CN114703200A

CN114703200A - 一种苹果耐旱负调控基因MdbHLH108及其应用

Info

Publication number: CN114703200A
Application number: CN202210462311.4A
Authority: CN
Inventors: 白团辉; 郑先波; 宋春晖; 王枚阁; 宋雪莲; 焦健; 王苗苗; 宋尚伟
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2022-04-26
Filing date: 2022-04-26
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2042-04-26
Also published as: CN114703200B

Abstract

本发明公开了一种苹果耐旱负调控基因MdbHLH108及其应用，所述苹果基因MdbHLH108的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明通过植物基因工程技术，从平邑甜茶实生苗中分离克隆出抗性相关基因MdbHLH108完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，发现采用超量表达之后转基因材料抗旱性降低，并且对ABA敏感性明显提高，说明基因MdbHLH108在干旱中起到负调控的作用，该负调控因子有潜力应用于基因编辑培育抗旱新品种，并且对苹果抗旱定向遗传改良和砧木选育有重要意义。

Description

一种苹果耐旱负调控基因MdbHLH108及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及苹果耐旱负调控基因MdbHLH108及其应用。

背景技术

苹果(Malus×domestica Borkh.)作为世界四大水果之一，因其独特的风味、较高的营养价值，深受消费者的喜爱。

在苹果生产栽培中普遍存在着大面积、不同程度的干旱，致使苹果叶片枯萎、脱落，苹果果实本身质量降低、产量下降，干旱严重时更是会造成苹果果树整株死亡的现象。这对我国的苹果产业造成了巨大的经济损失，并严重威胁我国苹果产业的可持续发展(Smail et al.，2017)。

大部分果树因其生长周期长，遗传背景复杂，基因组杂合度高等原因，其抵御逆境环境的机理也比模式植物复杂(马齐军，2018)。有研究表明，转录因子在植物响应逆境胁迫中发挥着重要作用(Chen et al.，2015)。bHLH(basic helix-loop-helix)是第二大转录因子家族，广泛存在于动物、植物以及真核生物中。bHLH转录因子参与植物的生长发育过程，包括参与果实开裂与开花(Zhu，2016)、生长发育迟缓(Verma et al.，2020)等；同时也在植物抗逆过程中起着重要的作用，包括低温(王孝娣等，2019；Dong et al.，2020)、盐(Kavaset al.， 2016；Liu et al.，2021)、干旱(Yang et al.，2021；Li et al.，2021)等。目前，对bHLH蛋白的研究主要集中在模式植物中，在木本果树中的研究还十分匮乏。

在本研究中，我们鉴别发现了一个新的苹果bHLH家族成员MdbHLH108，其能够响应干旱(甘露醇)及ABA，过表达基因MdbHLH108的苹果愈伤组织降低了对干旱的忍耐性并提高了对ABA的敏感性，这对苹果抗逆优良品种的选育具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苹果耐旱负调控基因MdbHLH108及其应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种苹果基因MdbHLH108，其特征在于，所述基因MdbHLH108的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。其所编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

扩增上述基因MdbHLH108的引物对，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID No.3所示，反向引物序列如SEQ ID No.4所示。

包含上述苹果基因MdbHLH108的过表达载体也落入本发明的保护范围，本发明所选用的过表达载体为农杆菌过表达载体。

上述基因或蛋白或过表达载体作为负调控因子在提高植物抗旱性和/或降低植物对ABA 敏感性中的应用。

上述植物包括苹果(包括苹果愈伤组织)，但不限于此，凡是可以利用转基因技术将基因MdbHLH108的过表达载体转入该植物中，均可以获得相同的技术效果。

所述负调控表现为：在干旱胁迫下，相对于野生型植株来讲，转基因植株的抗旱性低于野生型。通过过表达植株对甘露醇敏感性分析以及对ABA敏感性分析，得出过表达植株的耐旱性降低以及对ABA的敏感性显著提升。可以说明基因MdbHLH108在植株抗性中发挥重要作用。

本发明还公开了一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为(1)、(2)或(3)：

(1)通过增加目的植物中MdbHLH108蛋白的活性，获得抗旱性低于目的植物和/或对 ABA敏感性高于目的植物的植株；

(2)通过促进目的植物中基因MdbHLH108的表达，获得抗旱性低于目的植物和/或对 ABA敏感性高于目的植物的植株；

(3)通过抑制目的植物中的基因MdbHLH108的表达，获得抗旱性高于目的植物和/或对 ABA敏感性低于目的植物的植株。

同样，所述目的植物为苹果。

“促进目的植物中基因MdbHLH108的表达”的实现方式可为如下(1)或(2)或(3)：

(1)将基因MdbHLH108导入目的植物；

(2)引入强启动子和/或增强子；

(3)本领域内的其它常见方法。

抑制目的植物中的基因MdbHLH108的表达可以采用敲除基因MdbHLH108的方式，敲除基因MdbHLH108的方式可以采用基因编辑技术。具体地，作为本发明的一种实施方式，将多核苷酸通过常规的方法克隆到CRISRP载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述MdbHLH108蛋白到植物细胞中，使所述的植物细胞中MdbHLH108蛋白缺失。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得基因MdbHLH108缺失的突变体植物。并利用农杆菌转化法将重组质粒转入植物中。

其中，目的植物(target plant)，本发明所述目的植物是苹果。

目的基因(target gene)，也称靶标基因，在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。可以是生物体本身的，也可以是来自不同生物体的。

本发明中，对于适用于本发明的植物或目的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：苹果，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。

本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。

本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。

本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。

另外，还公开了一种苹果基因MdbHLH108的克隆方法，包括以下步骤：

(1)设计全长序列兼并性引物，引物如下所示：

MdbHLH108-F：5’-ATGTTAGCCTCGTCTCC-3’(SEQ ID No.3)，

MdbHLH108-R：5’-CTAGTCTTCAAAATTC-3’(SEQ ID No.4)，

(2)平邑甜茶叶片RNA提取及反转录；

(3)eDNA全长序列获得。

一种苹果基因MdbHLH108过量表达的方法，包括以下步骤：

(1)以ZT4-Blunt-MdbHLH108质粒为模板进行PCR扩增，再根据pCAMBIA 1301载体图谱序列设计用Nco I和Bgl II这两个作为限制性内切酶，将二者回收纯化后进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取测序验证正确的菌落质粒，构成pCAMBIA 1301-MdbHLH108过表达载体。并将pCAMBIA 1301-MdbHLH108过表达载体转入到农杆菌 GV3101中；

(2)MdbHLH108过量表达株系的获得，具体可以采用现有技术中的方法。

本发明的优点：

本发明通过植物基因工程技术，从平邑甜茶实生苗中分离克隆出抗性相关基因MdbHLH108完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，发现采用超量表达之后转基因材料抗旱降低与对ABA敏感性明显升高，说明MdbHLH108在干旱胁迫中起到负调控的作用，有利于从分子机制上阐明基因MdbHLH108在干旱胁迫响应方面的作用，并且对苹果抗旱定向遗传改良和砧木选育有重要意义。

附图说明

图1为PCR扩增产物电泳图谱。

图2为qRT-PCR检测MdbHLH108转基因愈伤组织的表达，其中WT为野生型，

MdbHLH108-OE-1、MdbHLH108-OE-2、MdbHLH108-OE-3为3个过表达转基因株系。

图3为WT和3个过表达MdbHLH108转基因愈伤组织3个株系(MdbHLH108-OE-1、MdbHLH108-OE-2、MdbHLH108-OE-3)在干旱(200mM Mannitol)和ABA(200μM)处理下生长14天的状态；

图中，CK、200mM Mannitol、200μM ABA分别表示在MS+6-BA(0.4mg·L^-1)+2，4-D(1.5 mg·L^-1)、MS+6-BA(0.4mg·L^-1)+2，4-D(1.5mg·L^-1)+Mannitol(200mM)、MS+6-BA(0.4mg·L^-1)+2，4-D(1.5mg·L^-1)+ABA(200μM)培养基上培养。

图4为WT和过表达MdbHLH108转基因愈伤组织3个株系(MdbHLH108-OE-1、MdbHLH108-OE-2、MdbHLH108-OE-3)在干旱(200mM Mannitol)和ABA(200μM)处理下生长14天的鲜重。

图5为WT和过表达MdbHLH108转基因愈伤组织3个株系(MdbHLH108-OE-1、MdbHLH108-OE-2、MdbHLH108-OE-3)在干旱(200mM Mannitol)和ABA(200μM)处理下生长14天的相对电导率。

图6为WT和过表达MdbHLH108转基因愈伤组织3个株系(MdbHLH108-OE-1、MdbHLH108-OE-2、MdbHLH108-OE-3)在干旱(200mM Mannitol)和ABA(200μM)处理下生长14天的丙二醛含量。

图7为WT和过表达MdbHLH108转基因愈伤组织3个株系(MdbHLH108-OE-1、MdbHLH108-OE-2、MdbHLH108-OE-3)在干旱(200mM Mannitol)和ABA(200μM)处理下生长14天的ROS组织化学染色，包括DAB染色和NBT染色。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、系统发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的 DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

“表达载体”，Expression vectors，是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。

“农杆菌介导转化法”，Agrobacterium-mediated transformation，指将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株的技术。

实施例1苹果基因MdbHLH108的克隆

一、平邑甜茶实生苗叶片RNA提取及反转录

1、利用CTAB法提取总RNA

(1)称取平邑甜茶叶片约0.1g，液氮速冻研磨成细粉，加入600μL提取液(提前65℃预热)，漩涡振荡2min，65℃水浴10min；CTAB提取液的具体配方见表1。

表1.CTAB提取液

(2)将离心管取出，加入600μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，涡旋振荡混匀，4℃，13000rpm离心5min；

(3)上清液转移至新离心管中，重复步骤(2)；

(4)上清液转移至新离心管中，加入1/3体积8mol·L^-1 LiCl，12-16h过夜沉淀(4℃)， 13000rpm，4℃，离心20min，弃上清液；

(5)制备SSTE缓冲液(表2)，取400μL缓冲液溶解沉淀，置于冰上；

表2 SSTE缓冲液

(6)加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，4℃，12000rpm离心5min；

(7)小心吸取上清，加600μL无水乙醇，-80℃放置30min；

(8)4℃，13000rpm离心20min，弃上清液，用75％的乙醇洗涤沉淀2次，室温下开盖5-7min，加入20μL DEPC-H₂O溶解沉淀，-80℃冻存。

2、反转录cDNA

(1)使用Vazyme公司提供的试剂盒按照说明书进行反转录，取上一步RNA产物为模板，在0.2ml的离心管中进行反应，共两步。首先配制基因组gDNA去除混合体系，在离心管中依次加入4×gDNA wiper Mix 4μL，RNA模板1pg-1μg，加入RNase free ddH₂O定容至16μL，移液枪轻轻混打均匀，离心，PCR仪上42℃反应2min：

表3基因组gDNA去除混合体系

(2)将上一步反应产物取出加入5×HiScript III qRT SuperMix 4μL定量至20μL，用枪头轻轻混匀，将微量离心管放在PCR仪上37℃，15min；85℃，5s；产物即为cDNA，反应结束后取出待用或-20℃保存。

二、cDNA全长序列的获得

设计特异性引物MdbHLH108-F，MdbHLH108-R，以反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增。

MdbHLH108-F：5’-ATGTTAGCCTCGTCTCC-3’，其序列如SEQ.ID.NO.3所示；

MdbHLH108-R：5’-CTAGTCTTCAAAATTC-3’，其序列如SEQ.ID.NO.4所示；

其中，PCR扩增体系见表4。

PCR反应程序：95℃预变性7min；95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸10s，35 次循环；72℃延伸5min。

表4 PCR扩增体系

PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，琼脂糖凝胶电泳图如图1所示，使用庄萌DNA 回收纯化试剂盒进行目的条带的回收，并通过零背景ZT4-Blunt(Amp⁺)快速载体克隆试剂盒进行T载体的连接，将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，将转化产物涂至加有氨苄抗素的LB平板培养基上，37℃倒置培养12-16h；挑取单菌落进行PCR验证，并将条带正确的菌液送至上海生工生物公司进行测序。得到基因MdbHLH108序列，ORF为783bp，编码260个氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。测序正确的单克隆，使用天根质粒提取试剂盒提取ZT4-Blunt-MdbHLH108的质粒DNA并置于-20℃保存，用于后续功能验证实验。

实施例2基因MdbHLH108表达载体的构建

为研究基因MdbHLH108的功能，我们以ZT4-Blunt-MdbHLH108质粒为模板进行PCR扩增，再根据pCAMBIA 1301载体图谱序列设计用Nco I和Bgl II这两个作为限制性内切酶，将二者回收纯化后进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取测序验证正确的菌落质粒，构成pCAMBIA 1301-MdbHLH108过表达载体。并将pCAMBIA 1301-MdbHLH108过表达载体转入到农杆菌GV3101中备用。

实施例3过表达MdbHLH108苹果愈伤组织的获得

将准备侵染的野生型‘王林’苹果愈伤组织接种至液体培养基上，摇15天，颜色为金黄时可用于侵染。挑选生长状态良好的苹果愈伤组织，将愈伤组织放在置于农杆菌中浸泡15min，用灭菌的纱布吸干农杆菌菌液，接种到无抗生素的培养基上，暗培养2天。后用灭菌水加卡那(500mg·L^-1)洗3次，时间5-8min，洗去多余的农杆菌。用灭菌的纱布将水吸干后，转移至加继代培养基上，铺成薄薄的一层。继代筛选3-5次后，提取DNA和RNA进行检测。

提取野生型和MdbHLH108转基因苹果愈伤组织总RNA，应用qRT-PCR检测基因MdbHLH108在野生型和三个转基因苹果愈伤组织中的表达量，如图2所示，与对照相比，MdbHLH108的转录水平在三个转基因株系MdbHLH108-OE-1、MdbHLH108-OE-2、 MdbHLH108-OE-3中显著升高，表明成功获得了MdbHLH108过量表达的转基因苹果愈伤组织。

实施例4 MdbHLH108转基因愈伤组织对甘露醇敏感性分析

将生长状态良好且一致的苹果愈伤野生型及3个过表达MdbHLH108转基因愈伤组织分别置于MS+6-BA(0.4mg·L^-1)+2，4-D(1.5mg·L^-1)和MS+6-BA(0.4mg·L^-1)+2，4-D(1.5mg·L^-1)+甘露醇(图中用Mannitol表示，200mM)培养基上，并在25℃暗室进行培养。两周后观测表型，并进行了MdbHLH108的抗旱性分析，所有试验均设置3个生物学重复，应用SPSS22.0计算其平均值及误差。试验结果如图3-7所示，在对照培养基上(CK)，野生型(WT)与3个转基因愈伤组织(OE-1、OE-2、OE-3)生长势没有差异，而在干旱(200mM Mannitol)处理后，发现转基因愈伤组织OE-1、OE-2、OE-3长势相比于WT弱(图3)。随后检测了甘露醇处理后的转基因愈伤组织的一些生理指标发现，相比于WT，过表达 MdbHLH108转基因株系的鲜重明显降低(图4A)，相对电导率明显升高(图5A)，丙二醛含量明显升高(图6A)，DAB染色和NBT染色颜色更深(图7A、B)，表明基因MdbHLH108 在干旱胁迫中起到负调控的作用。

实施例5 MdbHLH108转基因愈伤组织对ABA敏感性分析

将生长状态良好且一致的苹果愈伤野生型及3个过表达MdbHLH108转基因愈伤组织分别置于MS+6-BA(0.4mg·L^-1)+2，4-D(1.5mg·L^-1)和MS+6-BA(0.4mg·L^-1)+2，4-D(1.5mg·L^-1)+ABA(200μM)培养基上，并在25℃暗室进行培养。两周后观测表型，并且进行了MdbHLH108对ABA敏感性的分析，所有试验均设置3个生物学重复，应用SPSS 22.0计算其平均值及误差。试验结果也如如图3-7所示，在对照培养基上(CK)，野生型(WT) 与3个转基因愈伤组织(OE-1、OE-2、OE-3)长势相似，差别不大；而在200μM ABA处理后，转基因愈伤组织OE-1、OE-2、OE-3的生长势明显弱于WT(图3)，且经过200μM ABA 处理后，转基因愈伤组织OE-1、OE-2、OE-3相比于WT其鲜重明显降低(图4B)，相对电导率明显升高(图5B)、丙二醛含量明显升高(图6B)，DAB染色和NBT染色颜色更深 (图7A、B)，这表明过表达MdbHLH108苹果愈伤组织对ABA的敏感性显著提升，抗逆性减弱。

综上，本发明的基因MdbHLH108，通过苹果愈伤组织功能验证分析发现，转基因材料抗旱能力降低与ABA敏感性明显升高，说明MdbHLH108在干旱胁迫中起到负调控的作用，有利于从分子机制上阐明基因MdbHLH108在干旱胁迫响应方面的作用，并且对苹果抗旱定向遗传改良和砧木选育有重要意义。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 一种苹果耐旱负调控基因MdbHLH108及其应用

<130> 2022

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 783

<212> DNA

<213> Malus × domestica Borkh.

<400> 1

atgttagcct cgtctcctcc tttgttttca accattggat ggcccttaga tcaagattgc 60

catgagtacc acaactactt ttacagcaac gacattacta ctactaatga tgatcaaact 120

gcagactcat tccttcattt acttccatgt catcacccac aagttgacct tgatcgttac 180

acaccatcca caactgtcac cggtgactac tccagcgttt gtccgatggc aaagaaactt 240

aaccacaatg ctagtgagcg tgatcgtcgc aagaaaatca gtaacttgta tgcctcattg 300

cgttcactcc ttcctgcaga tcaaacgaaa acactaagca ttccgaatac aatttcgcgt 360

gcactgaaat acataccgga actccaaaag caagtggagg gactgaaccg aaagagggaa 420

gaactcttat caagagcttc taagcaagaa gatgcaatgc atgaggagaa aaaaataaaa 480

accacagctc ggagttcaca atctgcagtt tcaacctacc gtcttaacga tagagaagta 540

gcaattcaaa tatccacctt taagacccac aacaatctat tatctgagat cttacaacat 600

ctggaggaag aggggcttga actagaaaat gcttctttct ttgagtctta tgagaaagaa 660

gttttctata atttacatct tcaggtggac agaacataca gattagagtg tgagaaagaa 720

gctcatgtcc ttctatgcat gacaaaagga aagagccatt cccataagaa ttttgaagac 780

tag 783

<210> 2

<211> 260

<212> PRT

<213> Malus × domestica Borkh.

<400> 2

Met Leu Ala Ser Ser Pro Pro Leu Phe Ser Thr Ile Gly Trp Pro Leu

1 5 10 15

Asp Gln Asp Cys His Glu Tyr His Asn Tyr Phe Tyr Ser Asn Asp Ile

20 25 30

Thr Thr Thr Asn Asp Asp Gln Thr Ala Asp Ser Phe Leu His Leu Leu

35 40 45

Pro Cys His His Pro Gln Val Asp Leu Asp Arg Tyr Thr Pro Ser Thr

50 55 60

Thr Val Thr Gly Asp Tyr Ser Ser Val Cys Pro Met Ala Lys Lys Leu

65 70 75 80

Asn His Asn Ala Ser Glu Arg Asp Arg Arg Lys Lys Ile Ser Asn Leu

85 90 95

Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Leu Pro Ala Asp Gln Thr Lys Thr Leu

100 105 110

Ser Ile Pro Asn Thr Ile Ser Arg Ala Leu Lys Tyr Ile Pro Glu Leu

115 120 125

Gln Lys Gln Val Glu Gly Leu Asn Arg Lys Arg Glu Glu Leu Leu Ser

130 135 140

Arg Ala Ser Lys Gln Glu Asp Ala Met His Glu Glu Lys Lys Ile Lys

145 150 155 160

Thr Thr Ala Arg Ser Ser Gln Ser Ala Val Ser Thr Tyr Arg Leu Asn

165 170 175

Asp Arg Glu Val Ala Ile Gln Ile Ser Thr Phe Lys Thr His Asn Asn

180 185 190

Leu Leu Ser Glu Ile Leu Gln His Leu Glu Glu Glu Gly Leu Glu Leu

195 200 205

Glu Asn Ala Ser Phe Phe Glu Ser Tyr Gly Gly Arg Val Phe Tyr Asn

210 215 220

Leu His Leu Gln Val Asp Arg Thr Tyr Arg Leu Glu Cys Glu Lys Glu

225 230 235 240

Ala His Val Leu Leu Cys Met Thr Lys Gly Lys Ser His Ser His Lys

245 250 255

Asn Phe Glu Asp

260

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> Malus × domestica Borkh.

<400> 3

atgttagcct cgtctcc 17

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> Malus × domestica Borkh.

<400> 4

ctagtcttca aaattc 16

Claims

1.一种苹果耐旱负调控基因MdbHLH108，其特征在于，所述基因MdbHLH108的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述基因MdbHLH108的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.扩增权利要求1所述基因MdbHLH108的引物对，其特征在于，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID No.3所示，反向引物序列如SEQ ID No.4所示。

4.包含权利要求1所述苹果基因MdbHLH108的过表达载体。

5.权利要求1所述基因或权利要求2所述蛋白或权利要求4所述过表达载体作为负调控因子在提高植物抗旱性和/或降低植物对ABA敏感性中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为苹果。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述负调控表现为：在干旱胁迫下，相对于野生型植株来讲，转基因植株的抗旱性低于野生型，对ABA敏感性高于野生型。

8.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为(1)、(2)或(3)：

(1)通过增加目的植物中MdbHLH108蛋白的活性，获得抗旱性低于目的植物和/或对ABA敏感性高于目的植物的植株；

(2)通过促进目的植物中基因MdbHLH108的表达，获得抗旱性低于目的植物和/或对ABA敏感性高于目的植物的植株；

(3)通过抑制目的植物中的基因MdbHLH108的表达，获得抗旱性高于目的植物和/或对ABA敏感性低于目的植物的植株。

9.根据权利要求8所述的植物育种方法，其特征在于，所述目的植物为苹果。