CN108948165A

CN108948165A - 一种苹果中抗性相关基因MdERF014的克隆及其应用

Info

Publication number: CN108948165A
Application number: CN201810877784.4A
Authority: CN
Inventors: 郝玉金; 李媛媛; 齐晨辉
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2018-08-03
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2038-08-03
Also published as: CN108948165B

Abstract

本发明涉及一种苹果中抗性相关MdERF014基因的克隆及其应用，所述MdERF014基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其含有AP2保守结构域，开放阅读框(ORF)为720bp。利用强启动子驱动原理的转基因技术，将MdERF014基因的超量表达载体转入苹果愈伤组织中，发现在愈伤组织中过表达MdERF014能够增强‘王林’愈伤组织的耐盐性，降低对ABA的敏感性。本发明首次通过植物基因工程技术，获得了从苹果中分离克隆出了抗性相关基因MdERF014完整编码区段的DNA片段，对苹果的育种和砧木的选育具有重要意义。

Description

一种苹果中抗性相关基因MdERF014的克隆及其应用

技术领域

本发明涉及一种苹果中抗性相关基因MdERF014的克隆及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

APETALA 2/ethylene-responsive element binding factor(AP2/ERF)是植物中一个特别的转录因子家族(Zhuang等2011；Zhang等2008)。一般这个家族含有AP2/ERF保守结构域(Okamuro等1997)，基于序列同源性和AP2保守结构域分为5个亚家族，分别为AP2、RAV、DREB、ERF和其他一些基因(Sakuma等2002)。AP2/ERF在植物的生长发育及胁迫反应中起着重要作用，例如花器官的发育、叶表皮细胞的调控、响应各种生物及非生物胁迫等(Zhang等2013；Sears等2014；Upadhyay等2013；Chen等2015；Park等2016)。

近年来ERF家族在不同物种中的功能已经被广泛报道。例如：在拟南芥中，AtERF73/HRE1被氨基环丙烷羧酸及低氧所诱导，并且在氧气不足时，AtERF73/HRE1能够负调控乙烯响应(Yang等2011)。在拟南芥中，ERF6在抑制叶片生长及诱导胁迫响应基因中作为一个中心催化剂，并且能够诱导EFRF11的表达，而ERF11能反过来中和ERF6的作用，ERF6过表达造成的植株矮化能够被ERF11过表达所抑制，所以ERF6和ERF11共同作用维持植物生长和抵御胁迫之间的平衡(Dubois等2015)。在小麦中，ERF3能够被盐和干旱所诱导，过表达ERF3可提高胁迫相关基因的表达，显著增强植物对盐和干旱的抗性(Rong等2014)。在大豆中，ERF5能够被乙烯、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、大豆疫霉菌所诱导，并且能够增强对大豆疫霉菌的抗性，参与病原菌的抵抗过程(Dong等2015)。在野生大豆中，ERF71能够通过上调H+-ATP酶及改变植物生长素的积累增强植物对碱性胁迫的抗性(Yu等2017)。在四翅滨藜中，ERF2能够减少活性氧和丙二醛的积累，增加抗氧化酶的活性，在渗透胁迫时快速关闭气孔，并且过表达ERF2能够在种子萌发时对ABA高度敏感，增强植物对病原菌的抗性(Sun等2018)。这些结果表明，ERF转录因子在植物的生长发育及抵御生物和非生物胁迫中起重要作用。

苹果是重要的经济作物之一，在苹果中ERF是如何发挥功能的也被报道了很多。比如：MdERF2的表达量在果树成熟中被乙烯所抑制，并且能够通过减少MdERF3启动子的活性，直接抑制MdACS1的表达而负调控乙烯合成(Li等2016)。MdERF3是乙烯的正调控因子，MdMYC2能绑定到MdERF3启动子上负调控对铝的耐受性(An等2017)。在常绿苹果中过表达ERF17能够改变叶绿素积累，促进叶绿素降解相关基因的表达，改变苹果的颜色，这对苹果品质的改良提供了一个很好的理论基础(Han等2018)。在本研究中，我们发现了一个新的苹果ERF家族成员MdERF014，其含有AP2保守结构域，能够响应ABA及NaCl，过表达MdERF014基因的愈伤组织不受ABA及盐抑制，这对苹果抗逆优良品种的选育具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克隆出一种苹果中抗性相关基因MdERF014，并验证了其功能。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，公开了一种苹果中抗性相关基因MdERF014及其应用，其完整编码区段的DNA片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其所编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本发明公开了一种苹果MdERF014基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)提取‘Gala’苹果组培叶片中的RNA及反转录；

(2)cDNA全长序列的获得：设计兼并引物MdERF014-F,MdERF014-R，然后以反转录合成的嘎啦基因组cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列；其中，

MdERF014-F序列如SEQ.ID.NO.3所示，

MdERF014-R序列如SEQ.ID.NO.4所示；

(3)PCR产物进行回收、载体连接、转化、测序，得到MdERF014基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)为720bp，编码239个氨基酸。

本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案是，一种苹果MdERF014基因在转基因愈伤组织中的应用，利用强启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)驱动原理的转基因技术，将MdERF014基因的超量表达载体转入苹果愈伤组织中，从而获得转基因材料。实验证明，超量表达MdERF014基因的转基因‘王林’愈伤组织，其耐盐性提高，对ABA的敏感性降低，说明MdERF014基因在植株抗性中发挥重要作用。

综上，本发明通过植物基因工程技术，从嘎啦苹果组培苗中分离克隆出抗性相关基因完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，发现采用超量表达之后转基因材料抗盐能力明显提高。

附图说明

附图1为PCR扩增产物电泳图谱。

附图2为qRT-PCR检测MdERF014转基因愈伤组织的表达，其中control为对照，MdERF014-OE-1、MdERF014-OE-2、MdERF014-OE-3为3个过表达转基因株系。

附图3为转入空载体的愈伤(vector)、3个转基因愈伤组织细胞系(L1、L2、L3)在ABA处理下生长21天的状态。

附图4为转入空载体的愈伤(Empty vector)和过表达转基因愈伤3个株系(MdERF014-OE-1、MdERF014-OE-2、MdERF014-OE-3)在ABA处理下生长21天的鲜重。

附图5为转入空载体的愈伤(Empty vector)和过表达转基因愈伤3个株系(MdERF014-OE-1、MdERF014-OE-2、MdERF014-OE-3)在ABA处理下生长21天的丙二醛含量。

附图6为转入空载体的愈伤(vector)、3个转基因愈伤组织细胞系(L1、L2、L3)在NaCl处理下生长21天的状态。

附图7为转入空载体的愈伤(Empty vector)和过表达转基因愈伤3个株系(MdERF014-OE-1、MdERF014-OE-2、MdERF014-OE-3)在NaCl处理下生长21天的鲜重。

附图8为转入空载体的愈伤(Empty vector)和过表达转基因愈伤3个株系(MdERF014-OE-1、MdERF014-OE-2、MdERF014-OE-3)在NaCl处理下生长21天的丙二醛含量。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步加以说明。

实施例1：苹果MdERF014基因的克隆

(一)嘎啦组培叶片RNA提取及反转录

1、利用CTAB法提取总RNA

(1)将生根的‘皇家嘎啦’组培苗叶片取样后，液氮冷冻。

(2)取1.5g上述处理后的材料，放入预冷的研钵，加液氮磨碎，转入预冷的50ml离心管中；

(3)迅速加入10ml预热到65℃的提取缓冲液(其中PVP和巯基乙醇现用现加)，轻轻混匀，65℃水浴中0.5h，其中提取缓冲液组成见表1:

表1-提取缓冲液组成

(4)加入与上述步骤(2)离心管中液体等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振荡0.5h，4℃，12,000rpm离心20min，将上清液转移到新的50ml离心管中；

(5)加入1/3上清液体积的10mol·L^-1预冷LiCl，-20℃放置3h，12,000rpm离心30min，弃上清液；

(6)加入500μl SSTE缓冲液充分悬浮沉淀后，平均分装到2支1.5ml离心管中，其中SSTE缓冲液组成见表2：

表2-SSTE缓冲液

(7)分别加入与悬浮液等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振荡10min，4℃、12,000rpm离心10min，将上清液转移到新的1.5ml离心管；

(8)分别加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合物，冰浴振荡10min，4℃、12,000rpm离心10min，将上清液转移到新的1.5ml离心管；

(9)加入2.5倍上清液体积的预冷无水乙醇，-20℃放置1-2h；

(10)于4℃、12,000rpm离心20min，70％乙醇洗2次；

(11)于4℃、14,000rpm离心10min，超净台上风干沉淀；加入20μl DEPC水溶解RNA。

(12)置于-80℃储藏，备用,或立即进行以下反转录实验。

2、反转录cDNA第一链的合成

(1)在0.2ml的微量离心管中配制表3混合液(其中表3中RNA为步骤1提取获得的；如果用的是-80℃储藏RNA，必须让其在冰上缓慢融解)：

表3-混合液

(2)用枪头轻轻混匀，将微量离心管放在PCR仪上(65℃，5min)进行变性、退火反应，然后冰上急冷；

(3)在上述微量离心管中继续配制表4反转录反应液。

表4-反转录反应液

(4)在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：30℃10min，42℃60min，70℃15min，4℃保存。合成的反转录产物cDNA，用于进行后面的相关实验。

3、cDNA末端加尾

利用TdT末端转移酶，步骤2中反转录合成的cDNA 3’末端加上Poly(C)尾巴，以此为模板进行5’RACE扩增。具体步骤如下：

在1.5ml离心管中依次加入表5的PCR反应试剂，终体积为50μl。

表5-PCR反应试剂

(1)37℃反应30min；

(2)加入50μl(等体积)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，充分混匀；离心，取上层(水层)至另一新的1.5ml离心管中；

(3)加入50μl(等体积)的氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀；离心，取上层(水层)至另一新的1.5ml离心管中；

(4)加入5μl(1/10体积)3M NaAC(pH 5.2)，再加入125μl(2.5倍体积)预冷的无水乙醇，-20℃放置30-60min；

(5)4℃、12,000rpm离心15min，70％乙醇洗2次；

(6)4℃、12,000rpm离心10min，超净台上风干沉淀；用20μl无菌水溶解DNA，4℃保存。获得的加尾cDNA作为模板用于后面的5′RACE扩增。

(二)cDNA全长序列的获得

设计兼并引物MdERF014-F，MdERF014-R，以反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增。

MdERF014-F：5’-ATGGTGAAGACAGATCAGAGGA-3’，其序列如SEQ.ID.NO.3所示；

MdERF014-R：5’-TCAGCAGAAGCTCCACAAGCGA-3’，其序列如SEQ.ID.NO.4所示；

其中，PCR扩增体系见表6。

表6-PCR扩增体系

PCR反应程序：94℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，33次循环；72℃延伸10min。

PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳图谱如附图1所示，回收目的条带(回收根据Takara公司“Agarose Gel DNAPurification Kit”操作)，连接到pMD18-T克隆载体进行测序(操作步骤按pMD18-T Vector说明书进行)，转化(连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，在表面涂有IPTG/X-Gal的LB平板培养基上，37℃倒置培养12-20h；挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜)、序列测定(将摇好的菌液取1ml放到1.5ml离心管中，密封，在北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定后，得到MdERF014基因序列，开放阅读框(open reading frame,ORF)为720bp，编码239个氨基酸，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。测序正确的单克隆，应用天根质粒提取试剂盒提取PMD18-T-MdERF014的质粒DNA(操作步骤按照天根质粒小提试剂盒说明书进行)，提取的质粒置于-20℃保存，用于后续功能验证实验。

实施例2：MdERF014基因表达载体的构建

为研究MdERF014基因的功能，将包含有MdERF014基因编码区在内的共720bp片段正确插入表达载体pRI 101-AN上。

根据用于扩基因MdERF014的上下游引物，设计上下游引物分别加上酶切位点SmaI和EcoRI后，以PMD18-T-MdERF014质粒为模板进行扩增，回收目的条带后连接PMD18-T转化大肠杆菌DH5α，筛菌后进行测序。测序正确后，用SmaI和EcoRI酶切，连接到pRI 101-AN载体上，构成MdERF014-OE表达载体。将MdERF014-OE表达载体及pRI 101-AN空载体(Emptyvector)分别转入到农杆菌GV3101，备用。

实施例3：MdERF014过量表达苹果愈伤组织的获得

将准备侵染的野生型‘王林’苹果愈伤组织，隔7-9天周期继代，为乳白色或蛋黄色小颗粒为宜。取生长状态良好的苹果愈伤组织，置于农杆菌中浸泡10min，用灭菌的滤纸吸净农杆菌菌液，接种到无抗生素的培养基(MS+6-BA 0.4mg l^-1+2,4-D 1.5mg l^-1)上，暗培养2天后用灭菌水洗3-5次，洗去多余的农杆菌。用灭菌的滤纸将水吸干后，转移至加Cb(300mg l^-1),Kana(30mg l^-1)的继代培养基上，铺成薄薄的一层。继代筛选3-5次后，取抗性愈伤，提取DNA和RNA进行检测。

提取野生型和MdERF014转基因苹果愈伤组织总RNA，应用qRT-PCR检测MdERF014基因在野生型和三个转基因苹果愈伤组织中的表达量，如附图2所示，与对照相比，MdERF014的转录水平在三个转基因株系MdERF014-OE-1、MdERF014-OE-2、MdERF014-OE-3中显著升高，表明成功获得了MdERF014过量表达的转基因苹果愈伤组织。

实施例4：MdERF014转基因愈伤组织对ABA敏感性分析

将生长状态好的转入空载体的愈伤组织及转入MdERF014的3个转基因愈伤组织细胞系分别置于MS+6-BA 0.2mg·L^-1+2,4-D 1.5mg·L^-1、MS+6-BA 0.2mg·L^-1+2,4-D1.5mg·L^-1+100μmol·L^-1ABA、MS+6-BA 0.2mg·L^-1+2,4-D 1.5mg·L^-1+150μmol·L^-1ABA培养基上，并在25℃暗室进行培养。三周后观测表型，并且三个为一组检测愈伤的鲜样重量，测三组算其平均值及误差。实验结果发现，在对照培养基上，转入空载体的愈伤(vector)长势与3个转基因愈伤组织细胞系(L1、L2、L3)相似，而在100μMABA及150μMABA处理后，发现转基因愈伤组织细胞系L1、L2、L3长势相比于vector好，如附图3所示。检测其鲜重及丙二醛含量发现，ABA处理愈伤组织后，转基因愈伤组织细胞系L1、L2、L3相比于vector，鲜重明显增加，丙二醛含量明显降低，如附图4-5所示，这表明MdERF014过量表达苹果愈伤组织的生长不受ABA抑制，抗性增强。

实施例5：MdERF014转基因愈伤组织对NaCl敏感性分析

检测了盐胁迫与MdERF014的关系，如附图6所示，在对照培养基上，转入空载体的愈伤(vector)长势与3个转基因愈伤组织细胞系相似(L1、L2、L3)，而在50mM NaCl及100mMNaCl处理后，发现转基因愈伤组织细胞系L1、L2、L3长势相比于vector好。检测NaCl处理后的转基因愈伤组织的鲜重及丙二醛含量发现，相比于vector，鲜重明显增加，丙二醛含量明显降低，如附图7-8所示，表明MdERF014基因在盐胁迫过程中起到正调控的作用。

综上，从苹果中分离到了MdERF014基因，通过苹果愈伤组织中转基因功能验证分析发现，MdERF014在提高植株的抗性方面具有显著效果，提高了转基因植株的抗逆境能力，对于苹果新品种的选育具有重要意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种苹果中抗性相关MdERF014基因的克隆及其应用

<141> 2018-08-01

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggtgaaga cagatcagag gattattcag ctgccttcag agatgacatc atcgaaaacg 60

acatcgaagt ctccaccttc ttcttcttct acctcagcat gcaagaagaa gaagtttaag 120

ggagtgagga tgaggagctg gggctcttgg gttacagaga ttagagcccc aaaccaaaaa 180

acaagaatat ggttaggttc atattcgaca gctgaggctg cagcaagagc ctacgatgct 240

gccctactgt gcctcaaggg ctcttcagcc aacctcaact tccccaccac tgcctcctca 300

cattttatcc cccaggaaat gaccgtcatg tcccccaagt ccatccagag agtggctgca 360

gccgctgcca ataataatgc cgctaccacc accgcaaaca ttgcctgtcc accatcaccc 420

cctcctcaat cttcttcttc gtctttggtc tcgtctccgt ctctcgtctc gtcgccatca 480

atgtcgtcct cgccgtccat taacctcatc gatgatgaca tgtcatcgct aatggggtca 540

tttggggggt cctacactcc cacttactat gatcaagcaa atgatcaatt accaatgtct 600

agcatggatt catggaacaa ctttgaccaa atgttcggtg gcgcattgtt ggatccacag 660

ccacctatga tgtacgactt ttatgaggaa agtgacattc gcttgtggag cttctgctga 720

<210> 2

<211> 239

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Val Lys Thr Asp Gln Arg Ile Ile Gln Leu Pro Ser Glu Met Thr

1 5 10 15

Ser Ser Lys Thr Thr Ser Lys Ser Pro Pro Ser Ser Ser Ser Thr Ser

20 25 30

Ala Cys Lys Lys Lys Lys Phe Lys Gly Val Arg Met Arg Ser Trp Gly

35 40 45

Ser Trp Val Thr Glu Ile Arg Ala Pro Asn Gln Lys Thr Arg Ile Trp

50 55 60

Leu Gly Ser Tyr Ser Thr Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Ala

65 70 75 80

Ala Leu Leu Cys Leu Lys Gly Ser Ser Ala Asn Leu Asn Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Ala Ser Ser His Phe Ile Pro Gln Glu Met Thr Val Met Ser Pro

100 105 110

Lys Ser Ile Gln Arg Val Ala Ala Ala Ala Ala Asn Asn Asn Ala Ala

115 120 125

Thr Thr Thr Ala Asn Ile Ala Cys Pro Pro Ser Pro Pro Pro Gln Ser

130 135 140

Ser Ser Ser Ser Leu Val Ser Ser Pro Ser Leu Val Ser Ser Pro Ser

145 150 155 160

Met Ser Ser Ser Pro Ser Ile Asn Leu Ile Asp Asp Asp Met Ser Ser

165 170 175

Leu Met Gly Ser Phe Gly Gly Ser Tyr Thr Pro Thr Tyr Tyr Asp Gln

180 185 190

Ala Asn Asp Gln Leu Pro Met Ser Ser Met Asp Ser Trp Asn Asn Phe

195 200 205

Asp Gln Met Phe Gly Gly Ala Leu Leu Asp Pro Gln Pro Pro Met Met

210 215 220

Tyr Asp Phe Tyr Glu Glu Ser Asp Ile Arg Leu Trp Ser Phe Cys

225 230 235

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atggtgaaga cagatcagag ga 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tcagcagaag ctccacaagc ga 22

Claims

1.一种苹果中抗性相关基因MdERF014，其特征在于，所述苹果MdERF014基因的编码区序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.一种利用权利要求1所述苹果MdERF014基因编码出的氨基酸，其特征在于，所述苹果MdERF014基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.一种扩增MdERF014基因的引物对序列，其特征在于，所述引物序列如SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4所示。

4.一种苹果MdERF014基因在转基因苹果中的应用，其特征在于，能够提高苹果植株的抗性，尤其能够提高转基因苹果的盐和ABA的耐受能力。