CN112626077A - 一种参与抗旱的苹果自噬相关基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种参与抗旱的苹果自噬相关基因及其应用，所述基因为MdATG5a基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，可以通过苹果自噬抗旱基因构建强抗旱的转基因植株，从而提高植株抗旱性。本发明的苹果自噬抗旱基因MdATG5a，能够用于构建强抗旱的转基因植株，提高转基因植物的自噬活性。

Description

一种参与抗旱的苹果自噬相关基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种参与抗旱的苹果自噬相关基因及其应用。

背景技术

自噬是指当细胞处于逆境或特殊生长发育阶段时，细胞降解老化受损蛋白或细胞器并将降解产物回收利用的过程，其在真核生物的进化中高度保守。植物细胞自噬主要有三种类型，包括巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬(Bassham,2009)。其中巨自噬是通常意义上所指的细胞自噬，也是研究最广泛且最为深入的自噬类型。胞质成分或细胞器等待降解物被包裹进入双层膜结构形成自噬体，双层膜自噬体的形成是自噬过程发生的显著标志。形成自噬体的外膜能够与液泡膜或溶酶体膜融合，进而包裹货物的内膜结构被运送至液泡或溶酶体的酸性环境中进行降解，其降解产物可释放至胞质并循环利用(Liu andBassham,2012)。

自噬概念于1963年被首次提出，而后Ohsumi等于1993年在酵母中分离出了第一批自噬相关基因(Tsukada and Ohsumi,1993)。截至目前，研究人员已于酵母中鉴定出三十多个自噬相关基因。通过同源克隆的方式，动植物中的自噬相关基因相继被克隆鉴定出来。这些自噬基因参与到自噬发生过程的每一个阶段，包括自噬的诱导、自噬泡的成核与延伸扩张、自噬泡的成熟以及其与溶酶体或液泡融合等过程(Klionsky et al.,2003；Nakatogawaet al.,2009；Feng et al.,2014)。根据参与自噬发生阶段的不同，可将自噬蛋白分成以下四类：ATG1激酶复合体、ATG2/9/18跨膜复合体、磷脂酰肌醇3-激酶复合体以及ATG8-PE和ATG5-12-16两个类泛素蛋白结合系统。其中，ATG8-PE和ATG5-12-16蛋白复合体在自噬体膜的延伸扩张以及最终包裹待降解物形成自噬体的过程中发挥着重要作用。自噬蛋白ATG5所参与的ATG5-12-16类泛素结合系统作用于自噬体膜的弯曲并募集自噬蛋白ATG8，促进ATG8与PE的结合。因此，ATG5是自噬发生过程中最为关键的蛋白之一，拟南芥自噬缺陷突变体atg5-1无法形成自噬小体，且对多种逆境胁迫高度敏感(Le Bars et al.,2014)。

随着自噬研究的深入，检测自噬发生水平的方法也趋于成熟，主要手段包括以下三种：透射电镜检测法(TEM)、自噬体膜标志性蛋白质ATG8检测法和单丹(磺)酰戊二胺染色法(MDC)染色法。上世纪九十年代，自噬最初被检测到所用的方法就是TEM方法。透射电镜检测自噬体不仅能够清晰观察到自噬体的形态，还可通过所观测到自噬体的大小与数量推测自噬活性强弱。ATG8是自噬体膜标志蛋白，其与PE共价结合由水溶形式转变为脂溶形式，脂溶性的ATG8结合于自噬体膜上直至自噬体降解，因此ATG8常被作为指示自噬发生强度的衡量标准(Tanida et al.,2004)。MDC是自噬囊泡示踪剂，能够与自噬体结合，经MDC染色后可通过流式细胞仪或荧光显微镜检测到含有自噬泡的细胞(卢建美等，2012)。便捷成熟的自噬体检测方法为我们的研究奠定了基础。

作为细胞中重要的蛋白质降解途径之一，植物自噬被报道参与生长发育、衰老、非生物胁迫和抗病反应等多种生理过程。在营养匮乏条件下，植物细胞自噬被诱导发生，自噬体包裹氧化受损蛋白或特殊细胞组分，将其运送至液泡降解。释放出的降解产物被循环利用，为细胞提供能量，从而维持细胞稳态(Bassham et al.,2007)。在拟南芥中过量表达ATG8f可促进植株生长并提高其对低氮胁迫的耐受性，异源过表达大豆GmATG8c的转基因拟南芥更耐低氮，过表达MdATG18a可显著提高转基因苹果植株的氮饥饿耐受力(Slavikovaet al.,2008；Xia et al.,2012；Sun et al.,2017)。在植物中，自噬还能够响应干旱、盐害、高温、水淹等多种非生物胁迫，帮助植物在逆境下得以生存(Han et al.,2011)。自噬缺陷的AtATG18a植株对盐害与干旱极为敏感，而在番茄与苹果中过量表达MdATG18a则可以提高植株对干旱胁迫的抗性(Liu et al.,2009；Sun et al.,2017)。除此之外，自噬也参与了植物对生物胁迫的响应，拟南芥自噬突变体表现出对死体营养型真菌的易感性(Lai etal.,2011)。

苹果是世界主要水果之一，我国则是世界上最大的苹果生产及消费国，栽培面积、总产量与出口量均居首位。作为我国最大的苹果产区，西北黄土高原地区面临着降水量少，年周期中降水分布不均等问题，干旱缺水成为制约该地区苹果生产效益与可持续发展的主要因素。因此，如何提高苹果植株对干旱胁迫的耐受性，从而保证良好的经济效益，已成为半干旱或干旱地区苹果产业发展亟待解决的问题。

自噬是真核生物响应逆境并维持生存的关键机制，因此利用基因工程分子生物学手段研究苹果自噬相关基因MdATG5a在干旱逆境下的作用机理，可为解决黄土高原苹果产区所面临的干旱缺水胁迫问题提供理论基础。本研究解析了MdATG5a在干旱胁迫下的功能及作用机理，对于开展苹果抗旱分子定向育种具有重要的理论意义和实际应用价值。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种参与抗旱的苹果自噬相关基因及其应用，所述基因为MdATG5a基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述苹果自噬相关基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了所述的苹果自噬相关基因在构建强抗旱的转基因植株中的应用。

上述参与抗旱的苹果自噬相关基因构建强抗旱的转基因植株的方法，包括以下步骤：

S1，苹果自噬相关基因的克隆；

S2，植物表达载体的构建

通过XbaI和KpnI两个酶切位点将MdATG5a基因的编码区连接至pCambia2300载体上；

S3，农杆菌介导的苹果转化

S3.1，将构建成功的植物过表达载体转入EHA105农杆菌菌株，选择PCR检测为阳性的农杆菌，备用；

S3.2，将S3.1中获得的PCR检测为阳性的农杆菌重悬活化，并稀释OD₆₀₀至0.5-0.6，获得农杆菌重悬液；

S3.3，取正常生长28-30天的苹果组培苗的叶片，置于农杆菌重悬液中划伤，浸润8-12分钟，然后置于无菌滤纸上吸干菌液，将叶片于共培养培养基黑暗培养3天；

S3.4，冲洗叶片，吸干水分转入延迟培养基培养2天后，将叶片转移至卡那霉素筛选培养基上黑暗培养3-4周，待出现抗性芽后见光培养，30-40天后移入含有卡那霉素的继代培养基中继续筛选培养3-4个月；

S4，MdATG5a基因过量表达转基因植株的鉴定，

对S3经卡那霉素筛选后的植株，对其抗性芽取样，在DNA与RNA水平对其进行鉴定。

进一步的，S1中，所述苹果自噬相关基因的克隆具体过程为：以拟南芥AtATG5蛋白序列为依据，与蔷薇科基因组数据库的苹果基因组数据进行查找比对，找到与其同源性最高的一条基因序列，编号为MD15G1436000，根据预测序列设计引物，以‘金冠’cDNA为模板克隆得到了一条苹果ATG5序列，命名为MdATG5a，GenBank登录号为KY305671.1。

进一步的，S1中，所述苹果组培苗为″嘎啦-3″品种组培苗。

进一步的，S3中，农杆菌介导的苹果转化过程中所用各培养基配方分别为：

农杆菌重悬液培养基：0.443％MS粉+2％蔗糖+20mM柠檬酸钠+0.1mM乙酰丁香酮+1mM甜菜碱，pH 5.3；

共培养培养基：0.443％MS粉+3％蔗糖+0.8％琼脂+2.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA；

延迟筛选培养基：0.443％MS粉+3％蔗糖+0.8％琼脂+2.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+250mg/L头孢；

筛选培养基：0.443％MS粉+3％蔗糖+0.8％琼脂+2.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+250mg/L Cef+25mg/L卡那霉素；

继代筛选培养基：0.443％MS粉+3％蔗糖+0.8％琼脂+0.3mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+25mg/L卡那霉素。

本发明还提供了上述的苹果自噬抗旱基因在提高植物自噬活性上的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明克隆的苹果自噬抗旱基因MdATG5a定位于细胞核和细胞质，能够促进干旱胁迫下自噬体的积累，响应多种逆境胁迫，在提升植株抗逆能力的基因工程育种方面有重要的参考价值；

2、本发明利用农杆菌介导法转基因技术得到的苹果自噬抗旱基因MdATG5a过表达的转基因苹果植株抗旱性增强，在苹果抗旱分子定向育种方面有重要的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的技术路线图；

图2为本发明苹果自噬相关基因MdATG5a的保守结构域；

图3为本发明苹果不同组织和多种逆境处理下苹果自噬抗旱基因MdATG5a的表达分析；

其中，图3(A)为苹果自噬相关基因MdATG5a在苹果不同组织中的相对表达量；

图3(B1)为苹果自噬相关基因MdATG5a在不同干旱处理时间下的相对表达量；图3(B2)为用200mM NaCl处理不同时间下的MdATG5a相对表达量；图3(B3)为45℃处理不同时间的MdATG5a相对表达量；图3(B4)为用50mmol甲基紫精(MV)处理不同时间的MdATG5a相对表达量；

图4为本发明克隆的MdATG5a过量表达转基因苹果的鉴定；

其中，图4(A)为本发明获得的两个过量表达MdATG5a的转基因苹果株系的DNA电泳图；

图4(B)为转基因苹果株系MdATG5a的相对野生型的表达量；

图5为本发明在苹果植株中过表达MdATG5a对植株抗旱能力的影响；

其中，图5(A)为干旱处理前野生型与转基因植株的外观状态；

图5(B)为干旱处理4天后的野生型与转基因植株萎蔫程度比较；

图5(C)为干旱处理6天后的野生型与转基因植株萎蔫程度比较；

图6为本发明在干旱胁迫下苹果植株中过表达MdATG5a对叶片相对电导率、丙二醛含量、相对含水量、叶绿素含量的影响；

其中，图6(A)、图6(B)、图6(C)和图6(D)分别表示表示干旱处理后转基因植株和野生型的相对电导率、丙二醛含量、相对含水量和叶绿素含量的比较；

图7为本发明在干旱胁迫下苹果植株中过表达MdATG5a对植株叶片光合系统的影响；

图7(A)表示过表达MdATG5a转基因苹果植株与野生型光合速率比较；

图7(B1)表示过表达MdATG5a转基因苹果植株与野生型实际光化学量子产量Y(Ⅱ)比较；

图7(B2)表示过表达MdATG5a转基因苹果植株与野生型最大光化学量子产量Fv/Fm比较；

图7(B3)表示过表达MdATG5a转基因苹果植株与野生型相对电子传递速率ETR(Ⅱ)比较；

图7(B4)表示过表达MdATG5a转基因苹果植株与野生型光化学猝灭qP比较；

图8为本发明在干旱胁迫下苹果植株中过表达MdATG5a对植株活性氧积累的影响；

图8(A)表示干旱胁迫下MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株叶片活性氧组织化学染色比较；

图8(B1)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株超氧阴离子含量比较；

图8(B2)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株过氧化氢含量比较；

图8(B3)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株SOD活性比较；

图8(B4)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株POD活性比较；

图9为本发明在干旱胁迫下苹果植株中过表达MdATG5a对植株AsA-GSH系统活性的影响；

图9(1)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株中还原型抗坏血酸(AsA)含量比较；

图9(2)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株中DHA含量比较；

图9(3)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株中总抗坏血酸含量(AsA+DHA)比较；

图9(4)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株中AsA占总抗坏血酸含量的比例的变化；

图9(5)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株中还原型谷胱甘肽GSH的含量比较；

图9(6)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量比较；

图9(7)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株中总谷胱甘肽含量(GSH+GSSG)比较；

图9(8)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株中还原型谷胱甘肽GSH占总含量(GSH+GSSG)比值的变化；

图10为本发明在干旱胁迫下苹果植株中过表达MdATG5a对植株叶片糖含量的影响；

图10(1)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株中蔗糖含量；

图10(2)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株中山梨醇含量；

图10(3)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株中葡萄糖含量；

图10(4)表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株中果糖含量；

图11为本发明在干旱胁迫下苹果植株中过表达MdATG5a对植株叶片氨基酸代谢的影响；

图11(1)-图11(16)分别表示MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株中甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺的含量变化；

图12为本发明在干旱胁迫下苹果植株中过表达MdATG5a对植株叶片自噬活性的影响；

其中，图12(A)表示干旱胁迫下MdATG5a过表达转基因苹果植株在透射电镜下自噬体的形态与数量变化；

图12(B)表示干旱胁迫下MdATG5a过表达转基因苹果植株体内自噬活性变化。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明提供一种参与抗旱的苹果自噬相关基因，所述基因为MdATG5a基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述苹果自噬相关基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了上述苹果自噬相关基因在构建强抗旱的转基因植株中的应用。

具体实施例如下：

实施例1

参与抗旱的苹果自噬相关基因的克隆，

以拟南芥AtATG5(AT5G17290)蛋白序列为依据，与蔷薇科基因组数据库(GDR，https://www.rosaceae.org/)的苹果基因组数据(GDDH13，v1.1版本)进行查找比对，找到与其同源性最高的一条基因序列，编号为MD15G1436000，根据预测序列设计引物，以‘金冠’cDNA为模板克隆得到了一条苹果ATG5序列，命名为MdATG5a，GenBank登录号为KY305671.1，该基因的完整开放阅读框为1101bp，编码366个氨基酸，预测的蛋白分子量为41.16kDa，等电点为4.72，保守域分析表明克隆的MdATG5a具有自噬蛋白APG5保守结构域(图2)。

实施例2

参与抗旱的苹果自噬相关基因MdATG5a在不同组织及多种逆境处理下的表达模式分析，

取″富平楸子″苹果根、茎、叶样品，提取RNA并反转录，用于组织特异性表达分析，挑取生长一致的一年生″平邑甜茶″实生苗，对其分别进行干旱、高盐、45℃高温胁迫以及甲基紫精(MV)处理，处理过程中于不同的时间点取样，提取RNA，设计特异性定量引物，通过荧光定量PCR方法检测在不同逆境处理下MdATG5a的表达，MdATG5a定量引物序列为：

qMdATG5a-F，GCAGGTCGTG TTCCAGTTC，如SEQ ID NO.3所示；

qMdATG5a-R，CCTCCTCCTCCTTGTATCTCAA，如SEQ ID NO.4所示；

实验结果显示，MdATG5a在叶中表达量最高，根次之，在茎中表达量最低，见图3(A)；干旱和高盐处理后，MdATG5a表达显著上调，最大表达倍数分别为未处理前表达量的5.77和2.33倍，45℃处理下，MdATG5a表达量缓步上升，至处理第12h时到达峰值，为0h表达量的4.3倍，MV处理第12h时，MdATG5a转录表达水平升至最高值，为0h表达量的6.07倍，而后缓慢下降，见图3(B)；这表明，MdATG5a基因能够响应干旱、高盐、高温、氧化胁迫等多种非生物逆境。

实施例3

参与抗旱的苹果自噬相关基因MdATG5a过量表达转基因苹果植株的获得，包括如下步骤：

(1)植物表达载体的构建

遗传转化所用载体为pCambia2300，该载体具有CaMV 35S启动子，在植物中呈现卡那霉素抗性，通过载体上XbaI和KpnI两个酶切位点将MdATG5a的编码区连接至pCambia2300载体上。具体载体构建步骤详见王平博士论文(2015)。

(2)农杆菌介导的苹果转化

将构建成功的植物过表达载体通过电击法转入EHA105农杆菌菌株，PCR检测为阳性的农杆菌单菌落用于后续苹果叶片转化实验，具体步骤详见孙逊博士论文(2018)；

转化方法具体如下：

重悬活化农杆菌，并稀释OD₆₀₀至0.5-0.6待用，取正常生长30天的″嘎啦-3″组培苗的健康深绿叶片，置于制备好的农杆菌重悬液中划伤，浸润8min，而后于无菌滤纸上吸干菌液，将叶片叶背面朝上放置于共培养培养基黑暗培养3天，随后，用无菌头孢水冲洗叶片3次，每次10min，吸干水分转入延迟培养基培养2天后，将叶片转移至卡那霉素筛选培养基上黑暗培养3周，待出现抗性芽后见光培养，30-40天后移入含有卡那霉素的继代培养基中继续筛选培养3个月，所用重悬液与培养基配方如下：

农杆菌重悬液培养基：质量分数为0.443％的MS粉+质量分数为2％的蔗糖+20mM柠檬酸钠+0.1mM乙酰丁香酮+1mM甜菜碱，pH 5.3，

共培养培养基：质量分数为0.443％的MS粉+质量分数为3％的蔗糖+0.8％琼脂+2.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA

延迟筛选培养基：质量分数为0.443％的MS粉+质量分数为3％的蔗糖+质量分数为0.8％的琼脂+2.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+250mg/L头孢

筛选培养基：质量分数为0.443％的MS粉+质量分数为3％的蔗糖+质量分数为0.8％的琼脂+2.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+250mg/L Cef+25mg/L卡那霉素

继代筛选培养基：质量分数为0.443％的MS粉+质量分数为3％的蔗糖+质量分数为0.8％的琼脂+0.3mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+25mg/L卡那霉素；

(3)MdATG5a过量表达转基因苹果植株的鉴定

经卡那霉素筛选3个月后，对抗性芽取样，在DNA与RNA水平对其进行鉴定，本发明中，我们获得了两个过量表达MdATG5a的转基因苹果株系：OE5和OE8；

实验结果显示MdATG5a在OE5与OE8中表达量分别为野生型的133.5倍和19.8倍(图4)。

实施例4

MdATG5a过表达转基因苹果植株的抗旱性鉴定与机理分析，

(1)对MdATG5a过表达转基因苹果植株进行自然干旱处理

将转基因植株与野生型″嘎啦-3″组培苗生根，30天后移栽至8×8cm黑色塑料钵中，置于植物培养室生长一个月。待植株生长状况稳定后，将其转移至盛有森林土/沙/有机基质混合物(5：1：1，v：v：v)的塑料花盆(30×26×22cm)，并置于于中国陕西杨凌西北农林科技大学园艺场(34°20′N,108°24′E)的半开放温室培养，水分供应正常，并每周浇灌1/2浓度的Hoagland营养液(pH 6.0)。植株正常培养三个月后，选取健康一致的植株随机分成两组，一组正常浇水以保持饱和的土壤含水量，另一组不浇水进行干旱处理。控水处理6天后，将每组处理植株从茎基部数第九至第十二片叶采样，液氮速冻后冻存于-80℃。

(2)MdATG5a过表达转基因苹果植株抗旱性表型分析

如图5(A)，处理前转基因植株与野生型并无差异，干旱处理进行至6天时，转基因植株萎蔫程度明显轻于野生型且大多数叶子仍保持活力(图5(C))，与表型相一致，干旱处理后转基因植株的相对电导率、丙二醛含量显著低于野生型(图6)，与此同时，转基因植株在干旱6天时的叶片相对含水量与叶绿素含量显著高于野生型(图6)，以上数据表明，过表达MdATG5a可减轻植株受干旱胁迫伤害的程度，提高植株抗旱性，在抗旱分子定向育种上有应用价值。

(3)干旱胁迫下，过表达MdATG5a对苹果植株光合系统的影响

干旱胁迫下，观察到MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型光合能力存在差异：

干旱胁迫后，虽然转基因植株与野生型净光合速率均显著下降，但是转基因植株光合速率始终高于野生型(图7)，叶绿素荧光能够反映光系统Ⅱ通过叶绿素吸收能量与受过度光线所损坏的程度，能够指示光化学反应效率，光系统Ⅱ最大光化学量子产量Fv/Fm、实际光化学量子产量Y(Ⅱ)、相对电子传递速率ETR(Ⅱ)以及光化学猝灭qP的变化趋势一致，在干旱处理后数值均降低，但是在转基因植株中其数值下降程度显著低于野生型(图7(B))，干旱胁迫会损坏光系统Ⅱ从而降低植物光化学反应效率，但是MdATG5a过表达则有效缓解了干旱胁迫对植物光系统Ⅱ的伤害，以上数据表明，过表达MdATG5a有利于干旱胁迫下植株维持较高的光合能力，在实际生产上具有应用价值。

(4)干旱胁迫下，过表达MdATG5a对苹果植株活性氧清除能力的影响，

干旱胁迫下，观察到MdATG5a过表达转基因苹果植株与野生型植株在活性氧积累方面存在差异，干旱胁迫会打破植物体内活性氧产生与清除的平衡，导致其过度累积，从而对植物造成氧化伤害，本发明中，组织化学染色结果与ROS定量检测结果一致，都表明转基因植株在干旱胁迫下积累的活性氧少于野生型，因此其所受氧化胁迫更轻，抗旱能力也更强，与此同时，干旱条件下转基因植株中SOD、POD这两种重要的抗氧化酶的活性显著高于野生型，有利于活性氧的清除(图8)，除了以上的酶促保护机制，还有抗坏血酸和谷胱甘肽等抗氧化剂可作用于清除活性氧的非酶促保护机制，细胞内抗坏血酸与谷胱甘肽氧化还原状态的转换，在参与植物对抗干旱等非生物胁迫时起着重要作用，本发明中，干旱胁迫下转基因植株中总抗坏血酸含量(AsA+DHA)增幅大于野生型，且还原型抗坏血酸AsA所占总含量的比例显著增加，表明其抗氧化能力更强，总谷胱甘肽含量(GSH+GSSG)与还原型谷胱甘肽GSH占总含量比值的变化也具有类似趋势(图9)，这些数据表明，过表达MdATG5a通过改善抗氧化酶活性与AsA-GSH循环促进苹果植株在干旱胁迫下活性氧的清除。

(5)干旱胁迫下，过表达MdATG5a对苹果植株叶片糖与氨基酸代谢的影响，

当植物遭受干旱胁迫后，可溶性糖、氨基酸、甜菜碱等渗透性调节物质会大量积累帮助植物对抗逆境，本发明中，我们检测了过表达MdATG5a是否影响干旱胁迫下糖与氨基酸代谢，取正常条件与干旱胁迫下，转基因与野生型植株叶片磨样，然后分别通过GC-MS和LC-MS系统检测可溶性糖与氨基酸含量变化，具体方法参照霍柳青博士论文(2020)。

结果表明，转基因与野生型植株中可溶性糖和检测的大多数氨基酸含量在干旱处理下显著增加，但是转基因植株中糖与氨基酸代谢的变化幅度更大，更有利于干旱条件下植株的渗透调节，从而导致其抗旱能力更强(图10,11)，以上数据说明过表达MdATG5a能够通过调节糖与氨基酸代谢提高植株耐旱性，为抗旱分子定向育种提供了理论依据。

实施例5

干旱胁迫下MdATG5a过表达转基因苹果植株自噬活性分析，

自噬是真核生物响应逆境并在不良环境中得以生存的关键机制，自噬能够被多种生物与非生物胁迫诱导，作用于氧化受损蛋白或细胞器，并将降解产物循环利用，维持细胞稳态，透射电镜检测法(TEM)是有效且便捷的检测自噬活性的方法，对苹果植株干旱处理6天时，采集同等叶位成熟叶片，将其切成3mm×3mm块状，于2.5％戊二醛溶液中固定，随后置于4℃，黑暗处理12h，随后，用PBS缓冲液洗涤后，室温下于1％(v/v)四氧化锇固定2.5h后，梯度乙醇脱水并包埋，使用超薄切片机切取超薄切片(70nm)并放置于Formvar上，而后使用透射电子显微镜(JEOL-1230；Hitachi,Tokyo,Japan)观察自噬体形态与数量；

观察结果显示：干旱胁迫能够诱导自噬发生，转基因植株的两个株系经干旱处理后自噬体数量约为野生型的2.4倍(图12A,B)，以上结果表明MdATG5a过表达可大幅度提高干旱胁迫下植株体内自噬活性，帮助植株对抗逆境，可为作物抗逆育种工作提供理论依据。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种参与抗旱的苹果自噬相关基因及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1101

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggatatgg aagcacagag gtttgtatgg ggcggagcaa ttcctctgca gattcatctc 60

catgaatccg acgtcgccac tcttcctgct cccccacctg ccctgatctt agctcctcgg 120

attgggtatc tgccattgtt ggcctcgctt ctaaaacctc acttcagctc tgcacttcct 180

cctcgcttag acaccatttg gttcgagtac aaaggcttgc ccttgaaatg gtatataccg 240

acaggagttc tgtttgatct tctatgtgca gagccagaaa gaccttggaa tctcacggtg 300

cattttacag gatatccggg gaacatattg attccttgtg atggtgaaga tagtgtaaag 360

tggagcttta tcaattcttt gaaagaggct gcatatataa taaatggaaa ctgtaagaat 420

gtgatgaaca tgtctcagcc agatcaggtg gagctttggc gttcggtctt aaatggtaat 480

ttggaagcct acttccgggt atcttctaaa cttaagcttg gaacagttgg ggaagactgg 540

gcagcaaaga attcatgctc tccaaaatcc agaccaaata tgggcgaaac tgatgtttct 600

ggacaagtga aggcaggtcg tgttccagtt cgtttatatg tttggagtgt cagtgaggat 660

tttgatgatt tagaagatgc acctcagatt gatagttggg acaaagtctc ttacattaac 720

cggcctgttg agatacaagg aggaggaggt agatgcttca ctctaaatga tgcaatcaag 780

agccttttgc cagagtattt tcctgacaaa tccatgatcc ctgaagaatc accaacagta 840

ggtgaggagg atgaacaaaa ggtttcctct gaagatgcaa tcaagagcga tataggagcc 900

gaagaggaag tagaaaagtc aatcgaacgc acaaagtctt gcaaccaata cgatgatgct 960

gaaatcaaac tagtccgtat ccaaggtatt gagccgaaat tggagatacc tttcttttgg 1020

gtggcaaata acttactgaa ccccgagcac tttcttcata tctgtgtgta tttgaaagta 1080

ccacaaatca ataacatgtg a 1101

<210> 2

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Asp Met Glu Ala Gln Arg Phe Val Trp Gly Gly Ala Ile Pro Leu

1 5 10 15

Gln Ile His Leu His Glu Ser Asp Val Ala Thr Leu Pro Ala Pro Pro

20 25 30

Pro Ala Leu Ile Leu Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Leu Pro Leu Leu Ala

35 40 45

Ser Leu Leu Lys Pro His Phe Ser Ser Ala Leu Pro Pro Arg Leu Asp

50 55 60

Thr Ile Trp Phe Glu Tyr Lys Gly Leu Pro Leu Lys Trp Tyr Ile Pro

65 70 75 80

Thr Gly Val Leu Phe Asp Leu Leu Cys Ala Glu Pro Glu Arg Pro Trp

85 90 95

Asn Leu Thr Val His Phe Thr Gly Tyr Pro Gly Asn Ile Leu Ile Pro

100 105 110

Cys Asp Gly Glu Asp Ser Val Lys Trp Ser Phe Ile Asn Ser Leu Lys

115 120 125

Glu Ala Ala Tyr Ile Ile Asn Gly Asn Cys Lys Asn Val Met Asn Met

130 135 140

Ser Gln Pro Asp Gln Val Glu Leu Trp Arg Ser Val Leu Asn Gly Asn

145 150 155 160

Leu Glu Ala Tyr Phe Arg Val Ser Ser Lys Leu Lys Leu Gly Thr Val

165 170 175

Gly Glu Asp Trp Ala Ala Lys Asn Ser Cys Ser Pro Lys Ser Arg Pro

180 185 190

Asn Met Gly Glu Thr Asp Val Ser Gly Gln Val Lys Ala Gly Arg Val

195 200 205

Pro Val Arg Leu Tyr Val Trp Ser Val Ser Glu Asp Phe Asp Asp Leu

210 215 220

Glu Asp Ala Pro Gln Ile Asp Ser Trp Asp Lys Val Ser Tyr Ile Asn

225 230 235 240

Arg Pro Val Glu Ile Gln Gly Gly Gly Gly Arg Cys Phe Thr Leu Asn

245 250 255

Asp Ala Ile Lys Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Phe Pro Asp Lys Ser Met

260 265 270

Ile Pro Glu Glu Ser Pro Thr Val Gly Glu Glu Asp Glu Gln Lys Val

275 280 285

Ser Ser Glu Asp Ala Ile Lys Ser Asp Ile Gly Ala Glu Glu Glu Val

290 295 300

Glu Lys Ser Ile Glu Arg Thr Lys Ser Cys Asn Gln Tyr Asp Asp Ala

305 310 315 320

Glu Ile Lys Leu Val Arg Ile Gln Gly Ile Glu Pro Lys Leu Glu Ile

325 330 335

Pro Phe Phe Trp Val Ala Asn Asn Leu Leu Asn Pro Glu His Phe Leu

340 345 350

His Ile Cys Val Tyr Leu Lys Val Pro Gln Ile Asn Asn Met

355 360 365

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcaggtcgtg ttccagttc 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctcctcctc cttgtatctc aa 22

Claims (9)

1.一种参与抗旱的苹果自噬相关基因，其特征在于，所述基因为MdATG5a基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的参与抗旱的苹果自噬相关基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的参与抗旱的苹果自噬相关基因在构建强抗旱的转基因植株中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植株为苹果植株。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，参与抗旱的苹果自噬相关基因构建强抗旱的转基因植株的方法包括以下步骤：

S1，苹果自噬相关基因的克隆；

S2，植物表达载体的构建

通过XbaI和KpnI两个酶切位点将MdATG5a基因的编码区连接至pCambia2300载体上；

S3，农杆菌介导的苹果转化

S3.1，将构建成功的植物过表达载体转入EHA105农杆菌菌株，选择PCR检测为阳性的农杆菌，备用；

S3.2，将S3.1中获得的PCR检测为阳性的农杆菌重悬活化，并稀释OD₆₀₀至0.5-0.6，获得农杆菌重悬液；

S3.3，取正常生长28-30天的苹果组培苗的叶片，置于农杆菌重悬液中划伤，浸润8-12分钟，然后置于无菌滤纸上吸干菌液，将叶片于共培养培养基黑暗培养3天；

S3.4，冲洗叶片，吸干水分转入延迟培养基培养2天后，将叶片转移至卡那霉素筛选培养基上黑暗培养3-4周，待出现抗性芽后见光培养，30-40天后移入含有卡那霉素的继代培养基中继续筛选培养3-4个月；

S4，MdATG5a基因过量表达转基因植株的鉴定，

对S3经卡那霉素筛选后的植株，对其抗性芽取样，在DNA与RNA水平对其进行鉴定。

6.如权利要求5所述的构建强抗旱的转基因植株的方法，其特征在于，S1中，所述苹果自噬相关基因的克隆具体过程为：以拟南芥AtATG5蛋白序列为依据，与蔷薇科基因组数据库的苹果基因组数据进行查找比对，找到与其同源性最高的一条基因序列，编号为MD15G1436000，根据预测序列设计引物，以‘金冠’cDNA为模板克隆得到了一条苹果ATG5序列，命名为MdATG5a，GenBank登录号为KY305671.1。

7.如权利要求5所述的构建强抗旱的转基因植株的方法，其特征在于，S1中，所述苹果组培苗为″嘎啦-3”品种组培苗。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，S3中，农杆菌介导的苹果转化过程中所用各培养基配方分别为：

农杆菌重悬液培养基：0.443％MS粉+2％蔗糖+20mM柠檬酸钠+0.1mM乙酰丁香酮+1mM甜菜碱，pH 5.3；

共培养培养基：0.443％MS粉+3％蔗糖+0.8％琼脂+2.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA；

延迟筛选培养基：0.443％MS粉+3％蔗糖+0.8％琼脂+2.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+250mg/L头孢；

筛选培养基：0.443％MS粉+3％蔗糖+0.8％琼脂+2.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+250mg/LCef+25mg/L卡那霉素；

继代筛选培养基：0.443％MS粉+3％蔗糖+0.8％琼脂+0.3mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+25mg/L卡那霉素。

9.如权利要求1所述的参与抗旱的苹果自噬相关基因在提高植物自噬活性上的应用。

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