方法，所述方法包括将除草剂喷施到种植转基因玉米的大田中，玉米田间杂草被杀灭；所述转基因玉米基因组中包含来自转基因玉米事件nCX-1的特定区域核酸序列，所述特定区域核酸序列包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6或者SEQ ID NO.7所示核苷酸序列中的一种或其互补序列；所述除草剂为草甘膦、啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4-D中一种或者多种。

第七方面，本发明还提供一种产生自转基因玉米事件nCX-1的农产品或商品，所述农产品或商品包括玉米粉、玉米面、玉米油、玉米淀粉、玉米面筋、玉米饼、含玉米成分的化妆品、或者含玉米成分的辅料。

本发明转基因玉米事件nCX-1包含了一个DNA构建体，当其在植物细胞内表达时，所述转基因玉米事件nCX-1获得对啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4-D和草甘膦除草剂的耐受性。所述T-DNA构建体包含两个串联的表达盒，第一个表达盒包含用于在植物中表达N-Z1蛋白的合适启动子和合适的终止子，所述启动子可操作地连接N-Z1蛋白的核苷酸序列，所述N-Z1蛋白对啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4-D除草剂具有耐受性，所述启动子包括肌动蛋白(Actin)启动子，所述终止子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子。第二个表达盒包含用于在植物中表达EPSPS蛋白的合适的启动子和合适的终止子，所述启动子可操作地连接编码5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因，所述EPSPS蛋白对草甘膦除草剂具有耐受性，所述启动子包括玉米polyubiquitin-1基因启动子(ZmUbi)，所述终止子包括CaMV 35S终止子。

所述DNA构建体采用转化方法引入植物中，包括农杆菌介导转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。

本发明核苷酸序列的说明：

SEQ ID NO.1表示转基因玉米事件nCX-1中侧翼玉米基因组和5’端转基因插入位点每侧各13个核苷酸；

SEQ ID NO.2表示转基因玉米事件nCX-1中3’端转基因插入位点和侧翼玉米基因组每侧各13个核苷酸；

SEQ ID NO.3表示转基因玉米事件nCX-1中5’端转基因插入位点接合区附近362个核苷酸序列；

SEQ ID NO.4表示转基因玉米事件nCX-1中3’端转基因插入位点接合区附近494个核苷酸序列；

SEQ ID NO.5表示转基因玉米事件nCX-1中5’端转基因插入位点接合区附近957个核苷酸序列；

SEQ ID NO.6表示转基因玉米事件nCX-1中3’端转基因插入位点接合区附近946个核苷酸序列；

SEQ ID NO.7表示转基因玉米事件nCX-1插入T-DNA序列及其5’端和3’端的玉米基因组序列；

SEQ ID NO.8表示检测SEQ ID NO.3的第一引物(RB-F1)；

SEQ ID NO.9表示检测SEQ ID NO.3的第二引物(RB-R1)；

SEQ ID NO.10表示检测SEQ ID NO.4的第一引物(LB-F1)；

SEQ ID NO.11表示检测SEQ ID NO.4的第二引物(LB-R1)；

SEQ ID NO.12表示检测SEQ ID NO.5的第一引物(RB-F2)；

SEQ ID NO.13表示检测SEQ ID NO.5的第二引物(RB-R2)；

SEQ ID NO.14表示检测SEQ ID NO.6的第一引物(LB-F2)；

SEQ ID NO.15表示检测SEQ ID NO.6的第二引物(LB-R2)。

本发明转基因玉米事件nCX-1表达了N-Z1和CP4 EPSPS两个蛋白，对啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4-D和草甘膦除草剂具有高耐受性，在杂交育种过程中可以应用草甘膦、啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4-D中一种或者多种除草剂进行转基因筛选，在转基因玉米种植过程中可以应用草甘膦、啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4-D中一种或者多种除草剂进行杂草防治。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

(1)本发明提供了一种耐除草剂的转基因玉米事件nCX-1，该事件将目的基因N-Z1和cp4epsps单拷贝插入玉米基因组的特定位点，使得含所述转基因玉米事件nCX-1的不同世代及含有该转基因玉米事件nCX-1的玉米材料中整合稳定、表达稳定、对除草剂抗性稳定。所述转基因玉米事件nCX-1以玉米种子的形式保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO.P202213，对啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4-D和草甘膦具有耐受性。

(2)本发明提供的特异性检测转基因玉米事件nCX-1的核苷酸序列，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7，能够特异性检测转基因玉米事件nCX-1。

(3)本发明用于检测转基因玉米事件nCX-1的检测方法中，针对nCX-1特有序列SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.7设计特异性检测引物对，应用核酸扩增方法准确、稳定鉴定出nCX-1转基因事件的存在，能够实现对nCX-1的研究、生产加工和应用进行溯源和全流程监管。

(4)本发明所述转基因玉米事件nCX-1，在杂交育种过程中可以应用草甘膦、啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4-D中一种或者多种除草剂进行转基因筛选，在玉米种植过程中可以应用草甘膦、啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4-D中一种或者多种除草剂进行杂草防治，有效提高杂草防治效率，降低除草剂抗性杂草产生的风险，降低杂草防治成本。

(5)本发明方法获得的含所述转基因玉米事件nCX-1的农产品或商品。

(四)附图说明：

图1为转化载体图谱。

图2为hiTAIL-PCR扩增产物的电泳图。

图3为外源插入基因与玉米基因组结构示意图。

图4为玉米基因组特异性检测电泳图。M：Marker；1：空白对照(不添加基因组)；2：nCX-1；3：常规玉米郑单958；4：转基因玉米混合样(瑞丰125，浙大瑞丰8)；5：常规大豆天隆1号；6：转基因大豆混合样(中黄6106，SHZD3201)；7：常规水稻秀水134；8：转基因抗虫棉(GHB614，COT102)。

图5为nCX-1 5’端特异性检测电泳图。M：Marker；1：nCX-1；2：常规玉米郑单958；3：转基因玉米混合样(瑞丰125，浙大瑞丰8)；4：常规大豆天隆1号；5：转基因大豆混合样(中黄6106，SHZD3201)；6：常规水稻秀水134；7：转基因抗虫棉(GHB614，COT102)。

图6为nCX-1 3’端特异性检测电泳图。1：常规玉米郑单958；2：常规大豆天隆1号；3：常规水稻秀水134；4：nCX-1；M：Marker；5：转基因玉米混合样(瑞丰125，浙大瑞丰8)；6：转基因大豆混合样(中黄6106，SHZD3201)；7：转基因抗虫棉(GHB614，COT102)。

图7为nCX-1和对照对草甘膦耐受性图片。

图8为nCX-1和对照对啶嘧磺隆耐受性图片。

图9为nCX-1和对照对草甘膦+二甲四氯耐受性图片。

图10为nCX-1和对照对草甘膦+2,4-滴异辛酯(2,4-D)耐受性图片。

图11为nCX-1和对照对草甘膦+烟嘧磺隆耐受性图片。

(五)具体实施方式

以下将参照附图更完整地描述本发明，其中显示了本发明部分但非全部的实施方案。实际上，可以以许多不同的形式实施本发明，而不应当理解为限制至本文所列出的实施方案。下述定义和方法将更好地定义本发明并且知道本领域的普通技术人员实施本发明。本发明所属领域的技术人员可根据本文的描述和附图中的相关信息的指导提出的本发明的许多修改和其它实施方案。因此，应当理解，本发明不限于所公开的特定实施方案，基于本发明的教导所提出的修改方案和其它实施方案也包括在所附权利要求的范围之内。

除非另做说明，本发明使用的术语应该根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。

本发明所述“玉米”是指玉蜀黍(Zea mays L.)，包括与玉米交配的所有植物品种，包括野生玉米种。

所述“包括”与“包含”、“含有”同义，并且指“包括但不限于”。所述植物包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。所述转基因植物源自本发明DNA分子转化的并因此至少部分由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。

所述转基因“事件”是通过用外源DNA(例如，包括至少一个含有目标基因的核酸表达盒)构建体转化植物细胞而得到的，通过转基因的方法插入到植物基因组中以产生植物群体，再生所述植物群体，和选择具有插入特定基因组位点特征的特定植株。术语“事件”指包括外源DNA的原始事件和/或该事件的后代。术语“事件”也指事件和含有外源DNA的其它品种个体之间进行有性杂交而得到的后代，即使在重复与回交亲本回交后，来自于事件亲本的插入DNA和侧翼基因组DNA也存在于杂交后代中的同一染色体位置。术语“事件”也指来自原始事件的DNA序列，该DNA序列包含插入DNA和与插入DNA紧密相邻的侧翼基因组序列，该DNA序列被预期转移到子代中，该子代由含有插入DNA的亲本品系(例如原始事件和其自交产生的子代)与不含有插入DNA的亲本品系进行有性杂交而产生，且该子代接受了包含目标基因的插入DNA。

所述“转基因”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，以上的基因型由于外源核酸的存在而改变，所述“转基因”包括最初被这样改变的转基因体以及由最初的转基因体通过有性杂交或无性繁殖生成的子代个体。在本发明中，术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或天然发生事件的基因组的(染色体的或染色体外的)改变，所述天然发生事件例如随机异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变。

所述“转基因玉米事件nCX-1”即为外源DNA分子插入玉米基因组的chr7:176570691-176570736bp之间获得的DNA分子，还包括含转基因玉米事件nCX-1的植物nCX-1、种子及植物细胞或其可再生部分，所述植物部分包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、穗丝、花絮、耳穗、叶和来自玉米植物nCX-1的产物，如玉米粉、玉米面、玉米浆、玉米穗丝、玉米淀粉和留在玉米作物田间的生物量。

所述“引物”是一段分离的核酸分子，其通过核酸杂交，退火结合到互补的目标DNA链上，在引物和目标DNA链之间形成杂合体，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下，沿着目标DNA链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸序列扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。

以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1：含有外源基因的质粒载体的获得

本发明用于玉米转化的载体图谱如图1所示，转化质粒载体以pCambia1300(GenBank:AF234296.1)为植物转化载体框架，在其多克隆位点区域加入包含完整表达CP4EPSPS蛋白表达框和表达N-Z1蛋白表达框的T-DNA，具体由如下部分组成，表达CP4 EPSPS蛋白表达框：CP4EPSPS，驱动CP4 EPSPS的启动子为来源于玉米polyubiquitin-1基因启动子(pZmUbi-1)，终止子是CaMV的35S基因终止子；表达N-Z1蛋白表达框：N-Z1，驱动N-Z1的启动子为Actin启动子，终止子为CaMV的35S基因终止子，T-DNA序列为SEQ ID NO.7中730-8014位核苷酸。

利用电击法(2500V)将获得的转化质粒导入农杆菌LBA4404中，获得含有转化载体的农杆菌。

实施例2：含转基因玉米事件nCX-1的植物nCX-1获得

采用农杆菌介导进行玉米遗传转化，具体是根据Frame等(Plant Physiol,2002,129:13-22)报道的方法和培养基配方进行转化，使用草甘膦为筛选试剂，步骤如下：取授粉后8～10天的玉米穗，收集大小为1.0-1.5mm未成熟胚。将含有转化载体的农杆菌混匀在侵染培养基中，调整菌液浓度OD660为0.5-0.6。将收集的未成熟胚放入含有农杆菌的侵染液中，室温静置5min，将胚倒在共培养基中，吸干液体，将胚平面朝下放置在共培养基上，22℃培养3-5天。将培养后的未成熟胚转移到含有终浓度200mg/L特美汀抗生素(葛兰素史克，美国)的愈伤组织诱导培养基上，28℃暗培养10-14天杀灭农杆菌。诱导培养后的所有愈伤组织转到含有终浓度2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。诱导培养后将所有的愈伤组织转到新鲜的含有2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。将成活的胚性组织转到再生培养基上，28℃暗培养10-14天后转移到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。挑取发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全，将生根后的再生苗移植到温室中生长繁种，一共产生850个独立转基因单株，作为T₀代事件，用于筛选分析。

实施例3：含转基因玉米事件nCX-1的植物nCX-1的筛选

实施例2获得的850个T₀代事件经炼苗后移栽至温室内，在温室中移栽成活801棵幼苗。待T₀代转基因玉米长至4-5叶期时，喷施草甘膦和啶嘧磺隆复合除草剂(草甘膦有效剂量为60g/亩；啶嘧磺隆有效剂量为0.8g/亩)，没有药害的事件为110个，有药害的事件为640个，死亡的事件为100个(表2)。

表2T₀代事件对对草甘膦和啶嘧磺隆复合除草剂的耐受性

对没有药害的事件进行定量PCR检测，测定外源基因在110个存活的事件中的含量，从而评估T-DNA的插入拷贝数，放弃带有两个或者两个以上拷贝的事件。取上述事件的植株，用CTAB法提取植物基因组。通过SYBR Green荧光定量PCR方法检测cp4 epsps基因的拷贝数以确定外源基因的拷贝数。选取玉米基因组中的zSSIIb作为内参基因，随机选取一个玉米事件作为基准，计算目的基因在反应初始的相对含量。

本实施例使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(BIO RAD)，在Bio-Rad RadCFX96^TMReal-Time PCR仪中进行反应，利用Ct值比较法分析结果。体系及程序参照SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒的说明书，引物序列如下：

表3定量PCR引物

序列号	引物名称	引物序列5’-3’
			SEQ ID NO:18	qSSIIb-3F	CGGTGGATGCTAAGGCTGATG
SEQ ID NO:19	qSSIIb-4R	AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC
			SEQ ID NO:20	cp4 epsps-F	GAGCAGACCGCCATTCCCA
SEQ ID NO:21	cp4 epsps-R	GAAGGCCATGCAGGCTATGG

通过分析cp4 epsps基因拷贝数的实验结果，进而证实外源基因己整合到所检测的玉米植株的染色体组中，其中有36个单拷贝的转基因玉米植株。

对36个选定单拷贝事件的后代喷施草甘膦和啶嘧磺隆复合除草剂(草甘膦有效剂量为120g/亩；啶嘧磺隆有效剂量为1g/亩)，结果显示，对更高浓度复合除草剂具有耐受性的事件有7个(表4)。

表4T₁代事件对对草甘膦和啶嘧磺隆复合除草剂的耐受性

对除草剂耐受性良好的7个事件(记为nCX-1～nCX-7)进行表达量测定。

本研究使用的CP4 EPSPS酶联免疫定量检测试剂盒购自上海佑隆生物科技有限公司，N-Z1试剂盒购自钟鼎生物的蛋白质特制ELISA检测试剂盒。

CP4 EPSPS试剂盒操作步骤：

(1)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温(20-25℃)平衡30min以上，使所有试剂和所需板条温度回升至室温，每种液体试剂使用前均摇匀。

(2)取40-50mg玉米组织，放入2mL离心管中，加入钢珠，液氮冷冻，研磨仪打碎。加入600μL样品提取液，振荡混匀5min，室温静置5min，12000rpm，离心10min。根据需要用样品提取液稀释样品后用于测定，将OD₄₅₀值控制在可测量范围内。

(3)将标准品浓度稀释为48ppb，24ppb，12ppb，6ppb和3ppb。将20×浓缩洗涤液用去离子水稀释成1×洗涤工作液。用酶稀释液将11×浓缩酶标液按1:10体积比进行稀释。

(4)向酶联板的每个微孔中加入样品提取液(空白对照)/标准品/样品100μL，轻轻振荡混匀，用Parafilm膜把酶联板封住，室温下在水平摇床上避光环境震荡45min。

(5)反应完成后，将板内的液体倒出，每孔加入250μL的洗涤工作液充分洗涤4-5次，将板在吸水纸上拍干。

(6)每孔加入100μL酶标工作液，轻轻震荡混匀，用Parafilm膜把酶联板封住，室温下在水平摇床上避光环境震荡30min。重复步骤5。

(7)每孔加入100μL显色剂，轻轻震荡混匀，用Parafilm膜把酶联板封住，室温下在水平摇床上避光环境震荡15min。

(8)每孔加入100μL终止液，轻轻震荡混匀，5min内在酶标仪中测定OD₄₅₀。

(9)根据标准样品的OD₄₅₀值可以绘制出一条标准曲线图，为了排除每次测定之间的系统误差，每次测定样品都同时制作标准曲线。其中一次测定的标准曲线公式是：y＝0.0334x+0.0089(R²＝0.9976)。

(10)将样本的OD₄₅₀值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，即可算出CP4 EPSPS蛋白含量(μg/g)＝样本浓度(ppb)*稀释倍数*样品提取液体积(μL)/叶片重量(mg)/1000。

N-Z1试剂盒操作步骤：

(1)将试剂盒提前从冷藏环境中取出，置于室温(20-25℃)平衡20min以上，使所有试剂和所需板条温度回升至室温，每种液体试剂使用前均摇匀。

(2)取30mg左右玉米组织(种子先敲碎)，放入2mL离心管中，加入钢珠，液氮冷冻，研磨仪打碎。加入1000μL PBS缓冲液，4℃震荡孵育1h后12000rpm，离心10min，取上清，将上清稀释一定倍数后再进行检测，将OD₄₅₀值控制在可测量范围内。

(3)取1mL双蒸水加入标准蛋白中，旋紧管盖，上下颠倒数次，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度200ng/ml)。然后用PBS缓冲液进行倍比稀释(注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释，在EP管中进行)。建议配制成以下浓度200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0ng/mL，PBS缓冲液直接作为空白孔0ng/mL。

(4)洗涤液的配制：将试剂盒中的浓缩洗涤液用双蒸水按1:19体积比稀释。

(5)生物素化抗体：取20μL双蒸水加入生物素化抗体中，待其充分溶解后，取1μL生物素化抗体用10mL样品稀释液稀释，即1:10000稀释。

(6)Streptavidin-HRP：取1μL Streptavidin-HRP用10mL样品稀释液稀释，即1:10000稀释。

(7)向酶联板的每个微孔中加入PBS缓冲液(空白对照)/标准品/样品100μL，用Parafilm膜把酶联板封住，37℃孵育60min。

(8)反应完成后，将板内的液体倒出，甩干，每孔加入300μL的洗涤工作液充分洗涤3次，将孔内的液体在吸水纸上拍干。

(9)每孔加入100μL稀释好的生物素化抗体，用Parafilm膜把酶联板封住，37℃孵育60min。

(10)反应完成后，将板内的液体倒出，甩干，每孔加入300μL的洗涤工作液充分洗涤3次，将孔内的液体在吸水纸上拍干。

(11)每孔加入100μL稀释好的Streptavidin-HRP，用Parafilm膜把酶联板封住，37℃孵育60min。

(12)反应完成后，将板内的液体倒出，甩干，每孔加入300μL的洗涤工作液充分洗涤4次，将孔内的液体在吸水纸上拍干。

(13)每孔加入100μL底物溶液(TMB)，用Parafilm膜把酶联板封住，37℃孵育15min左右(根据实际显色情况酌情缩短，但不可超过15min。当标准孔出现明显梯度时，即可终止)。

(14)每孔加入100μL终止液，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。.

(15)根据标准样品的OD₄₅₀值可以绘制出一条标准曲线图，为了排除每次测定之间的系统误差，每次测定样品都同时制作标准曲线。其中一次测定的标准曲线公式是：y＝0.5173x+0.6229(R²＝0.9975)。

(16)将样本的OD₄₅₀值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，即可算出N-Z1蛋白含量(μg/g)＝样本浓度(ppb)*稀释倍数*样品提取液体积(μL)/叶片重量(mg)/1000。

表5不同事件的外源蛋白表达量

事件	CP4 EPSPSμg/g FW	N-Z1μg/g FW
			nCX-1	73.21	0.35
nCX-2	24.98	0.31
			nCX-3	212.81	0.08
nCX-4	35.40	0.23
			nCX-5	119.48	0.09
nCX-6	330.04	0.02
			nCX-7	56.36	0.14

选取CP4 EPSPS和N-Z1蛋白表达量适中的事件，并结合田间农艺性状表现，通过筛选，最终选定出更为优异的事件nCX-1，该事件具有外源基因单拷贝插入位点、啶嘧磺隆和草甘膦耐受性强、外源基因及性状稳定遗传和农艺性状表现突出的特点。

实施例4：玉米转基因事件nCX-1检测

1、玉米基因组的提取

采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取实施例3筛选的事件nCX-1基因组DNA。

取1000mg克幼嫩的事件nCX-1的叶片在液氮中研磨成粉后，加入0.8mL于65℃水浴锅中预热的CTAB缓冲液(20g/L CTAB，1.4M NaCl，100mM Tris-HCl，20mM EDTA，pH 8.0)，充分混匀后，于65℃水浴锅中水浴60min；

加入等体积的三氯甲烷，颠倒混匀，12000rpm(每分钟转数)转速下离心10min，吸取上清液至新的离心管中；

加入0.7倍体积的异丙醇，轻柔晃动离心管，12000rpm转速下离心1min，收集DNA到管底；弃上清液，

加入1mL质量浓度为75％的乙醇，洗涤沉淀，12000rpm转速下离心1min，重复洗涤一次，在超净台吹干；

DNA沉淀溶解于适量的TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)中，Nanodrop测定DNA的浓度，保存备用。

2、侧翼DNA序列的分析

使用Liu等报道的hiTAIL-PCR(High-efficiency thermal asymmetricinterlaced PCR)方法(Liu,Yao Guang,and Yuanling Chen.2007.High-efficiencythermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flankingsequences.Biotechniques,43:649-650.)对实施例3筛选的优良事件nCX-1外源转基因DNA插入点两侧的区域序列进行测定。该方法通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR扩增，利用不同退火温度选择性地扩增目标片段。引物序列见表6，PCR反应体系见表7，PCR反应条件见表8。

表6hiTAIL-PCR引物序列

表7hiTAIL-PCR反应体系

表8hiTAIL-PCR反应条件

采用Axygen公司的PCR产物回收试剂盒回收第3轮PCR扩增产物(图2)，连接到PMD19-T克隆载体上(TaKaRa,Code:D102A)，转化大肠杆菌，将得到的阳性克隆经杭州有康生物科技有限公司进行测序。获得的序列信息与玉米网上数据库(http://www.maizegdb.org)进行比对分析，检索相似的玉米基因组序列。

3、T-DNA右侧翼区

对通过hiTAIL-PCR方法获得的鉴定为包含5’侧翼区的片段进行测序，测序结果为SEQ ID NO.5，第1-729bp的序列对应于玉米基因组DNA，第730-957bp的序列对应于外源DNA。

4、T-DNA左侧翼区

鉴定为包含3’侧翼区的片段进行测序，测序结果为SEQ ID NO.6，第1-265bp为插入基因核苷酸序列，第266-946bp为玉米侧翼基因组核苷酸序列。

4、nCX-1整合入基因组序列信息

上述经测序比对和验证过的插入位点上下游旁侧序列和抗除草剂基因表达框序列(含完整表达CP4 EPSPS蛋白表达框和表达N-Z1蛋白表达框的T-DNA)拼接形成本发明所述的转基因玉米事件nCX-1，核苷酸序列为SEQ ID NO.7，基因结构图如图3所示。对应转基因玉米事件nCX-1以玉米(Zea mays L.)nCX-1种子的形式保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO.P202213。

SEQ ID NO.7

实施例5：转基因玉米事件nCX-1特异性检测

转基因玉米事件nCX-1的5’及3’侧翼序列分别如SEQ ID NO.7的第1-729位核苷酸及第8015-8695位核苷酸所示，针对转基因玉米事件nCX-1的5’端及3’端插入位点序列分别设计引物，进行PCR反应，引物信息见表9，反应体系下表10所示。

表9引物信息

表10PCR反应体系

PCR反应程序为：94℃变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，最后72℃延伸7min。

选取转基因玉米事件nCX-1种子、常规玉米(郑单958)、转基因玉米混合样(分别取等量的瑞丰125和浙大瑞丰8各自提取DNA后混合)、常规大豆(天隆1号)、转基因大豆混合样(分别取等量的中黄6106和SHZD3201各自提取DNA后混合)、常规水稻(秀水134)、转基因抗虫棉(分别取等量GHB614和COT102各自提取DNA后混合)进行核酸特异性检测。首先采用内参照引物zSSIIb-1F(SEQ ID NO.16)和zSSIIb-1R(SEQ ID NO.17)测试上述基因组的质量，以不添加基因组为空白对照。

扩增产物琼脂糖电泳结果显示，含玉米基因组的样品(常规玉米、nCX-1、瑞丰125和浙大瑞丰8混合样)能够检测到大约150bp左右的条带(图4)，与预期条带大小一致，不含玉米基因组的样品检测不到条带，说明用来测试的玉米基因组质量符合要求。

同样方法，应用引物对RB-F1(SEQ ID NO.8)和RB-R1(SEQ ID NO.9)分别对nCX-1、常规玉米(郑单958)、转基因玉米混合样(瑞丰125，浙大瑞丰8)、常规大豆(天隆1号)、转基因大豆混合样(中黄6106，SHZD3201)、常规水稻秀水134和转基因抗虫棉(GHB614和COT102)进行核酸特异性检测，扩增产物电泳结果显示，仅有nCX-1样品能够检测到约360bp大小的条带，条带大小与预期一致，不含nCX-1基因组的其他样品检测不到特异性条带，本发明提供的引物对能够特异性检测出nCX-1的存在(图5)。

同样方法，应用引物对LB-F1(SEQ ID NO.10)和LB-R1(SEQ ID NO.11)分别对nCX-1、常规玉米(郑单958)、转基因玉米混合样(瑞丰125，浙大瑞丰8)、常规大豆天隆1号、转基因大豆混合样(中黄6106，SHZD3201)、常规水稻(秀水134)和转基因抗虫棉(GHB614和COT102)进行PCR扩增，扩增产物电泳结果显示，仅有nCX-1样品能够检测到约500bp大小的条带，条带大小与预期一致(图6)，不含nCX-1基因组的其他样品没有条带检出，本发明提供的引物对能够特异性检测出nCX-1的存在。因此，本发明提供的测试引物对能够特异性检测到含有nCX-1样品的存在。

实施例6：nCX-1啶嘧磺隆耐受性测试

将实施例4转基因玉米事件nCX-1的种子和普通玉米郑单958(作为对照)，采用随机区组设计，3次重复，共24个小区，每个小区面积4m×6m，双粒播种，株距25cm，行距50cm，小区间设1m间隔，在3-5叶期喷施啶嘧磺隆，处理如下：1)不喷施；2)喷施有效剂量1克/亩的啶嘧磺隆；3)喷施有效剂量2克/亩的啶嘧磺隆；4)喷施有效剂量4克/亩的啶嘧磺隆。在用药后1周、2周、4周调查成苗率，植株高度(选取最高的5株)、药害症状(选取药害症状最轻的5株)，药害症状分级按GB/T 17980.42-2000执行。

除草剂受害率计算公式：

式中，X：受害率，单位为百分率(％)；N：某级受害株数；S：级别值；Z：总株数；M最高级别。

用方差分析方法比较不同处理的转基因抗除草剂玉米、非转基因玉米在出苗率、成苗率和受害率方面的差异。判别转基因抗除草剂玉米对除草剂的耐受水平。

啶嘧磺隆田间测试结果，转基因玉米nCX-1对啶嘧磺隆具有高度耐受性(表11和图7)。

表11nCX-1对啶嘧磺隆耐受性调查表

实施例7：nCX-1草甘膦耐受性测试

将实施例4转基因玉米事件nCX-1的种子和普通玉米郑单958(作为对照)，采用随机区组设计，3次重复，共24个小区，每个小区面积4m×6m，双粒播种，株距25cm，行距50cm，小区间设1m间隔，在3-5叶期喷施草甘膦，处理如下：1)不喷施；2)喷施中剂量草甘膦，有效剂量为60克/亩；3)2倍中剂量草甘膦，有效剂量为120克/亩；4)4倍中剂量草甘膦，有效剂量为240克/亩。在用药后1周、2周、4周调查成苗率，植株高度(选取最高的5株)、药害症状(选取药害症状最轻的5株)，药害症状分级按GB/T 17980.42-2000执行。

除草剂受害率计算公式：

草甘膦田间测试结果，转基因玉米nCX-1对草甘膦具有高度耐受性(表12和图8)。

表12nCX-1对草甘膦耐受性调查表

实施例8：nCX-1草甘膦和二甲四氯复合除草剂耐受性测试

将实施例4转基因玉米事件nCX-1的种子和普通玉米郑单958(作为对照)，采用随机区组设计，3次重复，共24个小区，每个小区面积4m×6m，双粒播种，株距25cm，行距50cm，小区间设1m间隔，在3-5叶期喷施草甘膦和二甲四氯复合除草剂，处理如下：1)不喷施；2)喷施有效剂量60克/亩草甘膦+有效剂量50克/亩二甲四氯；3)喷施有效剂量120克/亩草甘膦+有效剂量100克/亩二甲四氯；4)喷施有效剂量240克/亩草甘膦+有效剂量200克/亩二甲四氯。在用药后1周、2周、4周调查成苗率，植株高度(选取最高的5株)、药害症状(选取药害症状最轻的5株)，药害症状分级按GB/T 17980.42-2000执行。

除草剂受害率计算公式：

草甘膦和二甲四氯复合除草剂田间测试结果，转基因玉米nCX-1对草甘膦和二甲四氯复合除草剂具有高度耐受性(表13和图9)。

表13nCX-1对草甘膦和二甲四氯复合除草剂耐受性调查表

实施例9：nCX-1草甘膦和2,4-滴异辛酯(2,4-D)复合除草剂耐受性测试

将实施例4转基因玉米事件nCX-1的种子和普通玉米郑单958(作为对照)，采用随机区组设计，3次重复，共24个小区，每个小区面积4m×6m，双粒播种，株距25cm，行距50cm，小区间设1m间隔，在3-5叶期喷施草甘膦和2,4-D复合除草剂，处理如下：1)不喷施；2)喷施有效剂量60克/亩草甘膦+有效剂量12克/亩2,4-D；3)喷施有效剂量120克/亩草甘膦+有效剂量24克/亩2,4-D；4)喷施有效剂量240克/亩草甘膦+有效剂量48克/亩2,4-D。在用药后1周、2周、4周调查成苗率，植株高度(选取最高的5株)、药害症状(选取药害症状最轻的5株)，药害症状分级按GB/T 17980.42-2000执行。

除草剂受害率计算公式：

用方差分析方法比较不同处理的转基因抗除草剂玉米、非转基因玉米在出苗率、成苗率和受害率方面的差异。判别转基因抗除草剂玉米对除草剂的耐受水平。以普通玉米(郑单958)为对照。

草甘膦和2,4-D复合除草剂田间测试结果，转基因玉米nCX-1对草甘膦和2,4-D复合除草剂具有高度耐受性(表14和图10)。

表14nCX-1对草甘膦和2,4-D复合除草剂耐受性调查表

实施例10：nCX-1草甘膦和烟嘧磺隆复合除草剂耐受性测试

将实施例4转基因玉米事件nCX-1的种子和普通玉米郑单958(作为对照)，采用随机区组设计，3次重复，共24个小区，每个小区面积4m×6m，双粒播种，株距25cm，行距50cm，小区间设1m间隔，在3-5叶期喷施草甘膦和烟嘧磺隆复合除草剂，处理如下：1)不喷施；2)喷施有效剂量60克/亩草甘膦+有效剂量1.6克/亩烟嘧磺隆；3)喷施有效剂量120克/亩草甘膦+有效剂量3.2克/亩烟嘧磺隆；4)喷施有效剂量240克/亩草甘膦+有效剂量6.4克/亩烟嘧磺隆。在用药后1周、2周、4周调查成苗率，植株高度(选取最高的5株)、药害症状(选取药害症状最轻的5株)，药害症状分级按GB/T 17980.42-2000执行。

除草剂受害率计算公式：

草甘膦和烟嘧磺隆复合除草剂田间测试结果，转基因玉米nCX-1对草甘膦和烟嘧磺隆复合除草剂具有高度耐受性(表15和图11)。

表15nCX-1对草甘膦和烟嘧磺隆复合除草剂耐受性调查表

序列表

<110> 杭州瑞丰生物科技有限公司

<120> 抗除草剂转基因玉米事件nCX-1、核酸序列及其检测方法

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

tggatggaag gcttcaaaca ctgata 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

acaccacaag cgaccatacc agttgc 26

<210> 3

<211> 362

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

caactgcgtc gtctggagat tcaactgcaa aacatagcac ggagccaact actacagagg 60

cagcaacaag catcggacaa tcaatgatgc cgctatggat ggaatcgagg ccagcgactg 120

tgttccaaaa ctaccttggc gatggcagtc ggttcgtgcc atcgaggagg tcacagattt 180

atgggccaac actgggtgca gatggtcgct tgtggatgga aggcttcaaa cactgatagt 240

ttaaactgaa ggcgggaaac gacaatctga tccaagctca agctgctcta gcattcgcca 300

ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag 360

ct 362

<210> 4

<211> 494

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc aatttgttta caccacaagc gaccatacca 60

gttgctcagg tgcctcagct actttaccag tcagaggatg aactagcggc gaggcgaaca 120

cgcagtcaca tcacaatctc atcgtcagtt gggtccccta taaacccgct ccagcgctct 180

ccgatcagag cgactccatt gcgagtcggt tcataccccc ggtcgacaga ggtgtccgtc 240

tgtactgctg tgaatatagg ttcggctttt ccggccatta tgatcagagc ccgaaaatag 300

gagctcaaag cacggctcga cacgaaattt atttaattta gtaagataac gactttatat 360

tgttgtgata tttggaggtt tatgtgttta aatgatgcta agattgttta atacctttaa 420

tttagtaaga tatggacttt atgtggttgt aatattttga ttttatgtgg tcaaatatac 480

agtcgggctt ggtc 494

<210> 5

<211> 957

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

agaaagacga cgacttgcgt gccgatctgg agaagttcgg cgccattgag gcgatcgctt 60

tatgccgaca cctgttcatg gcggtgattg tcttcaggga cgaagcgagc gtgccggtcg 120

ctttccggag gcaagaggaa atatcatctg ggctgtacag cgccgtcccg cctccccacc 180

ttgcgctctc cacgagtttt attcatccaa acagtatcaa ggttatcaga tatttcctcc 240

ttcccagtta taaattacta atttagcttt ttctgtatat atatgtagct cttgctgaga 300

acctaaatac ggattatatt tagatgtata gtaaaatcta gttttaaaaa ttaaaataac 360

ttataattta gaacaaatga tgaagtatat attatgctat tcgattggtc tttaaatatg 420

tttttctttt ctaaatgtaa ccacgcattc tactgtgtga acggacgaat caatttttat 480

aggttaattt gtactccagc acatcaactg cgtcgtctgg agattcaact gcaaaacata 540

gcacggagcc aactactaca gaggcagcaa caagcatcgg acaatcaatg atgccgctat 600

ggatggaatc gaggccagcg actgtgttcc aaaactacct tggcgatggc agtcggttcg 660

tgccatcgag gaggtcacag atttatgggc caacactggg tgcagatggt cgcttgtgga 720

tggaaggctt caaacactga tagtttaaac tgaaggcggg aaacgacaat ctgatccaag 780

ctcaagctgc tctagcattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 840

cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt 900

tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgccaag 957

<210> 6

<211> 946

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

tttctccata ataatgtgtg agtagttccc agataaggga attagggttc ctatagggtt 60

tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta tttgtatttg taaaatactt 120

ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt actaaaatcc agatcccccg 180

aattaattcg gcgttaattc agtacattaa aaacgtccgc aatgtgttat taagttgtct 240

aagcgtcaat ttgtttacac cacaagcgac cataccagtt gctcaggtgc ctcagctact 300

ttaccagtca gaggatgaac tagcggcgag gcgaacacgc agtcacatca caatctcatc 360

gtcagttggg tcccctataa acccgctcca gcgctctccg atcagagcga ctccattgcg 420

agtcggttca tacccccggt cgacagaggt gtccgtctgt actgctgtga atataggttc 480

ggcttttccg gccattatga tcagagcccg aaaataggag ctcaaagcac ggctcgacac 540

gaaatttatt taatttagta agataacgac tttatattgt tgtgatattt ggaggtttat 600

gtgtttaaat gatgctaaga ttgtttaata cctttaattt agtaagatat ggactttatg 660

tggttgtaat attttgattt tatgtggtca aatatacagt cgggcttggt ctggcacggc 720

ctaacgaagg cacgacgtgg tttaggacca aactaagcca ctatttttgc acttcggact 780

agcacggtac ggtctaatag ttttagaact ttactgaccc gaactcgttt ggcacgaagc 840

acgatggatt tggactgagc tgacccagct cgtcccaatt gccagcacta gtctgtacca 900

gatcggtaag tcgataccgg cccaaactga ttagcaccgc ctacta 946

<210> 7

<211> 8695

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

agaaagacga cgacttgcgt gccgatctgg agaagttcgg cgccattgag gcgatcgctt 60

tatgccgaca cctgttcatg gcggtgattg tcttcaggga cgaagcgagc gtgccggtcg 120

ctttccggag gcaagaggaa atatcatctg ggctgtacag cgccgtcccg cctccccacc 180

ttgcgctctc cacgagtttt attcatccaa acagtatcaa ggttatcaga tatttcctcc 240

ttcccagtta taaattacta atttagcttt ttctgtatat atatgtagct cttgctgaga 300

acctaaatac ggattatatt tagatgtata gtaaaatcta gttttaaaaa ttaaaataac 360

ttataattta gaacaaatga tgaagtatat attatgctat tcgattggtc tttaaatatg 420

tttttctttt ctaaatgtaa ccacgcattc tactgtgtga acggacgaat caatttttat 480

aggttaattt gtactccagc acatcaactg cgtcgtctgg agattcaact gcaaaacata 540

gcacggagcc aactactaca gaggcagcaa caagcatcgg acaatcaatg atgccgctat 600

ggatggaatc gaggccagcg actgtgttcc aaaactacct tggcgatggc agtcggttcg 660

tgccatcgag gaggtcacag atttatgggc caacactggg tgcagatggt cgcttgtgga 720

tggaaggctt caaacactga tagtttaaac tgaaggcggg aaacgacaat ctgatccaag 780

ctcaagctgc tctagcattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 840

cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt 900

tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt 960

aggtcattca tatgcttgag aagagtcggg atagtccaaa ataaaacaaa ggtaagatta 1020

cctggtcaaa agtgaaaaca tcagttaaaa ggtggtatga agtaaaatat cggtaataaa 1080

aggtggccca aagtgaaatt tactcttttc tactattata aaaattgagg atgtttttgt 1140

cggtactttg atacgtcatt tttgtatgaa ttggttttta agtttattcg cttttggaaa 1200

tgcatatctg tatttgagtc gggttttaag ttcgtctgct tttgtaaata cagagggatt 1260

tgtataagaa atatctttaa aaaaacccat atgctaattt gacataattt ttgagaaaaa 1320

tatatattca ggcgaattct cacaatgaac aataataaga ttaaaatagc tttcccccgt 1380

tgcagcgcat gggtattttt tctagtaaaa ataaaagata gacttagact caaaacattt 1440

acaaaaacaa cccctaaagt tcctaaagcc caaagtgcta tccacgatcc atagcaagcc 1500

cagcccaacc caacccaacc caacccaccc cagtccagcc aactggacaa tagtctccac 1560

acccccccac tatcaccgtg agttgttcgc acgcaccgca cgtctcgcag ccaaaaaaaa 1620

aaaaaagaaa gaaaaaaaag aaaaagaaaa aacagcaggt gggtccgggt cgtgggggcc 1680

ggaaacgcga ggaggatcgc gagccagcga cgaggccggc cctccctccg cttccaaaga 1740

aacgcccccc atcgccacta atatacatac ccccccctct cctcccatcc ccccaaccct 1800

accaccacca ccaccaccac ctccacctcc tcccccctcg ctgccggacg acgagctcct 1860

cccccctccc cctccgccgc cgccgcgccg gtaaccaccc cgcccctctc ctctttcttt 1920

ctccgttttt tttttccgtc tcggtctcga tctttggcct tggtagtttg ggtgggcgag 1980

aggcggcttc gtgcgcgccc agatcggtgc gcgggagggg cgggatctcg cggctggggc 2040

tctcgccggc gtgagtcggc ccgaatcctc gcggggaatg gggctctcgg atgtagatct 2100

gcgatccgcc gttgttgggg gagatgatgg ggggtttaaa atttccgcca tgctaaacaa 2160

gatcaggaag aggggaaaag ggcactatgg tttatatttt tatatatttc tgctgcctcg 2220

tcaggcttag atctgctaga tctttctttc ttctttttgt gggtagaatt tgaatccctc 2280

agcattgttc atcggtagtt tttcttttca tgatttgtga caaatgcagc ctcgtgcgga 2340

gcttttttgt aggtagaaga tggctgacgc cgaggatcca acaatggata aggcctacgt 2400

ggccctcctc tccttcgcct ccctcttctt gctccactac ctcgtttccc gccgcaatgg 2460

caccgggaag ggcagcaagg ccaagggcgc gctgccgcca agccctccat ccgttccgtt 2520

cctgggccac ctccaccttg tcaagacgcc attccacgct gcgctggcac gcctcgcgga 2580

ctgccacggc ccggtcttct ccctgcggat gggagcccgc cccgcagttg tggtgtcctc 2640

gccggagcac gccaaggagt gcttcacgga gcacgacgtg gccttcgcca accggccgcg 2700

ctttccctcg cagcagctcg cctccttcaa cggtgccgcg ctgggttccg ccagctacgg 2760

cccgtactgg cgcaacctcc gccgcgtcgc caccgtccac ctcctgtccg cgcaccgcgt 2820

cgcgtgcatg acggggacta tcgcggccga ggtgcgggcc atggtgcgac ggatgaaccg 2880

cgccgcgcag gtggcatcag gcggcgcggc gcgcatcgag ctcaagcgga ggctatttga 2940

ggtctcgctc agcgtgctta tggagaccat cgcgcggacc aagacgtcac gtacggaggc 3000

ggacgacgac acggacatgt cgcctgaggc ccgggagttc aagcagatcg tggatgagct 3060

cctgcctcac ctcggcacgg ctaacttgtg ggactacatg ccggtgttgc ggtggttcga 3120

cgtgttcggc gtgaggaaga agatcgtgtc cgcggtgagg agaagggacg cgttcctgcg 3180

gcatcttgtc gacgcagaga ggacgaggct ggacgacggc aacgatgcgg gcgagaagaa 3240

gagcatcatt gctatgctgc tcactctgca gaagtcagag ccggacgtct actcggatac 3300

catgatcatg gctctatgtg ggaacttgtt tggggccggc acagagacca cgtcgacgac 3360

caccgaatgg gccatgtctc tcctcctcaa ccacccggag aagctcagga aggcgcaggc 3420

tgagatcgat gctgtcgtgg gcacatcccg ccttcttacc gccgacgaca tgcctcgtct 3480

cacctacctc cgctgcatca tcgacgagac catgcgcctg tacccggccg caccacttct 3540

gctgccacac gagtcctcga cacactgcaa ggtcggcggc tacgacgtgc ccgccggcac 3600

gatgctgctc gtcaacgtgt acgccatcca cagggacccc gcggtgtggg acgggccgac 3660

cgagttcgtg ccggagcggt tcgaggatgg caaggcagaa ggccggctgc tgatgccgtt 3720

cgggatggga cggcgcaagt gtcccggcga gacgctcgcg ctgcggacga tcgggctggt 3780

gctcggcacg ctgatccagt gtttcgactg ggaccgggtt gatggtcttg aggtcgacat 3840

gactgaaagt ggtgggctca cgatccccag ggctgtcccg ttggaggcca tgtgcaggcc 3900

tcgtgcgacg atgcgtgagg ttttgcagga gctctgactc gagtcgagtt tctccataat 3960

aatgtgtgag tagttcccag ataagggaat tagggttcct atagggtttc gctcatgtgt 4020

tgagcatata agaaaccctt agtatgtatt tgtatttgta aaatacttct atcaataaaa 4080

tttctaattc ctaaaaccaa aatccagtac taaaatccag atcccccgaa ttaggtaccg 4140

catgcctaca gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat 4200

gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt 4260

atctatcttt atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac 4320

aataatatca gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca 4380

attgagtatt ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc 4440

tttttttttg caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat 4500

ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct 4560

attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt 4620

agatataaaa tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt 4680

aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc 4740

gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa 4800

gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc 4860

gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc 4920

ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca cggcacggca gctacggggg attcctttcc 4980

caccgctcct tcgctttccc ttcctcgccc gccgtaataa atagacaccc cctccacacc 5040

ctctttcccc aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa 5100

tccacccgtc ggcacctccg cttcaaggta cgccgctcgt cctccccccc cccccctctc 5160

taccttctct agatcggcgt tccggtccat ggttagggcc cggtagttct acttctgttc 5220

atgtttgtgt tagatccgtg tttgtgttag atccgtgctg ctagcgttcg tacacggatg 5280

cgacctgtac gtcagacacg ttctgattgc taacttgcca gtgtttctct ttggggaatc 5340

ctgggatggc tctagccgtt ccgcagacgg gatcgatttc atgatttttt ttgtttcgtt 5400

gcatagggtt tggtttgccc ttttccttta tttcaatata tgccgtgcac ttgtttgtcg 5460

ggtcatcttt tcatgctttt ttttgtcttg gttgtgatga tgtggtctgg ttgggcggtc 5520

gttctagatc ggagtagaat tctgtttcaa actacctggt ggatttatta attttggatc 5580

tgtatgtgtg tgccatacat attcatagtt acgaattgaa gatgatggat ggaaatatcg 5640

atctaggata ggtatacatg ttgatgcggg ttttactgat gcatatacag agatgctttt 5700

tgttcgcttg gttgtgatga tgtggtgtgg ttgggcggtc gttcattcgt tctagatcgg 5760

agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgt atttattaat tttggaactg tatgtgtgtg 5820

tcatacatct tcatagttac gagtttaaga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat 5880

acatgttgat gtgggtttta ctgatgcata tacatgatgg catatgcagc atctattcat 5940

atgctctaac cttgagtacc tatctattat aataaacaag tatgttttat aattattttg 6000

atcttgatat acttggatga tggcatatgc agcagctata tgtggatttt tttagccctg 6060

ccttcatacg ctatttattt gcttggtact gtttcttttg tcgatgctca ccctgttgtt 6120

tggtgttact tctgcaggtc gactctagaa acaatggcgg cgaccatggc gtccaacgct 6180

gcggctgcgg ctgcggtgtc cctggaccag gccgtggctg cgtcggcagc gttctcgtcg 6240

cggaagcagc tgcggctgcc tgccgcagcg cgcggaggga tgcgggtgcg ggtgcgggcg 6300

cggggtcggc gggaggcggt ggtggtggcg tccgcgtcgt cgtcgtcggt ggcagcgccg 6360

gcggcgaagg ctgagatgct acacggtgca agcagccggc cggcaaccgc tcgcaaatct 6420

tccggccttt cgggaacggt caggattccg ggcgataagt ccatatccca ccggtcgttc 6480

atgttcggcg gtcttgccag cggtgagacg cgcatcacgg gcctgcttga aggtgaggac 6540

gtgatcaata ccgggaaggc catgcaggct atgggagcgc gtatccgcaa ggaaggtgac 6600

acatggatca ttgacggcgt tgggaatggc ggtctgctcg cccctgaggc ccctctcgac 6660

ttcggcaatg cggcgacggg ctgcaggctc actatgggac tggtcggggt gtacgacttc 6720

gatagcacgt tcatcggaga cgcctcgctc acaaagcgcc caatgggccg cgttctgaac 6780

ccgttgcgcg agatgggcgt acaggtcaaa tccgaggatg gtgaccgttt gcccgttacg 6840

ctgcgcgggc cgaagacgcc taccccgatt acctaccgcg tgccaatggc atccgcccag 6900

gtcaagtcag ccgtgctcct cgccggactg aacactccgg gcatcaccac ggtgatcgag 6960

cccatcatga ccagggatca taccgaaaag atgcttcagg ggtttggcgc caacctgacg 7020

gtcgagacgg acgctgacgg cgtcaggacc atccgccttg agggcagggg taaactgact 7080

ggccaagtca tcgatgttcc gggagacccg tcgtccacgg ccttcccgtt ggttgcggcg 7140

ctgctcgtgc cggggagtga cgtgaccatc ctgaacgtcc tcatgaaccc gaccaggacc 7200

ggcctgatcc tcacgcttca ggagatggga gccgacatcg aggtgatcaa cccgcgcctg 7260

gcaggcggtg aagacgttgc ggatctgcgc gtgcgctcct ctaccctgaa gggcgtgacg 7320

gtcccggaag atcgcgcgcc gtccatgata gacgagtatc ctattctggc cgtcgccgct 7380

gcgttcgccg aaggggccac ggtcatgaac ggtcttgagg aactccgcgt gaaggaatcg 7440

gatcgcctgt cggcggtggc caatggcctg aagctcaacg gtgttgactg cgacgagggt 7500

gagacctcac tcgtggtccg tggccggcct gatggcaagg gcctcggcaa cgccagtgga 7560

gcggccgtcg ccacgcacct cgatcatcgc atcgcgatgt ccttcttggt gatgggtctc 7620

gtctcagaga acccggtgac cgtcgatgac gccacgatga tagcgacgag cttcccagag 7680

ttcatggatc tgatggcggg cctcggggcc aagatcgaac tgtctgacac gaaggccgct 7740

tgactcgagt ttctccataa taatgtgtga gtagttccca gataagggaa ttagggttcc 7800

tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgt 7860

aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca aaatccagta ctaaaatcca 7920

gatcccccga attaattcgg cgttaattca gtacattaaa aacgtccgca atgtgttatt 7980

aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaagcgacc ataccagttg ctcaggtgcc 8040

tcagctactt taccagtcag aggatgaact agcggcgagg cgaacacgca gtcacatcac 8100

aatctcatcg tcagttgggt cccctataaa cccgctccag cgctctccga tcagagcgac 8160

tccattgcga gtcggttcat acccccggtc gacagaggtg tccgtctgta ctgctgtgaa 8220

tataggttcg gcttttccgg ccattatgat cagagcccga aaataggagc tcaaagcacg 8280

gctcgacacg aaatttattt aatttagtaa gataacgact ttatattgtt gtgatatttg 8340

gaggtttatg tgtttaaatg atgctaagat tgtttaatac ctttaattta gtaagatatg 8400

gactttatgt ggttgtaata ttttgatttt atgtggtcaa atatacagtc gggcttggtc 8460

tggcacggcc taacgaaggc acgacgtggt ttaggaccaa actaagccac tatttttgca 8520

cttcggacta gcacggtacg gtctaatagt tttagaactt tactgacccg aactcgtttg 8580

gcacgaagca cgatggattt ggactgagct gacccagctc gtcccaattg ccagcactag 8640

tctgtaccag atcggtaagt cgataccggc ccaaactgat tagcaccgcc tacta 8695

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

caactgcgtc gtctggagat tcaactg 27

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

agctggcgta atagcgaaga ggcccg 26

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc 30

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

gaccaagccc gactgtatat ttgaccac 28

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

agaaagacga cgacttgcgt gccgatc 27

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 13

cttggcactg gccgtcgttt tacaac 26

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 14

tttctccata ataatgtgtg agtagttccc 30

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 15

tagtaggcgg tgctaatcag tttgggc 27

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 16

ctcccaatcc tttgacatct gc 22

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 17

tcgatttctc tcttggtgac agg 23

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 18

cggtggatgc taaggctgat g 21

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 19

aaagggccag gttcattatc ctc 23

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 20

gagcagaccg ccattccca 19

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 21

gaaggccatg caggctatgg 20

<210> 22

<211> 729

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 22

agaaagacga cgacttgcgt gccgatctgg agaagttcgg cgccattgag gcgatcgctt 60

tatgccgaca cctgttcatg gcggtgattg tcttcaggga cgaagcgagc gtgccggtcg 120

ctttccggag gcaagaggaa atatcatctg ggctgtacag cgccgtcccg cctccccacc 180

ttgcgctctc cacgagtttt attcatccaa acagtatcaa ggttatcaga tatttcctcc 240

ttcccagtta taaattacta atttagcttt ttctgtatat atatgtagct cttgctgaga 300

acctaaatac ggattatatt tagatgtata gtaaaatcta gttttaaaaa ttaaaataac 360

ttataattta gaacaaatga tgaagtatat attatgctat tcgattggtc tttaaatatg 420

tttttctttt ctaaatgtaa ccacgcattc tactgtgtga acggacgaat caatttttat 480

aggttaattt gtactccagc acatcaactg cgtcgtctgg agattcaact gcaaaacata 540

gcacggagcc aactactaca gaggcagcaa caagcatcgg acaatcaatg atgccgctat 600

ggatggaatc gaggccagcg actgtgttcc aaaactacct tggcgatggc agtcggttcg 660

tgccatcgag gaggtcacag atttatgggc caacactggg tgcagatggt cgcttgtgga 720

tggaaggct 729

<210> 23

<211> 677

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 23

ccataccagt tgctcaggtg cctcagctac tttaccagtc agaggatgaa ctagcggcga 60

ggcgaacacg cagtcacatc acaatctcat cgtcagttgg gtcccctata aacccgctcc 120

agcgctctcc gatcagagcg actccattgc gagtcggttc atacccccgg tcgacagagg 180

tgtccgtctg tactgctgtg aatataggtt cggcttttcc ggccattatg atcagagccc 240

gaaaatagga gctcaaagca cggctcgaca cgaaatttat ttaatttagt aagataacga 300

ctttatattg ttgtgatatt tggaggttta tgtgtttaaa tgatgctaag attgtttaat 360

acctttaatt tagtaagata tggactttat gtggttgtaa tattttgatt ttatgtggtc 420

aaatatacag tcgggcttgg tctggcacgg cctaacgaag gcacgacgtg gtttaggacc 480

aaactaagcc actatttttg cacttcggac tagcacggta cggtctaata gttttagaac 540

tttactgacc cgaactcgtt tggcacgaag cacgatggat ttggactgag ctgacccagc 600

tcgtcccaat tgccagcact agtctgtacc agatcggtaa gtcgataccg gcccaaactg 660

attagcaccg cctacta 677

Claims

1.一种抗除草剂转基因玉米事件nCX-1，其特征在于，所述转基因玉米事件nCX-1是将外源DNA分子插入玉米基因组7号染色体上SEQ ID NO.22所示的3’端和SEQ ID NO.23所示的5’端之间获得的DNA分子；所述外源DNA分子包括N-Z1基因表达盒和cp4 epsps基因表达盒。

2.如权利要求1所述的抗除草剂转基因玉米事件nCX-1，其特征在于，所述N-Z1基因表达盒包括：用作N-Z1基因启动的Actin启动子、N-Z1基因编码框、用作N-Z1基因终止的CaMV35S终止子；所述cp4 epsps基因表达盒包括：用作cp4 epsps基因启动的ZmUbi启动子、cp4 epsps基因编码框、作为cp4 epsps基因终止的CaMV35S终止子。

3.如权利要求1所述的抗除草剂转基因玉米事件nCX-1，其特征在于，所述转基因玉米事件nCX-1核酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.一种用于检测权利要求1所述转基因玉米事件nCX-1的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID NO.1或其互补序列、和/或SEQ ID NO.2或其互补序列。

5.如权利要求4所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID NO.3或其互补序列、和/或SEQ ID NO.4或其互补序列。

6.如权利要求4所述的核酸序列，其特征在于所述核酸序列包括SEQ ID NO.5或其互补序列、和/或SEQ ID NO.6或其互补序列。

7.如权利要求4所述的核酸序列，其特征在于所述核酸序列包括SEQ ID NO.7或其互补序列。

8.一种检测权利要求1所述转基因玉米事件nCX-1的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)将待检测样品与第一引物和第二引物在核酸扩增反应液中接触；所述第一引物为SEQID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.14中的一种；所述第二引物为SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.15中的一种；(2)进行核酸扩增反应；(3)检测扩增产物的存在；所述扩增产物包括SEQ ID NO.1或其互补序列、或者SEQ ID NO.2或其互补序列。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增产物包括SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示核苷酸序列或其互补序列中至少13个连续的核苷酸。

10.一种培育耐除草剂的含权利要求1所述转基因玉米事件nCX-1的玉米植物的方法，其特征在于，所述方法包括：种植含有特定区域核酸序列的玉米种子，使所述玉米长成玉米植株，用除草剂喷洒所述玉米植株，收获与其他不含有所述特定区域核酸序列的玉米植株相比，耐除草剂能力显著提高了的植株；所述特定区域核酸序列来自转基因玉米事件nCX-1，所述特定区域核酸序列包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6或者SEQ ID NO.7所示核苷酸序列中的一种或其互补序列；所述除草剂为草甘膦、啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4-D中一种或者多种。

11.一种获得耐除草剂的含权利要求1所述转基因玉米事件nCX-1的玉米植株的方法，其特征在于，将含有特定区域核酸序列的玉米植株，与另一种玉米植株杂交，从而产生子代植株；收获与其他不含有所述特定区域核酸序列的植株相比，对除草剂的耐受性显著提高；所述特定区域核酸序列来自转基因玉米事件nCX-1，所述特定区域的核酸序列包含SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示核苷酸序列中的一种或其互补序列；所述除草剂为草甘膦、啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4-D中一种或者多种。

12.一种控制含权利要求1所述转基因玉米事件nCX-1的转基因玉米田间杂草的方法，其特征在于，所述方法包括将除草剂喷施到种植转基因玉米的大田中，玉米田间杂草被杀灭；所述转基因玉米基因组中包含来自转基因玉米事件nCX-1的特定区域核酸序列，所述特定区域核酸序列包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6或者SEQ ID NO.7所示核苷酸序列中的一种或其互补序列；所述除草剂为草甘膦、啶嘧磺隆、烟嘧磺隆、二甲四氯、2,4-D中一种或者多种。

13.一种产生自权利要求1所述转基因玉米事件nCX-1的农产品或商品，其特征在于，所述农产品或商品包括玉米粉、玉米面、玉米油、玉米淀粉、玉米面筋、玉米饼、含玉米成分的化妆品或者含玉米成分的辅料。