CN118085050A - 水稻转录因子erf及其编码基因在调控植物抗病性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻转录因子ERF及其编码基因在抗病育种中的应用，属于生物技术领域。本发明在水稻免疫反应的研究中，鉴定得到一个翻译受稻瘟菌诱导的基因ERF；通过实验验证发现：在水稻中过表达ERF基因可以显著提高水稻抗病性。说明ERF基因正调控植物的抗病性，本发明可作为目的基因用于提高水稻或者其他植物抗病性的分子育种，为植物抗病性研究奠定理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及水稻转录因子ERF及其编码基因在抗病育种中的应用。
背景技术
真菌病害如稻瘟病造成农作物大规模减产，因此培育抗病作物是种植业的主要目标之一。已报道了不少与植物抗病的相关基因，包括效应分子基因和调控基因，它们来源于水稻、小麦、玉米、大豆等农作物以及模式植物拟南芥等。其中一些已作为目的基因用于作物抗病基因工程，成功培育出抗病水稻、小麦、玉米、大豆等。但是由于遗传背景的差异，导致一些基因的应用障碍，因此仍然需要新的相关基因来满足育种的需要。
水稻作为最重要的粮食作物之一，改善其抗病性，具有重要的理论及现实意义。
ERF转录因子是在植物发育和非生物胁迫过程中发挥了重要作用，因此以往对ERF的研究集中于其参与的植物发育和非生物胁迫耐受性。目前尚未见ERF转录因子在调控植物抗病性方面的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供水稻转录因子ERF及其编码基因在抗病育种中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，ERF正调控水稻抗病性，通过过表达ERF可以提高水稻抗病性。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供水稻ERF转录因子在如下任一项中的应用：
(1)调控植物抗病性中的应用；
(2)在制备调控植物抗病性的产品中的应用；
(3)培育抗病植物品种中的应用；
(4)制备培育抗病植物品种的产品中的应用；
所述水稻ERF转录因子的氨基酸序列为如SEQ ID NO：2所示或包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白序列。所述ERF转录因子的氨基酸序列还包括SEQ ID NO：2所示序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO：2所示的蛋白具有80％以上的同一性且具有正调控植物抗病性的蛋白。所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
本发明还提供水稻ERF转录因子的编码基因在如下任一项中的应用：
(1)调控植物抗病性中的应用；
(2)在制备调控植物抗病性的产品中的应用；
(3)培育抗病植物品种中的应用；
(4)制备培育抗病植物品种的产品中的应用；
所述水稻ERF转录因子的氨基酸序列为如SEQ ID NO：2所示或包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白序列；所述编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示或者包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因序列。
本发明还提供包含水稻ERF转录因子的编码基因的重组载体在如下任一项中的应用：
(1)调控植物抗病性中的应用；
(2)在制备调控植物抗病性的产品中的应用；
(3)培育抗病植物品种中的应用；
(4)制备培育抗病植物品种的产品中的应用；
所述水稻ERF转录因子的氨基酸序列为如SEQ ID NO：2所示或包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白序列；所述编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示或者包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因序列。
本发明还提供包含重组载体的宿主菌在如下任一项中的应用：
(1)调控植物抗病性中的应用；
(2)在制备调控植物抗病性的产品中的应用；
(3)培育抗病植物品种中的应用；
(4)制备培育抗病植物品种的产品中的应用；
所述重组载体为整合ERF基因的载体，所述ERF基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示或者包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因序列。
优选的是，所述调控植物抗病性的方式包括：
通过在所述植物中过表达ERF基因提高所述植物的抗病性；或者通过在所述植物中敲除ERF基因降低所述植物的抗病性。
优选的是，所述植物包括禾本科植物。更优选的是，所述禾本科植物为水稻。
本发明还提供一种调控植物抗病性的方法，包括以下任意一种方法：
(1)通过在植物中过表达ERF基因提高所述植物的抗病性；
(2)通过在植物中敲除ERF基因降低所述植物的抗病性；
所述ERF基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示或者包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因序列。
优选的是，所述植物包括禾本科植物。更优选的是，所述禾本科植物为水稻。
本发明还提供一种培育高抗病性转基因植物的方法，包括以下步骤：通过在植物中过表达ERF基因，提高所述ERF基因的表达量，获取高抗病性转基因植物。
优选的是，所述ERF基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示或者包含如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的基因序列；
所述植物包括禾本科植物。更优选的是，所述禾本科植物为水稻。
本发明公开了以下技术效果：
本发明发明人在水稻免疫反应的研究中，申鉴定到一个翻译效率受稻瘟菌诱导的基因，经分析其编码一个ERF转录因子家族成员，命名为ERF。本发明通过实验证明，ERF蛋白具有提高水稻抗病性的功能。具体地，将ERF在ZH11中过表达，转基因植株呈现高于受体ZH11的抗病性。说明ERF正调控植物的抗病性，ERF蛋白及其编码基因对培育抗病水稻品种具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为稻瘟菌侵染12小时后水稻ERF的翻译效率和基因表达变化；
图2为ERF的蛋白结构域、保守的乙酰辅酶A(AP2)结合口袋基序以及敲除靶点(Target)的结构示意图；
图3为ERF敲除载体结构示意图；
图4为ERF-KO1和ERF-KO2两个敲除株系的敲除靶点测序结果；
图5为ERF过表达载体结构示意图；
图6为野生型ZH11(WT)、ERF-OE1和ERF-OE2过表达植株中ERF的相对表达量检测结果；
图7为ERF敲除植株稻瘟菌接菌敲除植株的表型检测结果；A：野生型ZH11(WT)以及敲除植株ERF-KO1和ERF-KO2的戳伤接菌结果；B：野生型ZH11(WT)以及敲除植株ERF-KO1和ERF-KO2的喷雾接菌结果；比例尺为1cm，柱状图上方星号表示差异显著(P<0.05)；
图8为ERF过表达植株稻瘟菌接菌敲除植株的表型检测结果；A:野生型ZH11(WT)以及过表达植株ERF-OE1和ERF-OE2植株的戳伤接菌结果；B：野生型ZH11(WT)以及过表达植株ERF-OE1和ERF-OE2植株的喷雾接菌结果；比例尺为1cm，柱状图上方星号表示差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中涉及的部分实验材料和试剂：
(1)水稻品种中花11(O.sativa L.spp.japonica，var zhonghua11，AA genome，ZH11)属粳亚种，记载于如下文献：倪玉冲，水稻花培新品种—中花11号，农业科技通讯，1989，07，35；由中国科学院遗传与发育生物学研究所陈学伟教授提供。
(2)ERF过表达和敲除转基因水稻由伯远生物技术公司完成。
(3)植物双元表达载体pTCRISPR，四川农业大学国家重点实验室唐永严副教授提供。
植物双元表达载体pCAMBIA2300，四川农业大学水稻研究所吴先军教授提供。
(4)Total RNA提取试剂盒：购自美国Invitrogen的TRIzol,货号为15596026。
反转录试剂盒：购自中国诺唯赞(Vanzyme)的HiScript III RT SuperMix forqPCR(+gDNA wiper)，货号为R323-01。
荧光定量试剂盒：购自中国诺唯赞(Vanzyme)的AceQ qPCR SYBR Green MasterMix，货号为Q111-02。
同源重组试剂盒：购自中国诺唯赞(Vanzyme)的ClonExpress IIOne StepCloning Kit，货号为C112-01。
实施例1水稻免疫反应中受诱导的基因ERF及其克隆
发明人在研究水稻的免疫反应的过程中，发现ERF的表达受到稻瘟菌的诱导。应用聚合酶链式反应验证了ERF在稻瘟侵染过程各时间点的表达，以三周龄的ZH11为研究材料，在ZH11植株叶片上接种稻瘟菌，具体分组为：
实验组：喷施含有5×105个·ml-1Zhong10-8-14稻瘟菌孢子和0.1％tween20的溶液；
对照组：喷雾0.1％tween20的溶液；
分别在12小时(12H)取水稻叶片。送交诺禾致源进行Riboosme profiling测序，经过分析后确定该基因的翻译受稻瘟菌诱导(见图1)。经分析，该基因编码ERF类转录因子。按照水稻基因组参考基因序列，设计引物：
ERFF：5’-ATGGCTCCCAGGAACGCCGC-3’；
ERFR：5’-CTACGCCTCCTCGATCGGCGGCG-3’。
以ZH11总cDNA为模板，由上述引物扩增获得约0.7Kb DNA条带。经测序后确认其为属于ERFs家族的ERF基因。将水稻基因组参考序列中LOC_Os04g52090序列及从ZH11总cDNA扩增获得的克隆序列比对后表明，ZH11中获得的克隆序列与LOC_Os04g52090序列相同。ERF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其结构分析见图2。编码ERF蛋白的基因ERF的编码链的CDS序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1具体如下：
ATGGCTCCCAGGAACGCCGCCGAGGCCGTCGCCGTCGCCGTGGCGGAGGGCGGAGGAGCCGGCATGGAGCCCAGGTTCCGCGGCGTGAGGAAGCGCCCGTGGGGCAGGTACGCGGCGGAGATCCGCGACCCGGCCAGGAAGGCGCGGGTGTGGCTCGGCACCTTCGACACCGCCGAGGCCGCGGCGCGCGCCTACGACAGCGCCGCGCTCCACTTCCGCGGGCCCAAGGCCAAGACCAACTTCCCCGTCGCCTTCGCGCACGCCCACCACCACGCCCCGCCGCCGCCGCTGCCCAAGGCGGCGGCGCTGGCCGTCGTCAGCCCGACCAGCAGCACGGTCGAGTCGTCCTCCCGGGACACGCCCGCCGCCGCCCCGGTGGCGGCCGCGGCCAAGGCCCAGGTGCCCGCCTCGCCTTCGCTCGATCTGAGCCTCGGGATGTCGGCCATGGTGGCCGCCCAGCCGTTCCTGTTCCTCGACCCCAGGGTCGCGGTGACCGTGGCCGTCGCGGCACCGGTGCCTCGCCGGCCGGCCGTCGTCAGCGTCAAGAAGGAGGTAGCTCGCCTGGACGAGCAGAGCGACACCGGCTCGTCGTCATCCGTGGTGGACGCCTCGCCGGCCGTCGGCGTGGGGCTCGACCTGAACCTGCCGCCGCCGATCGAGGAGGCGTAG.
SEQ ID NO：2具体如下：
MAPRNAAEAVAVAVAEGGGAGMEPRFRGVRKRPWGRYAAEIRDPARKARVWLGTFDTAEAAARAYDSAALHFRGPKAKTNFPVAFAHAHHHAPPPPLPKAAALAVVSPTSSTVESSSRDTPAAAPVAAAAKAQVPASPSLDLSLGMSAMVAAQPFLFLDPRVAVTVAVAAPVPRRPAVVSVKKEVARLDEQSDTGSSSSVVDASPAVGVGLDLNLPPPIEEA.
实施例2ERF植物敲除载体构建
(1)ERF敲除载体pTCRISPR-sgRNERF的构建
以水稻ZH11的基因组为模板，设计敲除靶点序列为：5’-AACGTGTTTCCAAGTCTCTCAGG-3’。
并合成如下引物：
F：5’-TGTGAACGTGTTTCCAAGTCTCTCG-3’。
R：5’-AAAACGAGAGACTTGGAAACACGTT-3’。
经95℃变性后，退火形成双链。将pTCRISPR载体经BsaI酶切，回收得到线性化载体。按如下表1所示体系将上述DNA双链和线性化载体混合，进行T4 DNAligase连接反应在室温孵育30分钟。
表1
经连接获得pTCRISPR-sgRNAERF敲除载体(见图3)。
(2)转化
转化至DH5α感受态，经卡那霉素筛选后，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，阳性菌落提取质粒并测序正确后确认pTCRISPR-sgRNAERF7无误，可进行遗传转化。
(3)敲除转基因水稻的构建
ERF敲除转基因水稻由伯远生物技术公司完成。选取ERF敲除后稳定遗传的植株ERF-KO1和ERF-KO2，并测序分析，结果见图4，结果显示相比野生植株，敲除植株中靶点序列发生碱基插入或者缺失。
实施例3ERF植物过表达载体构建
(1)ERF过表达载体pCAMBIA2300-ERF的构建
以水稻ZH11的总RNA反转录得到的cDNA为模板，克隆引物为：
F：5’-GGACAGGGTACCCGGGGATCCATGGCTCCCAGGAACGCCGC-3’；
R：5’-GGTACTAGTGTCGACTCTAGACGCCTCCTCGATCGGCGGCG-3’；
PCR扩增得到ERF全长cDNA，将pCAMBIA2300-35S-eGFP-OCS载体经BamHI和XbaI双酶切，回收得到线性化载体。按如下表2所示体系将上述PCR回收产物ERF全长cDNA和线性化载体混合，进行同源重组。
表2
经同源重组获得pCAMBIA2300-ERF重组载体(见图5)。
(2)转化
转化至DH5α感受态，经卡那霉素筛选后，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，阳性菌落提取质粒并测序正确后确认pCAMBIA2300-ERF无误，可进行遗传转化。
(3)过表达转基因水稻的构建
ERF过表达转基因水稻由伯远生物技术公司完成。选取ERF过表达后稳定遗传的植株ERF-OE1和ERF-OE2，并检测过表达植株中ERF的相对表达量，结果见图6，结果显示相比野生植株，过表达植株中ERF的相对表达量显著提高。
实施例4ERF参与调控植株的抗病性
在植物中，关于ERF的研究，主要集中在发育和非生物胁迫调节方面。申请人首次发现了ERFs蛋白ERF参与调节水稻的茉莉酸合成，为茉莉酸途径的调节因子。茉莉酸被誉为防御激素，其在调控植物抗病反应中发挥了重要作用。因此测试了ERF对水稻抗病性的影响。
苗期的戳伤接菌处理：受试材料为:ZH11、以ZH11背景并遗传稳定的ERF敲除株系ERF-KO1和ERF-KO2、以ZH11背景并遗传稳定的ERF过表达株系ERF-OE1和ERF-OE2。挑选粒型饱满的种子，放到装有自来水的锥形瓶中，置于37℃黑暗培养箱中萌发，每天换水。2天后挑选露白的种子放到96孔育苗板中，将96孔育苗板放到浮漂上，于Hoagland营养液中生长。21天后选取长势和大小一致的倒数第二片水稻叶片，戳伤后接种5μL浓度为5×105个·mL-1的Zhong10-8-14稻瘟菌孢子，5天后观察并统计病斑长度。
苗期喷雾处理：同上“苗期的戳伤接菌处理”一样，选取21天后选取长势和大小一致的倒数第二片水稻叶片，喷施浓度为5×105个·mL-1的Zhong10-8-14稻瘟菌孢子，5天后观察并统计病斑长度。
结果显示，水培条件下，ZH11、ERF-KO1、ERF-KO2、ERF-OE1和ERF-OE2的生长无明显差异，实验生物学重复3次。每次每种植株各20棵。统计显示，戳伤接种后，与ZH11相比，ERF-KO1、ERF-KO2植株的病斑长度极显著增高，对病原菌更加敏感(见图7)，而在ZH11中过表达ERF病斑长度显著降低，植株的抗病性明显增加(见图8)。说明ERF正调控植物的抗病性，其编码基因ERF可作为目的基因用于提高植物抗病性的分子育种。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.水稻ERF转录因子在如下任一项中的应用：
(1)调控植物抗病性中的应用；
(2)在制备调控植物抗病性的产品中的应用；
(3)培育抗病植物品种中的应用；
(4)制备培育抗病植物品种的产品中的应用；
所述水稻ERF转录因子的氨基酸序列为如SEQ ID NO：2所示或包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白序列。
2.水稻ERF转录因子的编码基因在如下任一项中的应用：
(1)调控植物抗病性中的应用；
(2)在制备调控植物抗病性的产品中的应用；
(3)培育抗病植物品种中的应用；
(4)制备培育抗病植物品种的产品中的应用；
所述水稻ERF转录因子的氨基酸序列为如SEQ ID NO：2所示或包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白序列；所述编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示或者包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因序列。
3.包含水稻ERF转录因子的编码基因的重组载体在如下任一项中的应用：
(1)调控植物抗病性中的应用；
(2)在制备调控植物抗病性的产品中的应用；
(3)培育抗病植物品种中的应用；
(4)制备培育抗病植物品种的产品中的应用；
所述水稻ERF转录因子的氨基酸序列为如SEQ ID NO：2所示或包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白序列；所述编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示或者包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因序列。
4.包含重组载体的宿主菌在如下任一项中的应用：
(1)调控植物抗病性中的应用；
(2)在制备调控植物抗病性的产品中的应用；
(3)培育抗病植物品种中的应用；
(4)制备培育抗病植物品种的产品中的应用；
所述重组载体为整合ERF基因的载体，所述ERF基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示或者包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因序列。
5.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述调控植物抗病性的方式包括：
通过在所述植物中过表达ERF基因提高所述植物的抗病性；或者通过在所述植物中敲除ERF基因降低所述植物的抗病性。
6.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括禾本科植物。
7.一种调控植物抗病性的方法，其特征在于，包括以下任意一种方法：
(1)通过在植物中过表达ERF基因提高所述植物的抗病性；
(2)通过在植物中敲除ERF基因降低所述植物的抗病性；
所述ERF基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示或者包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因序列。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物包括禾本科植物。
9.一种培育高抗病性转基因植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：通过在植物中过表达ERF基因，提高所述ERF基因的表达量，获取高抗病性转基因植物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述ERF基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示或者包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因序列；
所述植物包括禾本科植物。
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