CN110656113A

CN110656113A - 一种与水稻抗逆相关的基因OsERF65及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN110656113A
Application number: CN201910938888.6A
Authority: CN
Inventors: 徐凯; 赵慧; 杨涛勤; 陈守俊; 夏辉; 罗利军
Original assignee: SHANGHAI MUNICIPAL AGRICULTURAL BIOLOGICAL GENE CENTER
Current assignee: SHANGHAI MUNICIPAL AGRICULTURAL BIOLOGICAL GENE CENTER
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2020-01-07
Anticipated expiration: 2039-09-30
Also published as: CN110656113B

Abstract

本发明公布了一种从水稻DNA片断中分离克隆的与水稻抗逆性相关的OsERF65基因。该基因编码的蛋白含有AP2转录因子家族保守的ERF结构域，为该基因家族ERF亚家族成员。OsERF65基因受干旱、高盐、乙烯以及ABA诱导表达，超量表达OsERF65显著增强转基因水稻苗期抵抗渗透胁迫的能力，而敲除该基因以后，降低了转基因水稻抵抗渗透胁迫的能力，与水稻抗逆性相关。本发明的水稻基因对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种，提高植物的抗逆性。

Description

一种与水稻抗逆相关的基因OsERF65及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及一种与水稻抗逆性相关的基因，具体地说，涉及一种新的水稻抗逆相关基因OsERF65及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

干旱缺水是造成全球粮食减产的重要因素之一。干旱胁迫严重影响植物生长和发育，甚至造成植物死亡。水稻是重要的粮食作物之一，水稻需水占农业用水的65％，利用现代生物学技术研究植物抗旱的生理生化反应，克隆重要的抗旱基因，进而转入植物中培育抗旱性增强的作物新品种，特别是培育节水抗旱的水稻新品种是缓解全球干旱缺水、人口增长带来的粮食生产压力的有效途径。

植物在长期的进化过程中形成了一系列的适应机制来应对干旱等逆境胁迫。干旱胁迫下，植物一方面通过调节气孔关闭来减少水分蒸腾，同时通过促进根系生长来增加水分吸收，从而有效避免干旱胁迫对植物的伤害。同时，植物可通过合成有机大分子等渗透调节和保护的分子以及抗氧化酶类来增强自身对逆境的耐受能力。

植物生理学、遗传学、分子生物学的研究使得植物的抗逆机制逐渐明晰，一些重要的抗逆基因被克隆。与抗逆相关的基因根据功能不同基本分为两类：一类是编码渗透调节蛋白、抗氧化酶、转运蛋白等功能蛋白的基因；另一类是编码转录因子、蛋白激酶等起调节作用蛋白的基因。

转录因子通过与相应的顺式作用元件结合，调控下游一系列基因的表达，在植物抵抗逆境胁迫信号中发挥重要作用。植物中存在多种类型的转录因子，其中AP2/ERF类型的转录因子是一个超大的基因家族。AP2/ERF转录因子通常含有由60～70个氨基酸组成的AP2/ERF结构域。根据序列的相似性和AP2/ERF结构域的数量，AP2/ERF转录因子分为3类，分别为AP2、ERF、和RAV亚家族。其中ERF家族包含1个AP2/ERF结构域。不同的植物含有的AP2/ERF类转录因子基因家族成员数量不同。已有研究表明该家族中的成员参与多种生物学过程,包括植物生长与发育、病菌防御、高盐、干旱等环境胁迫响应等。另外,AP2/ERF类转录因子参与水杨酸、茉莉酸、乙烯、脱落酸等多种信号转导途径,而且某些家族成员是逆境信号交叉途径中的连接因子，介导重要激素信号与逆境信号的交互反应。

AP2/ERF转录因子中，ERF家族包含1个AP2/ERF结构域,可以分为2个大的亚家族,CBF/DREB亚家族和ERF亚家族。CBF/DREB亚家族成员可以识别干旱和冷诱导响应元件,在植物抵抗非生物胁迫过程中起着非常重要的作用。过量表达拟南芥DREB1A/CBF3基因可以增强植物对干旱、高盐和低温的抗性。DREB2A基因受干旱和高盐诱导。在转基因拟南芥中,过量表达DREB2A可以显著的提高对干旱的抗性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的水稻抗逆相关基因OsERF65，及OsERF65基因编码AP2转录因子。该基因的表达明显受到逆境胁迫的诱导，超表达该基因后显著增强了转基因水稻的抵抗渗透胁迫的能力。

本发明的再一目的是提供水稻抗逆相关基因OsERF65在提高水稻抗逆性中的应用。

本发明从水稻中分离克隆的一段完整编码区段的DNA片段，对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明，该基因编码的蛋白含有AP2转录因子家族保守的ERF结构域，为该基因家族ERF亚家族成员，命名为OsERF65。

本发明分离和应用一种包含OsERF65基因的DNA片段，该基因能响应干旱、高盐、外源乙烯、ABA等胁迫和激素处理，发生表达变化。

本发明采用的技术方案是，提供一种与水稻抗逆性相关的OsERF65基因，其中，所述OsERF65基因的序列如下列之一：SEQ ID NO:1所示的DNA序列；与SEQ ID NO:1至少90％同源的DNA序列；功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。

本发明的另一种优选方案是，所述的OsERF65基因的序列为如下列之一：SEQ IDNO:1中第358-1383位所示的DNA序列；或与SEQ ID NO:1中第358-1383位所示的DNA序列相似性达90％的DNA序列。

本发明还提供一种包含OsERF65基因编码的蛋白，其中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者为所述SEQ ID NO:2序列的同源序列、或保守性变异体、或等位变异体、或天然突变体、或诱导突变体。

本发明还提供一种包含OsERF65基因编码的重组载体，其中，构建所述重组载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。

本发明还提供一种包含OsERF65基因的一种植物转化体，其中，所述植物转化体的宿主为水稻。

本发明另一优先方案是提供一种提高植物抗逆性中的应用，其中，所述抗逆性中应用的植物包含权利要求1或2所述OsERF65的基因，所述植物为水稻。

获得上述采用已克隆的OsERF65基因为探针，从cDNA文库和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsERF65基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到OsERF65基因，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得对逆境响应增强的转基因植株。

本发明提供的载体携带本发明OsERF65基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体，直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。

本发明OsERF65基因表达载体转化宿主是包括水稻在内的多种植物。

本发明通过对水稻基因分离克隆及其对逆境胁迫的响应，提供了一种水稻DNA片断包含一个1026bp的编码基因OsERF65。该基因含有AP2/ERF转录因子家族典型的结构域，为该基因家族ERF类型成员。OsERF65基因受干旱、盐、外源乙烯、ABA诱导表达，与水稻抗逆性相关。

本发明可以用于研究利用此基因遗传转化获得转基因植物的分子方法。

本发明的水稻基因对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种。

本发明的有益效果是，OsERF65基因为水稻耐旱性转录组分析得到的重要节点基因，编码AP2/ERF转录因子，属于ERF亚家族。在逆境胁迫和激素处理处理下的基因表达谱分析表明，该基因明显响应干旱、高盐、外源乙烯和ABA等逆境胁迫和激素的处理。超量表达该基因的转基因水稻抵抗渗透胁迫的能力显著提高，而敲除该基因的转基因水稻抵抗渗透胁迫的能力降低，表明该基因在水稻抗渗透胁迫反应中发挥正调节作用。

附图说明

图1为本发明利用ClustalW2软件将OsERF65基因预测的蛋白序列与同源蛋白序列进行比对的结果；

图2为本发明的OsERF65基因在苗期水稻受到聚乙二醇(PEG)、高盐、过氧化氢、高温和外源乙烯、脱落酸(ABA)处理时的表达水平；

图3为本发明的OsERF65基因基因敲除载体转化水稻植株的敲除靶点测序检测；

图4为本发明的OsERF65基因超表达载体转化水稻植株的表达水平检测；

图5为本发明OsERF65基因超表达转基因水稻与野生型水稻抵抗聚乙二醇渗透胁迫比较分析。A,OsERF65基因超表达转基因水稻在聚乙二醇渗透胁迫处理条件下的表型；B,OsERF65基因超表达转基因水稻在渗透胁迫处理后的存活率；C，OsERF65基因超表达转基因水稻在渗透胁迫处理条件下的叶片丙二醛(MDA)含量；

图6为本发明OsERF65基因敲除水稻与野生型水稻抵抗聚乙二醇渗透胁迫比较分析。A,OsERF65基因敲除水稻在聚乙二醇渗透胁迫处理条件下的表型；B,OsERF65基因敲除水稻在渗透胁迫处理后的存活率；C，OsERF65基因敲除水稻在渗透胁迫处理条件下的叶片丙二醛(MDA)含量；

具体实施方式

下述实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1水稻OsERF65基因的克隆

1.幼苗培育

将水稻珍汕97B置于30℃萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。

2.RNA的分离：

RNA的提取：所取样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有1mL TRNzol-A+试剂(天根生化科技有限公司)的2mL EP管，充分振荡后，室温放置5min，之后加0.2mL氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置3min；后于4℃，12000rpm离心10min后，上清液移至新的2mLEP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加100μL RNase-free ddH₂O溶解。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.逆转录合成第一链cDNA

使用EasyScript one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix(TransGen)试剂盒进行第一链cDNA的合成，依次加入下列各试剂配制20μL的反应体系：

将上反应体系于42℃温育15min；然后85℃加热5s，使反转录酶失活并阻止其与DNA结合；4℃或冰上放置5min。制备好的cDNA可以立即使用或存放于-20℃备用。

4.水稻OsERF65基因全长的扩增

对水稻基因组及全长基因数据库进行BLAST搜索，获得预测基因LOC_Os07g42510对应的全长cDNA。根据预测信息设计上下游引物ERF65f(5’CCGGCCGAGTTGTTGAGGGATTTG3’)和ERF65r(5’CAGATAAGTTTATTTGAATTCAAC 3’)，从cDNA中直接克隆获得了OsERF65基因，凝胶回收，连接到pEasy-Blunt载体上，鉴定后进行序列测定，测序结果经BLAST比对确认。结果显示本发明中的水稻OsERF65全长DNA的长度为1833bp，详细序列见SEQ ID NO:1，其中开放阅读框(ORF)为1026bp，5’非翻译区(UTR)为384bp，3’非翻译区(UTR)为450bp。

实施例2水稻OsERF65蛋白的序列信息与同源性分析

根据本发明新的水稻OsERF65的ORF推导出水稻OsERF65的氨基酸序列，共341个氨基酸，分子量为37104道尔顿，详细序列见SEQ ID NO:2。通过NCBI网站的BLASTP程序比对得出(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，OsERF65编码蛋白具有AP2催化结构域，属于ERF亚家族。

通过对水稻中的部分ERF编码蛋白进行多序列比对(图1)，我们发现，该蛋白的具有高度保守的AP2催化结构域。

实施例3水稻基因OsERF65在逆境胁迫下的表达分析

1.逆境胁迫处理

选取饱满的日本晴种子，蒸馏水清洗，3％NaClO消毒10min后清洗干净，30℃催芽，种子露白后转放到发芽盒内水培生长，三叶期后施加营养液(国际水稻所标准营养液)。在28℃，16h/8h的光照培养室中培养，至四叶期时进行各种逆境和激素处理：20％PEG6000、150mM NaCl、42℃、1％H₂O₂、100μM脱落酸(ABA)和100μM乙烯(ET)。分别在胁迫前、胁迫后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h对逆境处理材料进行取样。所有处理和取样过程都是在持续光照的条件下进行。

2.RNA提取与第一链cDNA合成

同实施例1。

3.定量PCR分析

根据OsERF65全长cDNA序列设计定量引物。以水稻持家基因actin(GenBankaccession No.AY212324)为参照基因，根据其cDNA序列设计引物。基因表达的定量分析使用TransGen公司的

Top Green qPCR SuperMix试剂盒和Bio-Rad CFX96Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad，USA)。

20μL反应体系的配制：

反应条件为：95℃30s，然后在95℃5s，60℃31s，循环40次，并增设DissociationStage。设定在每个循环中60℃31s时收集数据，其它具体操作按仪器使用说明书进行。计算目的基因与参照基因的平均CT值以及△CT值，利用2^-ΔΔCT法进行结果分析，最后将数据导入GraphPad Prism5.0做出目的基因的相对表达量柱状图。

定量分析结果显示：OsERF65的表达对PEG渗透胁迫、H₂O₂过氧化胁迫、盐胁迫等表现出快速的受诱导上升表达，在1-2h即达到较高表达，而对乙烯则表现出逐步诱导的过程，到12h达到最高表达。这些结果表明，该基因能够受到干旱、过氧化、盐等逆境胁迫处理以及激素乙烯和ABA的诱导表达，因而该基因在逆境应答反应中可能起着一定作用。

实施例4水稻基因OsERF65超量表达转化水稻

1.利用重组克隆技术构建含OsERF65基因的超量表达载体：：

以实施例1中已获得含有OsERF65基因的pEasy-blunt载体为模板，用前引物ERF65-OEf:5’-CAGGTCGACTCTAGAGGATCCATGTGTGGAGGATCCATTCTCAG-3’，后引物ERF65-OER:5’-TCGGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCAATAAGCTCTGAACTCCATTGG-3’进行PCR扩增。扩增产物经回收纯化后，通过重组反应，将扩增产物片断克隆到超量表达载体pUb-06，筛选阳性克隆。具体过程如下：

(1)PCR扩增

50μL反应体系如下：

扩增程序：98℃预变性2min，98℃15s，60℃30s,68℃2min，30个循环。

采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)进行纯化回收。

(2)重组反应

重组反应的目的在于将含有与载体酶切位点两端序列相同的接头的PCR产物重组到pUb-06载体上，以产生超表达载体。重组反应可在室温配制混匀，0.5mL的离心管中进行。反应体系如下：

35℃温浴30min左右，然后将反应液转化大肠杆菌感受态细胞。转化完成的大肠杆菌液涂布在含有卡那霉素的平板上生长。接着挑取单菌落，进行PCR验证，然后送测序，测序结果与该基因cDNA序列比对以确认序列正确与否，最后提取质粒，即可转化农杆菌EHA105。

2.农杆菌转化

(1)根癌农杆菌(EHA105)感受态细胞的制备：

根癌农杆菌菌液于28℃培养至OD600＝0.5时，4℃离心收集菌体，用500μL、0.1mol/L冰浴CaCl₂重悬，冰浴30min后离心，去上清，用100μL，0.1mol/L冰CaC1₂重悬后，于4℃保存。

(2)农杆菌转化(冻融法)：

向农杆菌感受态细胞(100μL)中加入5μL植物表达载体质粒DNA，轻轻混匀，冰水浴30min后，于液氮中速冻冷激2min；加入400-800μL YEP培养液(含卡那霉素，Kan)；28℃，200r/min振荡培养3-5h；室温离心(5000r/min，5min)，保留100μL上清重悬菌体，涂布于LB固体培养基(含Kan)上，28℃倒置培养2天直至长出合适大小的菌落，挑取单克隆进行PCR检测，得到阳性菌株。

3.愈伤诱导：种子用无菌水漂洗15-20min，再用75％的乙醇消毒1min，然后用次氯酸钠(1.5％有效浓度)溶液振荡消毒20min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。

愈伤诱导培养基：采用表1的诱导培养基，加入0.3g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

4.继代培养：把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。

继代培养基：采用表1的继代培养基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

5.农杆菌浸染和愈伤组织共培养：培养农杆菌，挑取阳性单菌落，在1mL农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50mL农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养至OD600＝0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30min至OD600＝0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5d。

悬浮培养液：采用表1的悬浮培养液，加入0.08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0.2mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成100mL溶液，调pH至5.4，分成两瓶(每瓶50mL)，高温高压灭菌。使用之前加入1mL 50％的葡萄糖和100μL AS(100mM)。

共培养培养基：采用表1的共培养培养基，加入0.8g水解酪蛋白酶、20g蔗糖和3.0mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.6，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20mL 50％的葡萄糖和1mL AS(100mM)。

6.筛选培养：共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。

筛选培养基：采用表2的筛选培养基，加入0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1mL Hn和1mL Cn(100ppm)。

7.分化培养：挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16h/8h光暗培养诱导分化芽(4-6周)。

分化培养基：采用表2的分化培养基，加入2.0mg/L 6-BA、2.0mg/L KT、0.2mg/LNAA、0.2mg/L IAA、1.0g水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

8.生根培养：待芽长至2cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16h/8h光暗培养，诱导生根。

生根培养基：采用表2的生根培养基，加入30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至5.8，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

9.转化植株培养：待根系发达后，打开试管口，加入无菌水炼苗2-3d后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。

10.超表达转基因植株的阳性检测

(1)基因组DNA提取(粗提法)：按照植物基因组DNA快速提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)的说明，取叶片，剪碎，加入20μL提取液P1，95℃5min，短暂离心，加入20μL中和液P2，短暂离心。

(2)根据载体筛选标记HptII设计引物，以粗提DNA为模板进行PCR，检测转基因植株是否为阳性。如图所示，多数转基因植株的DNA都扩增出了预期的PCR产物，表明为阳性植株。

11.超量表达阳性植株中目的基因的表达水平检测

RNA提取及定量PCR方法见实施例1。

提取转基因T0代植物叶片RNA，采用定量PCR法检测了OsERF65超量表达植株中目的基因的表达水平(图5)，在检测的15株转基因植株中，有8株表达量超过20倍，3株超过40倍的植株。

实施实例5CRISPR/Cas9敲除OsERF65基因的水稻突变体的获得

1.OsERF65基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建

以pYLgRNA-OsU6a/LacZ质粒为模板，在两个反应体系中分别进行OsU6a-靶点片段和gRNA-靶点片段的扩增，

引物为F:GTGACCTGTGGGGAGACGCGTTTTAGAGCTAGAAAT

R：GCGTCTCCCCACAGGTCACCGGCAGCCAAGCCAGCA

PCR反应使用KOD plus聚合酶，25循环：94℃10s，58℃15s，68℃20s。电泳检测PCR产物。

取第一轮两个PCR产物各1μL为模板，用引物U-GAL(ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG)和Pgs-GAR(TAGCTCGAGAGGCGCGCCAATGATACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTCTTG)按以上步骤进行第二轮PCR,30循环。凝胶电泳检测，切胶回收，此产物即为gRNA表达盒。

(2)gRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9的重组连接

pYLCRISPR/Cas9载体的线性化：在50μl反应用20U Bsa I酶切～2μg pYLCRISPR/Cas9载体约30min。取2μL(～80ng)电泳检查，确认被切出的ccdB条带。

按下表配制重组反应体系进行重组反应：

37度30min进行反应，结束后直接进行转化，涂布含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，次日挑取阳性克隆摇菌，用1300F/1300R引物进行PCR检测并进行测序分析，选取鉴定好的阳性克隆进行质粒提取，用于水稻遗传转化。

2.CRISPR/Cas9敲除载体对水稻的遗传转化及转基因水稻的阳性检测

同实施实例4,利用HptII筛选标记的引物进行PCR检测。

根据敲除靶点设计引物65CRISPF：TTCAGCATCCTGCCACA和65CRISPR：ATCATCGCCATAGTCATCC，以粗提DNA为模板进行PCR，将PCR产物进行序列测定，将测得的序列与野生型中的基因序列进行比对。结果显示，部分株系的靶点发生了不同碱基数的缺失或插入。

实施例6

转基因水稻的苗期PEG模拟干旱处理。

将超量表达转基因家系种子去壳消毒(75％酒精处理1min，1.5％NaClO处理20min，无菌水清洗5次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽，野生型对照晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上。待发芽2～3天后挑选发芽好且长势一致的种子，分别转移到96孔板中，放入水稻营养液中培养至4叶期，将水稻苗转移至18％(m/V)聚乙二醇(PEG6000)的水稻培养液中，处理2-3天，恢复在正常的培养液，在光照培养室生长7～10天后观察表型，处理过程中观察表型并拍照。

实验结果可以看出，正常生长条件下，OsERF65超表达转基因植株、OsERF65基因敲除植株与野生型植株均没有明显的差异；在PEG模拟干旱胁迫处理后，超表达转基因植株叶片出现萎蔫，野生型植株萎蔫更严重，而敲除植株的叶片萎蔫最严重，恢复营养液培养后，超表达转基因株系的存活率显著高于野生型，而敲除株系的存活率低于野生型。该结果表明OsERF65正调控水稻苗期对干旱胁迫的耐受性，超量表达该基因可以显著提高水稻的抗旱能力。

综上所述，尽管已引证一些具体实例对本发明作了详细的说明，但对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围，作各种变化或修正是显然的。

序列表

<110> 上海市农业生物基因中心

徐, 凯

<120> 一种与水稻抗逆性相关的OsERF65基因及其编码蛋白与应用

<130> OsERF65

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1833

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<220>

<221> CDS

<222> (358)..(1383)

<400> 1

ccggccgagt tgttgaggga tttgattcgg gttcatgcac ccacactcct cttcattcca 60

atgcagaaaa attcagcgtc ctgccacaca aagtcccaac tagaccactt gccagctcaa 120

ctagcactat tataccaacc attatgctaa tgctgtctca tatctaatgt gtgttaatag 180

tttattagct ctccaagaac aatccaatct tcagtagtac aaatatatga gagagcacaa 240

agcttcaagc ctccttcaga ctacaagcca ttaaacagag acgaccaacg acttaaccac 300

acttctttgt gctgtccaac ctccattgtt gggtgtgaaa gctttggctc atctgcc atg 360

Met

1

tgt gga gga tcc att ctc agc gac ctt cac ttg ccg gtg cgg cgg acg 408

Cys Gly Gly Ser Ile Leu Ser Asp Leu His Leu Pro Val Arg Arg Thr

5 10 15

gtg aac gcc ggt gac ctg tgg gga gac gcc ggc aag ggt aga gat ggt 456

Val Asn Ala Gly Asp Leu Trp Gly Asp Ala Gly Lys Gly Arg Asp Gly

20 25 30

ggc gat ggc ttg aag aag agg aag ggg agt tct tgg gat ttc gat gtt 504

Gly Asp Gly Leu Lys Lys Arg Lys Gly Ser Ser Trp Asp Phe Asp Val

35 40 45

gat tgc gat gat gat gat gat gac ttt gag gct gat ttt gag gag ttt 552

Asp Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asp Phe Glu Ala Asp Phe Glu Glu Phe

50 55 60 65

gag gat gac tat ggc gat gat gat gat gtg ggt ttc ggg cac gac gac 600

Glu Asp Asp Tyr Gly Asp Asp Asp Asp Val Gly Phe Gly His Asp Asp

70 75 80

caa gaa tcc gac atg aac ggt ctc aag ctc gcc gga ttc agc acc acg 648

Gln Glu Ser Asp Met Asn Gly Leu Lys Leu Ala Gly Phe Ser Thr Thr

85 90 95

aag ctc ggc ctc ggc ggc agc agg aag agg aag acg cga tac cga ggg 696

Lys Leu Gly Leu Gly Gly Ser Arg Lys Arg Lys Thr Arg Tyr Arg Gly

100 105 110

atc cgg cag cgg cca tgg ggg aaa tgg gcg gcg gag atc agg gac ccc 744

Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro

115 120 125

cgc aag ggc gtc cgc gtc tgg ctc ggc acg ttc ggc acc gcc gag gag 792

Arg Lys Gly Val Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Gly Thr Ala Glu Glu

130 135 140 145

gcc gcc atg gcg tac gac gtc gag gca cgc cgc atc cgc ggc aag aaa 840

Ala Ala Met Ala Tyr Asp Val Glu Ala Arg Arg Ile Arg Gly Lys Lys

150 155 160

gcc aag gtc aac ttc ccc gac gcc gcc gcc gcc gcc ccg aag cgg cca 888

Ala Lys Val Asn Phe Pro Asp Ala Ala Ala Ala Ala Pro Lys Arg Pro

165 170 175

cgg cgt tct tcg gcg aag cat tcg ccg cag cag cag aag gcc agg tcg 936

Arg Arg Ser Ser Ala Lys His Ser Pro Gln Gln Gln Lys Ala Arg Ser

180 185 190

tcg tcg tcg tcg ccg gcg agc ctg aac gcc agc gac gcc gtg tcc aag 984

Ser Ser Ser Ser Pro Ala Ser Leu Asn Ala Ser Asp Ala Val Ser Lys

195 200 205

tcc aac aac aac cgc gtc agc tcg gct ggg agc agc acc gac gcc acc 1032

Ser Asn Asn Asn Arg Val Ser Ser Ala Gly Ser Ser Thr Asp Ala Thr

210 215 220 225

gcc gcc gcc atc gcc atc gac gac ggc gtc aag ctc gag ctg ctc tcg 1080

Ala Ala Ala Ile Ala Ile Asp Asp Gly Val Lys Leu Glu Leu Leu Ser

230 235 240

gag acg gat cct tct ccg ccc atg gcc gcc gcc gcc gcc gcg tgg ctc 1128

Glu Thr Asp Pro Ser Pro Pro Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Trp Leu

245 250 255

gac gcg ttc gag ctg aac gat ctt gac gga tca aga tgc aag gac aac 1176

Asp Ala Phe Glu Leu Asn Asp Leu Asp Gly Ser Arg Cys Lys Asp Asn

260 265 270

gca ttc gat cac cag att cac aag gta gaa gcg gct gtc gct gat gaa 1224

Ala Phe Asp His Gln Ile His Lys Val Glu Ala Ala Val Ala Asp Glu

275 280 285

ttc gcg ttc tac gac gat ccg agc tac atg cag ctg ggt tac cag ctc 1272

Phe Ala Phe Tyr Asp Asp Pro Ser Tyr Met Gln Leu Gly Tyr Gln Leu

290 295 300 305

gat cag ggc aac tcg tac gag aac atc gac gcg ctc ttc ggc ggc gag 1320

Asp Gln Gly Asn Ser Tyr Glu Asn Ile Asp Ala Leu Phe Gly Gly Glu

310 315 320

gcc gtc aac att ggt gga ctc tgg agc ttc gac gac atg cca atg gag 1368

Ala Val Asn Ile Gly Gly Leu Trp Ser Phe Asp Asp Met Pro Met Glu

325 330 335

ttc aga gct tat tga gcatttgatt ctatttagga gggagtgaat tatttgggag 1423

Phe Arg Ala Tyr

340

gaagaatcga tgttgtaact tgtaaaatct ctgatgatga tctctgcatc atatgatcaa 1483

tttgagtgca gttttgtttt tgtaaatacg aattctttat tatgatgtta ggttcttaat 1543

ttgcccttct tcatcaggga tttgttcagg cttttgttgt gatgactgat tggacgaggg 1603

aaagattgcg ttttttgttg tcatgttggg tactctactc ttctgttcct aaagttgata 1663

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cctaattagg cacatttttt ctccccgaac ttttgccatg tatgtacttg atcagtgctc 1783

agataacttt taccaagaaa attgtggttg aattcaaata aacttatctg 1833

<210> 2

<211> 341

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 2

Met Cys Gly Gly Ser Ile Leu Ser Asp Leu His Leu Pro Val Arg Arg

1 5 10 15

Thr Val Asn Ala Gly Asp Leu Trp Gly Asp Ala Gly Lys Gly Arg Asp

20 25 30

Gly Gly Asp Gly Leu Lys Lys Arg Lys Gly Ser Ser Trp Asp Phe Asp

35 40 45

Val Asp Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asp Phe Glu Ala Asp Phe Glu Glu

50 55 60

Phe Glu Asp Asp Tyr Gly Asp Asp Asp Asp Val Gly Phe Gly His Asp

65 70 75 80

Asp Gln Glu Ser Asp Met Asn Gly Leu Lys Leu Ala Gly Phe Ser Thr

85 90 95

Thr Lys Leu Gly Leu Gly Gly Ser Arg Lys Arg Lys Thr Arg Tyr Arg

100 105 110

Gly Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp

115 120 125

Pro Arg Lys Gly Val Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Gly Thr Ala Glu

130 135 140

Glu Ala Ala Met Ala Tyr Asp Val Glu Ala Arg Arg Ile Arg Gly Lys

145 150 155 160

Lys Ala Lys Val Asn Phe Pro Asp Ala Ala Ala Ala Ala Pro Lys Arg

165 170 175

Pro Arg Arg Ser Ser Ala Lys His Ser Pro Gln Gln Gln Lys Ala Arg

180 185 190

Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ala Ser Leu Asn Ala Ser Asp Ala Val Ser

195 200 205

Lys Ser Asn Asn Asn Arg Val Ser Ser Ala Gly Ser Ser Thr Asp Ala

210 215 220

Thr Ala Ala Ala Ile Ala Ile Asp Asp Gly Val Lys Leu Glu Leu Leu

225 230 235 240

Ser Glu Thr Asp Pro Ser Pro Pro Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Trp

245 250 255

Leu Asp Ala Phe Glu Leu Asn Asp Leu Asp Gly Ser Arg Cys Lys Asp

260 265 270

Asn Ala Phe Asp His Gln Ile His Lys Val Glu Ala Ala Val Ala Asp

275 280 285

Glu Phe Ala Phe Tyr Asp Asp Pro Ser Tyr Met Gln Leu Gly Tyr Gln

290 295 300

Leu Asp Gln Gly Asn Ser Tyr Glu Asn Ile Asp Ala Leu Phe Gly Gly

305 310 315 320

Glu Ala Val Asn Ile Gly Gly Leu Trp Ser Phe Asp Asp Met Pro Met

325 330 335

Glu Phe Arg Ala Tyr

340

Claims

1.一种与水稻抗逆性相关的OsERF65基因，其特征在于，所述OsERF65基因的序列如下列之一：

SEQ ID NO:1所示的DNA序列；

与SEQ ID NO:1至少90％同源的DNA序列；

功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。

2.根据权利要求1所述的OsERF65基因，其特征在于，所述的OsERF65基因的序列为如下列之一：

SEQ ID NO:1中第358-1383位所示的DNA序列；

或与SEQ ID NO:1中第358-1383位所示的DNA序列相似性达90％的DNA序列。

3.一种包含权利要求1或2所述OsERF65基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者为所述SEQ ID NO:2序列的同源序列、或保守性变异体、或等位变异体、或天然突变体、或诱导突变体。

4.一种包含权利要求1或2所述基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，构建所述重组载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。

6.一种包含权利要求1或2所述OsERF65基因的一种植物转化体。

7.根据权利要求6所述的转化体，其特征在于，所述转化体的宿主为水稻。

8.一种提高植物抗逆性中的应用，其特征在于，所述抗逆性中应用的植物包含权利要求1或2所述OsERF65的基因，所述植物为水稻。