CN112322622B - lncRNA17978在水稻抗病性改良中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及作物抗病品种培育，具体涉及lncRNA17978在水稻抗病性改良中的应用。本发明提供一种获得抗病性改良的水稻品种的方法，包括：在水稻受体材料中过量表达MIR396e的反义核苷酸序列，或降低水稻受体材料中lncRNA17978的转录水平，或敲除水稻受体材料中的lncRNA17978，获得转基因水稻植株。AS‑MIR396e过表达或lncRNA17978转录水平降低增强了植株对水稻白叶枯病的抗性水平。

Description

lncRNA17978在水稻抗病性改良中的应用
技术领域
本发明涉及作物抗病品种培育，具体涉及lncRNA17978在水稻抗病性改良中的应用。
背景技术
水稻是世界最主要的主粮作物之一，近50％的世界人口以稻米为主粮。水稻在整个生长期都面临着植物病害的潜在危害，包括细菌病害、真菌病害和病毒病害。水稻白叶枯病是由稻黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv oryzae，Xoo)引起的水稻最重要的细菌病害，通常造成减产10％-30％，严重的达到50％-70％甚至绝收。解决作物抗病性的最根本途径是培育抗病品种，而制约抗病品种培育的关键因素就是抗性资源的匮乏。随着生物技术的发展，抗性资源的利用从单一的利用正调控抗性的调控因子或基因，又逐渐扩展到了对负调控抗性的调控因子或基因的利用。通过RNAi、反义技术、CRISPR(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)等技术都可以阻断或减弱抗性负调控因子的作用，从而达到提高植物抗病性的目的。
生物体内除了拥有大量编码蛋白质的基因序列外，还存在着大量的非编码的RNA序列(noncoding RNA，ncRNA)，具有调控作用的ncRNA包括小干涉RNA(siRNA)、microRNA(miRNA)、Piwi-interacting RNA(piRNAs)以及长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)。随着测序技术的快速发展，大量的lncRNA序列被挖掘出来，但是对这些lncRNA的生物学功能研究得相对较少。有研究报道lncRNA在动物体内参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要调控过程；在植物体内，lncRNA参与了植物应对冷害、干旱胁迫的适应性调控，但目前对绝大部分lncRNA的功能仍然是不清楚的。
发明内容
我们发现降低lncRNA17978的转录水平能够显著提高水稻对白叶枯病的抗性，过表达lncRNA17978则导致一系列防卫反应基因如PR1a、PR1b、PR2、PR3、PR5以及WRKY45等的显著下调表达，表明lncRNA17978负调控水稻的抗病性。
基于此，本发明提供一种获得抗病性改良的水稻品种的方法，其包括：在水稻受体材料中过量表达MIR396e的反义核苷酸序列，或降低水稻受体材料中lncRNA17978的转录水平，或敲除水稻受体材料中的lncRNA17978，获得转基因水稻植株。
在一些实施例中，所述MIR396e的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在一些实施例中，向水稻受体材料中转入过量表达核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的基因片段的过表达载体，获得转基因水稻植株。
在一些实施例中，所述过表达载体通过农杆菌介导到水稻受体材料中。
在一些实施例中，所述水稻受体材料为日本晴(Oryza sativaL.cv.Nipponbare)。
在一些实施例中，所述lncRNA17978在水稻基因组中的位置为第10号染色体5651781～5652575bp。
在一些实施例中，所述水稻受体材料中的lncRNA17978的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
在一些实施例中，通过CRISPR、RNAi或反义序列的方法来降低水稻受体材料中lncRNA17978的转录水平或敲除水稻受体材料中的lncRNA17978。
在一些实施例中，本发明的方法还包括：将获得的转基因水稻植株与其它水稻植株进行杂交。
在一些实施例中，所述抗病性包括抗水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)，水稻细菌性条斑病(Xanthomonas oryzae pv.oryzecola,Xoc)，水稻稻瘟病(Magnaporthe oryzae,M.oryzae)。
我们在水稻材料日本晴(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)中过表达MIR396e的反义核苷酸序列(SEQ ID NO：4)，获得过表达AS-MIR396e植株。用剪叶法分别在过表达AS-MIR396e植株和野生型植株的叶片上接种水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)，接种后14天，发现过表达AS-MIR396e植株的叶片病斑长度显著短于野生型植株的叶片病斑长度(图1A、1B)，且病菌数量比野生型植株减少50％左右。这些结果表明AS-MIR396e增强了植株对水稻白叶枯病的抗性水平。
进一步地，我们通过转录分析发现，与野生型植株相比，过表达AS-MIR396e植株中AS-MIR396e的转录水平上调表达，上调幅度达到1000倍以上(图2A)。与野生型植株相比，过表达AS-MIR396e植株中lncRNA17978的转录水平均显著下调(图2B)，表明AS-MIR396e可能抑制lncRNA17978的转录表达。此外，与水处理相比，接种病菌Xoo后，lncRNA17978的表达水平明显上调(图2B)，表明lncRNA17978的转录与病菌侵染具有一定的关联性。
为了明确AS-MIR396e对lncRNA17978转录抑制的机制，我们分别利用水稻原生质体和烟草瞬时表达方法检测了AS-MIR396e对lncRNA17978的抑制作用。首先，以lncRNA17978上游2kb的序列作为lncRNA17978的启动子序列(lncRNA17978pro)，与荧光素酶基因(LUC)融合构建了lncRNA17978pro-LUC报告基因载体；以AS-MIR396e和MIR396e序列分别插入pUC-LUC和pCAMBIA1300-LUC中并替换掉LUC基因序列，形成AS-MIR396e和MIR396e的过表达载体(原生质体实验以pUC-LUC载体为基础，烟草瞬时表达实验以pCAMBIA-LUC为基础，都在35S启动子的驱动下)。然后，水稻原生质体中共转化pUC-lncRNA17978pro-LUC和pUC-35S-AS-MIR396e/pUC-35S-MIR396e，烟草上共表达pCAMBIA-lncRNA17978pro-LUC和pCAMBIA-35S-AS-MIR396e/pCAMBIA-35S-MIR396e，检测LUC的活性变化。结果表明，在水稻原生质体实验中，与pUC-35S-AS-MIR396e或pUC-35S-MIR396e共转化对对照载体pUC-LUC中的LUC活性并没有明显的影响，但却明显降低了pUC-lncRNA17978pro-LUC中的LUC活性，表明AS-MIR396e和MIR396e显著地抑制了lncRNA17978pro的表达活性(图3)。同样，在烟草瞬时表达实验中，与pCAMBIA-35S-AS-MIR396e或pCAMBIA-35S-MIR396e共转化对对照载体pCAMBIA-LUC的LUC活性并没有显著的影响，但却明显降低了pCAMBIA-lncRNA17978pro-LUC中的LUC活性，表明AS-MIR396e和MIR396e显著地抑制了lncRNA17978pro的转录活性(图4)。
植物抗病性伴随着一系列的防卫反应基因的表达，为了验证lncRNA17978在植物抗病性中的作用，我们在水稻原生质体中瞬时表达lncRNA17978，RT-qPCR转录分析表明防卫反应基因PR1a、PR1b、PR2、PR3、PR5以及WRKY45等显著下调表达，表明lncRNA17978负调控水稻的抗病性(图5)。
因此，lncRNA17978在水稻抗病性改良上具有重要的利用价值，通过降低lncRNA17978的转录水平，可显著提高水稻植株的抗病性。其中，降低lncRNA17978转录水平的具体方法包括但不限于通过CRISPR、RNAi、反义序列等技术手段。抗病性包括但不限于抗水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)，水稻细菌性条斑病(Xanthomonasoryzae pv.oryzecola,Xoc)，水稻稻瘟病(Magnaporthe oryzae,M.oryzae)。
附图说明
图1.过表达AS-MIR396e提高了水稻对白叶枯病的抗性；A.过表达AS-MIR396e植株和对照日本晴植株上接种Xoo病菌后产生的病斑情况，接种Xoo病菌后14天拍照；B.过表达AS-MIR396e植株和对照日本晴植株上接种Xoo病菌后产生的病斑长度统计情况，接种Xoo病菌后14天统计病斑长度；C.过表达AS-MIR396e植株和对照日本晴植株上接种Xoo病菌14天后，病菌数量统计分析情况。“日本晴”代表野生型植株，OE8和OE46为过表达AS-MIR396e的不同株系。**代表与对照日本晴植株相比具有显著性差异(P<0.01)，统计方法采用T-test测验。
图2.过表达AS-MIR396植株中AS-MIR396e和lncRNA17978的转录水平测定；A.过表达AS-MIR396材料上AS-MIR396e的转录水平；B.过表达AS-MIR396e材料上lncRNA17978的转录水平。“日本晴”代表野生型植株，OE8和OE46为过表达AS-MIR396e的不同株系。以H2O处理作为接种Xoo病菌的对照。*代表与对照日本晴植株相比具有显著性差异(**，P<0.01，***，P<0.0001)，统计方法采用T-test测验。
图3.水稻原生质体系统下AS-MIR396e对lncRNA17978转录活性的抑制；水稻原生质体共转化实验，同一反应中同时共转化2个质粒。35S-LUC代表pUC19-LUC，lncRNA17978pro-LUC代表pUC-lncRNA17978pro-LUC，Vec代表pUC-nLUC，AS-MIR396e代表pUC-35S-AS-MIR396e，MIR396e代表pUC-35S-MIR396e。35S-LUC作为lncRNA17978pro-LUC的对照。每个处理3次重复，实验已经有过多个生物学重复，且结果类似。
图4.烟草瞬时表达系统下AS-MIR396e对lncRNA17978转录活性的抑制；烟草瞬时表达实验，同时表达2个质粒，共转化的质粒组合如图所示。农杆菌处理后2天检测LUC活性。实验已经至少3个生物学重复，每次重复处理叶片数不少于7片，实验结果类似。图示括号中的“+”代表各处理的相对亮度，“+”越多则代表该处理的LUC活性比较强。图中Vec代表pCAMBIA-nLUC，pCAMBIA-AS-MIR396e代表pCAMBIA-35S-AS-MIR396e，pCAMBIA-MIR396e代表pCAMBIA-35S-MIR396e，35S-LUC代表pCAMBIA-LUC，lncRNA17978pro-LUC代表pCAMBIA-lncRNA17978pro-LUC。
图5.过表达lncRNA17978抑制了防卫反应基因的表达；A.水稻原生质体瞬时表达的lncRNA17978转录水平测定；B.瞬时表达lncRNA17978对防卫反应基因水平的影响；采用RT-qPCR方法检测lncRNA17978和防卫基因的转录水平。T-test分析lncRNA17978转化体和空白载体(Vec)转化体之间的差异显著性(**表示P<0.01)。图中Vec表示空白载体转化植株，lncRNA17978OE表示lncRNA17978过表达植株。
具体实施方式
下面结合实施例进一步描述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
生物材料
日本晴(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)，已知品种，研究用野生稻。
本氏烟草(Nicotiana benthamiana)，已知品种，研究中常用烟草。
水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)，PXO99A，研究中常用菌种(Yu et al.,2014)。
根癌农杆菌LBA4404和GV3101：已知菌种，本实验室保存，该菌种可商购获得。
上述生物材料本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
序列说明
lncRNA17978，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该序列是水稻数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中Chr10:5651781..5652575的反向互补序列；在GenBank对应AP014966中REGION:5651781..5652575的反向互补序列。lncRNA17978pro是lncRNA17978的上游序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，该序列是水稻数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中Chr10:5652592..5654558的反向互补序列；在GenBank对应AP014966中REGION:5652592..5654558的反向互补序列。
在miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)中，miR396e的序列号为MI0001703。MIR396e是包含miR396e序列的前体序列。MIR396e的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。AS-MIR396e是MIR396e的反义序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
出发载体
pCXUN(Chen et al.,2009)。
pUC-nLUC(Chen et al.,2008)：pUC-nLUC以pUC19为框架，利用EcoRI和SalI双酶切，插入35S启动子，然后再利用SalI和PstI插入nLUC片段(详见Chen et al.,2008)。nLUC片段为LUC基因N-端1-1249bp，LUC基因的GenBank登录号为XM_031473197.1。
pCAMBIA-nLUC(Chen et al.,2008)：pCAMBIA-nLUC是利用EcoRI和HindⅢ对pUC-nLUC进行双酶切，将切下的35S-nLUC插入同样双酶切的pCAMBIA1300中，其构建方法详见文献。
pUC19-LUC(胡积祥等，2019)：pUC19-LUC是以pUC-nLUC(Chen et al.,2008)为框架，利用SalI和PstI双酶切，插入LUC，其构建方法详见文献。
载体构建中所用到的原始载体均可商购获得。
载体构建
过表达载体AS-MIR396e：以pCXUN(Chen et al.,2009)为出发载体，扩增AS-MIR396e片段，插入pCXUN(XcmI消化)，筛选阳性克隆，即pCXUN-AS-MIR396e。
pUC-lncRNA17978pro-LUC：以pUC19-LUC(胡积祥等，2019)为出发载体，利用EcoRI-HF和KpnI-HF双酶切35S片段，插入同样酶切的lncRNA17978pro片段，得到pUC-lncRNA17978pro-LUC。
pUC-35S-AS-MIR396e：以pUC-nLUC(Chen et al.,2008)为出发载体，利用BamHI-HF和PstI-HF消化切除nLUC片段，插入AS-MIR396e片段，即得到pUC-35S-AS-MIR396e。
pUC-35S-MIR396e：以pUC-nLUC(Chen et al.,2008)为出发载体，利用BamHI-HF和PstI-HF消化切除nLUC片段，插入MIR396e片段，即得到pUC-35S-MIR396e。
pCAMBIA-lncRNA17978pro-LUC：将pUC-lncRNA17978pro-LUC用EcoRI-HF和PstI-HF酶切，切下的lncRNA17978pro-LUC片段插入EcoRI-HF和PstI-HF酶切的pCAMBIA-nLUC(切除了35S-nLUC)中，形成pCAMBIA-lncRNA17978pro-LUC；
pCAMBIA-35S-AS-MIR396e：将pUC-35S-AS-MIR396e用EcoRI-HF和PstI-HF酶切，切下的35S-AS-MIR396e片段插入EcoRI-HF和PstI-HF酶切的pCAMBIA-nLUC(切除了35S-nLUC)中，形成pCAMBIA-35S-AS-MIR396e；
pCAMBIA-35S-MIR396e：将pUC-35S-MIR396e用EcoRI-HF和PstI-HF酶切，切下的35S-MIR396e片段插入EcoRI-HF和PstI-HF酶切的pCAMBIA-nLUC(切除了35S-nLUC)中，形成pCAMBIA-35S-MIR396e；
pUC-35S-lncRNA17978：以pUC19-LUC(胡积祥等，2019)为出发载体，用BamHI-HF和SpeI-HF进行双酶切，插入同样酶切的lncRNA17978片段，形成pUC-35S-lncRNA17978。
主要试剂
实验中用到的引物委托北京六合华大基因科技服务有限公司合成。
限制性内切酶(包括BamHI-HF，EcoRI-HF，KpnI-HF，PstI-HF，SalI-HF，XcmI等)购自NEB公司；T4 DNA ligase购于北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖凝胶试剂盒(DP209)购于天根生化科技有限公司；TRIzol Regent(货号：15596-026)购自Invitrogen公司、SuperScriptTM III Reverse Transcriptase(货号：18080-044)购自Invitrogen公司、RealMaster Mix(SYBR Green I)购自天根生化科技有限公司、miRNA cDNA合成试剂盒(含Universal primer)(货号：AT351-01)购自北京全式金生物技术有限公司；其他试剂均采用常规国产分析纯。
若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得；使用的实验方法和实验条件均为本领域常规的实验方法和实验条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
实施例1.水稻材料中AS-MIR396e的过量表达
1、过表达AS-MIR396e植株的获得
(1)提取水稻基因组DNA
利用CTAB法提取水稻材料日本晴(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)的叶片基因组DNA。
(2)过表达载体的构建
利用引物AS-MIR396-F/AS-MIR396-R扩增AS-MIR396e。
AS-MIR396-F：CAACCACCTCTGCATCTTCTACTTCC；
AS-MIR396-R：GGAAGTAGAAGATGCAGAGGTGGTTG。
PCR扩增体系为：
Figure BDA0002781989520000051
Figure BDA0002781989520000061
PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃10min；10℃hold。
PCR扩增产物经普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根，DP209)纯化，纯化过程参见产品说明书。
pCXUN载体(Chen et al,2009)用XcmI进行消化，酶切产物利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根，DP209)纯化回收，纯化过程参见产品说明书。
酶切消化体系：
Figure BDA0002781989520000062
利用T4 DNA ligase(全式金)连接纯化的AS-MIR396e和XcmI酶切的pCXUN载体，连接反应体系如下：
Figure BDA0002781989520000063
筛选反向插入者，即得pCXUN-AS-MIR396e过表达载体。
(3)农杆菌转化
使用pCXUN-AS-MIR396e载体转化根癌农杆菌LBA4404后，通过农杆菌介导转化法转化进入水稻品种日本晴(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)中，获得AS-MIR396e过表达的阳性植株。
2、过表达AS-MIR396e植株的抗病性检测
用剪叶法(Yu et al，2018)在过表达AS-MIR396e植株上接种水稻白叶枯病菌(Xoo)PXO99A，检测植株的抗病性表现。以日本晴野生型植株为对照。接种病菌后14天进行拍照，统计植株上病斑长度、病菌数量。T-test分析过表达AS-MIR396e植株与野生型材料的差异显著性(**表示P<0.01；*表示P<0.05)。病菌数量的统计方法参考文献Yu et al，2018中记载的方法。
结果如图1所示，A.过表达AS-MIR396e植株和对照日本晴植株上接种Xoo病菌后产生的病斑情况，接种Xoo病菌后14天拍照；B.过表达AS-MIR396e植株和对照日本晴植株上接种Xoo病菌后产生的病斑长度统计情况，接种Xoo病菌后14天统计病斑长度；C.过表达AS-MIR396e植株和对照日本晴植株上接种Xoo病菌14天后，病菌数量统计分析情况。OE8和OE46为过表达AS-MIR396e的不同株系。
结果表明，过表达AS-MIR396e植株的病害症状较对照日本晴轻(图1A)，病斑长度的数量统计也表明过表达AS-MIR396e植株上的病斑长度约为6～7cm，显著短于对照日本晴上10cm左右的病斑长度(图1B)；进一步的病菌数量分析表明过表达AS-MIR396e植株上的病菌数量比对照减少50％左右(图1C)。这些结果都表明过表达AS-MIR396e增强了植株对水稻白叶枯病的抗性水平。
实施例2.过表达AS-MIR396e植株中AS-MIR396e和lncRNA17978的转录水平分析
水稻植株总RNA的提取采用TRIzol法，具体步骤参照TRIzol Regent(Invitrogen，15596-026)产品说明书。使用SuperScriptTM III Reverse Transcriptase(Invitrogen，18080-044)，参照产品说明书记载的步骤对提取的总RNA进行反转录，获得反转录产物。以反转录产物作为模板，采用RT-qPCR方法分析AS-MIR396e转录水平及lncRNA17978转录水平。转录分析按照2-ΔΔCt法计算，其中ΔΔCt＝(Ct样品-CtActin)TimeX-(Ct对照样品-CtActin)Time0，X可为任意时间点，Ct为荧光阈值。以H2O处理作为接种病菌Xoo的对照。
RT-qPCR用引物及序列：
MIR396e-qRT-F1:ATGTTGGGATTGTGGTCGG；
MIR396e-qRT-R1:CAAAGACAGAACGGGGAGC。
lncRNA17978-qRT-F：GGTATGGATTACAACTTGGCACTG；
lncRNA17978-qRT-R：GGAACAATAACACTATGGCGAACA。
Actin-qRT-F：TCTTACGGAGGCTCCACTTAAC；
Actin-qRT-R：TCCACTAGCATAGAGGGAAAGC。
上述引物中，MIR396e-qRT-F1/R1用于检测MIR396e的转录水平，lncRNA17978-qRT-F/R用于检测lncRNA17978的转录水平，Actin-qRT-F/R做为参照。
qPCR反应体系为：
Figure BDA0002781989520000071
qPCR扩增条件为：95℃10min；95℃15s，60℃60s，40个循环。
结果如图2所示，A为过表达AS-MIR396e植株中AS-MIR396e的转录水平分析，B为过表达AS-MIR396e植株中lncRNA17978的转录水平分析。OE8和OE46为过表达AS-MIR396e的不同株系。以H2O处理作为接种Xoo病菌的对照。*代表与对照日本晴植株相比具有显著性差异(**，P<0.01，***，P<0.0001)，统计方法采用T-test测验。
转录分析表明，与野生型植株相比，过表达AS-MIR396e植株中AS-MIR396e的转录水平上调表达，上调幅度达到1000倍以上(图2A)。与野生型植株相比，过表达AS-MIR396e植株中lncRNA17978的转录水平都呈显著下调表达，且具有显著差异(图2B)，表明AS-MIR396e抑制了lncRNA17978的转录。此外，与水处理相比，接种病菌Xoo后，lncRNA17978的表达水平明显上调(图2B)，表明lncRNA17978受病菌侵染刺激而上调表达。
实施例3.Anti-MIR396e抑制了lncRNA17978的转录表达
为了明确AS-MIR396e对lncRNA17978转录抑制的机制，分别利用水稻原生质体和烟草瞬时表达方法检测AS-MIR396e对lncRNA17978的抑制作用。
1.水稻原生质体实验
1.1载体构建
原生质体实验以pUC19-LUC载体(胡积祥等，2019)或pUC-nLUC载体(Chen et al.,2008)为基础，以lncRNA17978上游2kb的序列作为lncRNA17978的启动子序列(即lncRNA17978pro序列，SEQ ID NO：2)，与荧光素酶基因(LUC)融合构建报告基因载体pUC-lncRNA17978pro-LUC。以pUC-nLUC载体(Chen et al.,2008)为基础，用AS-MIR396e和MIR396e序列分别替换pUC-nLUC中的nLUC片段，获得pUC-35S-MIR396e和pUC-35S-AS-MIR396e。
1.1.1构建载体pUC-lncRNA17978pro-LUC
lncRNA17978pro的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。利用CTAB法提取水稻材料日本晴(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)的叶片基因组DNA，以基因组DNA为PCR模板，扩增lncRNA17978pro片段，扩增用特异性引物如下：
lncRNA17978pro-F:ataGAATTCattgtttttgctgcttgctgc；
lncRNA17978pro-R:ataGGTACCgggtgaataggctgtccctga。
PCR扩增体系为：
Figure BDA0002781989520000081
PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃10min；10℃hold。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，对1967bp的目的条带进行切胶回收，获得lncRNA17978pro片段。
EcoRI-HF(NEB，货号：R3101S)和KpnI-HF(NEB，货号：R3138L)限制性内切酶分别对pUC19-LUC载体(胡积祥等，2019)(通过双酶切，切除该载体中的35S片段)和lncRNA17978pro片段进行双酶切，37℃酶切30min。
酶切消化体系：
Figure BDA0002781989520000082
Figure BDA0002781989520000091
采用琼脂糖凝胶电泳，使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根，DP209)切胶回收消化后的pUC19-LUC和lncRNA17978pro片段，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。
使用T4 DNA Ligase(全式金)，按照如下体系和条件对pUC19-LUC线性载体和lncRNA17978pro酶切产物进行连接。
连接反应体系：
Figure BDA0002781989520000092
16℃连接过夜，转化筛选阳性克隆，获得pUC-lncRNA17978pro-LUC。
1.1.2构建载体pUC-35S-AS-MIR396e
AS-MIR396e的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。利用CTAB法提取水稻材料日本晴(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)的叶片基因组DNA，以基因组DNA为PCR模板，扩增MIR396e片段，扩增用特异性引物如下：
AS-MIR396-F:ataGGATCCattacgccccagagagccaaaaac；
AS-MIR396-R:ataCTGCAGcaaccacctctgcatcttctacttcc。
PCR扩增体系为：
Figure BDA0002781989520000093
PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃10min；10℃hold。
琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，对目的条带进行切胶回收，获得AS-MIR396e片段。利用BamHI-HF(NEB，货号：R3136S)和PstI-HF(NEB，货号：R3140S)限制性内切酶分别对出发载体pUC-nLUC(Chen et al.,2008)(通过双酶切，切除该载体中的nLUC)及AS-MIR396e片段进行双酶切，37℃酶切30min。
酶切消化体系：
Figure BDA0002781989520000094
Figure BDA0002781989520000101
琼脂糖凝胶电泳后，使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根，DP209)切胶回收消化后得到的pUC线性载体和AS-MIR396e片段，具体操作步骤参照说明书进行。使用T4DNALigase(全式金)，按照如下体系和条件对pUC线性载体和AS-MIR396e酶切产物进行连接。
连接反应体系：
Figure BDA0002781989520000102
16℃连接过夜，转化筛选阳性克隆，获得pUC-35S-AS-MIR396e。
1.1.3构建载体pUC-35S-MIR396e
MIR396e核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。以日本晴(Oryza sativaL.cv.Nipponbare)的叶片基因组DNA为模板，扩增MIR396e片段，扩增用的特异性引物如下：
MIR396-F:ataGGATCCcaaccacctctgcatcttctacttcc；
MIR396-R:ataCTGCAGattacgccccagagagccaaaaac。
PCR扩增体系为：
Figure BDA0002781989520000103
PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃10min；10℃hold。
琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，目的条带进行切胶回收，获得MIR396e片段。利用BamHI-HF(NEB，货号：R3136S)和PstI-HF(NEB，货号：R3140S)限制性内切酶分别对出发载体pUC-nLUC(Chen et al.,2008)(通过双酶切，切除该载体中的nLUC)和MIR396e片段进行双酶切，37℃酶切30min。
酶切消化体系：
Figure BDA0002781989520000104
Figure BDA0002781989520000111
采用琼脂糖凝胶电泳，切胶回收消化后得到的pUC线性载体和MIR396e片段，具体操作步骤参照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根，DP209)说明书进行。使用T4 DNALigase(全式金)，按照如下体系和条件对pUC线性载体和MIR396e酶切产物进行连接。
连接反应体系：
Figure BDA0002781989520000112
16℃连接过夜，转化筛选阳性克隆，获得pUC-35S-MIR396e。
1.2水稻原生质体转化
lncRNA17978pro-LUC实验组
实验1组：使用pUC-lncRNA17978pro-LUC和空白载体(pUC-nLUC)共转化水稻原生质体。
实验2组：使用pUC-lncRNA17978pro-LUC和pUC-35S-AS-MIR396e共转化水稻原生质体。
实验3组：使用pUC-lncRNA17978pro-LUC和pUC-35S-MIR396e共转化水稻原生质体。
35S-LUC对照组
对照1组：使用pUC19-LUC和空白载体(pUC-nLUC)共转化水稻原生质体。
对照2组：使用pUC19-LUC和pUC-35S-AS-MIR396e共转化水稻原生质体。
对照3组：使用pUC19-LUC和pUC-35S-MIR396e共转化水稻原生质体。
水稻原生质体的分离和转化分别采用酶裂解法和PEG介导法(Yu et al.,2018；胡积祥等,2019)。荧光素酶活性检测采用植物活体成像系统(德国，Berthold Technologies，Nightshade LB985)。
图3显示了水稻原生质体共转化实验结果，同一反应中同时共转化2个质粒。其中35S-LUC为lncRNA17978pro-LUC的对照，Vec代表空白载体(pUC-nLUC)。每个处理3次重复，实验已经有过多个生物学重复，且结果类似。可以看出，在水稻原生质体中，与pUC-35S-AS-MIR396e或pUC-35S-MIR396e共转化对pUC19-LUC中的LUC活性并没有明显的影响，但却明显抑制了pUC-lncRNA17978pro-LUC中的LUC活性，表明AS-MIR396e和MIR396e能够特异地抑制lncRNA17978pro的转录活性(图3)。
2.烟草瞬时表达实验
2.1载体构建
烟草瞬时表达相关载体以pCAMBIA-LUC载体(胡积祥等，2019)和pCAMBIA-nLUC(Chen et al.,2008)为基础。
2.1.1构建载体pCAMBIA-lncRNA17978pro-LUC
通过亚克隆将pUC-lncRNA17978pro-LUC中的lncRNA17978pro-LUC片段插入pCAMBIA-LUC载体中，形成pCAMBIA-lncRNA17978pro-LUC。相关操作如下：用EcoRI-HF和PstI-HF分别双酶切pCAMBIA-LUC(切除35S-LUC片段)、pUC-lncRNA17978pro-LUC(切下lncRNA17978pro-LUC片段)，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收相应片段，进行连接反应，筛选阳性克隆，获得pCAMBIA-lncRNA17978pro-LUC载体。相关酶切、回收、连接反应参照水稻原生质体实验。
2.1.2构建载体pCAMBIA-35S-AS-MIR396e
通过亚克隆将pUC-35S-AS-MIR396e中的35S-AS-MIR396e片段插入pCAMBIA-nLUC载体中，形成pCAMBIA-35S-AS-MIR396e。相关操作如下：用EcoRI-HF和PstI-HF分别双酶切pCAMBIA-nLUC(切除35S-nLUC片段)、pUC-35S-AS-MIR396e(切下35S-AS-MIR396e片段)，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收相应片段，进行连接反应，筛选阳性克隆，获得pCAMBIA-35S-AS-MIR396e载体。相关酶切、回收、连接反应参照水稻原生质体实验。
2.1.3构建载体pCAMBIA-35S-MIR396
通过亚克隆将pUC-35S-MIR396e中的35S-MIR396e片段插入pCAMBIA-nLUC载体中，形成pCAMBIA-35S-MIR396e。相关操作如下：用EcoRI-HF和PstI-HF分别双酶切pCAMBIA-nLUC(切除35S-nLUC片段)、pUC-35S-MIR396e(切下35S-MIR396e片段)，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收相应片段，进行连接反应，筛选阳性克隆，获得pCAMBIA-35S-MIR396e载体。相关酶切、回收、连接反应参照水稻原生质体实验。
2.2烟草瞬时表达
烟草瞬时表达方法参见相关文献(Chen et al.,2008；胡积祥等，2019)。主要步骤是将相关质粒转化农杆菌菌株GV3101，分别培养含相应质粒的农杆菌菌株；将相应农杆菌菌株两两混合后，用无针头的注射器注射进烟草叶片中，各农杆菌的最终浓度为OD600＝0.5；注射2天后检测LUC活性情况。荧光素酶活性检测采用植物活体成像系统(德国，Berthold Technologies，Nightshade LB985)。
lncRNA17978pro-LUC实验组
实验1组：在烟草上共表达pCAMBIA-lncRNA17978pro-LUC和空白载体(pCAMBIA-nLUC)。
实验2组：在烟草上共表达pCAMBIA-lncRNA17978pro-LUC和pCAMBIA-35S-AS-MIR396e。
实验3组：在烟草上共表达pCAMBIA-lncRNA17978pro-LUC和pCAMBIA-35S-MIR396e。
35S-LUC对照组
对照1组：在烟草上共表达pCAMBIA-LUC和空白载体(pCAMBIA-nLUC)。
对照2组：在烟草上共表达pCAMBIA-LUC和pUC-35S-AS-MIR396e。
对照3组：在烟草上共表达pCAMBIA-LUC和pUC-35S-MIR396e。
图4显示了烟草瞬时表达实验结果，同时表达2个质粒，共转化的质粒组合如图所示。农杆菌处理后2天检测LUC活性。实验已经至少3个生物学重复，每次重复处理叶片数不少于7片，实验结果类似。图示括号中的“+”代表各处理的相对亮度，“+”越多则代表该处理的LUC活性越强。可以看出，在烟草瞬时表达中，pCAMBIA-35S-AS-MIR396e或pCAMBIA-35S-MIR396e共转化对pCAMBIA-LUC中的LUC活性并没有显著的影响，但却明显抑制了pCAMBIA-lncRNA17978pro-LUC中lncRNA17978pro-LUC的活性，表明AS-MIR396e和MIR396e可以显著地抑制lncRNA17978pro的转录活性(图4)。
实施例4.过表达lncRNA17978抑制了防卫反应基因的表达
植物抗病性伴随着一系列的防卫反应基因的表达，为了验证lncRNA17978在植物抗病性中的作用，在水稻原生质体中瞬时表达lncRNA17978，采用RT-qPCR方法检测lncRNA17978和防卫反应基因PR1a(Genebank登录号：AJ278436.1)、PR1b(Genebank登录号：XM_015790271.2)、PR2(Genebank登录号：AY323485.1)、PR3(Genebank登录号：AB054687.1)、PR5(Genebank登录号：AY538589.1)以及WRKY45(Genebank登录号：AY870611.1)的转录水平。
pUC-35S-lncRNA17978载体构建：lncRNA17978的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。利用CTAB法提取水稻材料日本晴(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)的叶片基因组DNA，以基因组DNA为PCR模板，扩增lncRNA17978片段，扩增用特异性引物如下：
lncRNA17978-F:ataGCATGCcttcatcagcgcgttcatttc；
lncRNA17978-R:ataACTAGTctaccatgcattaatttcttttaagac。
PCR扩增体系为：
Figure BDA0002781989520000131
PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃10min；10℃hold。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，对目的条带进行切胶回收，获得lncRNA17978片段。BamHI-HF(NEB，货号：R3136S)和SpeI-HF(NEB，货号：R3133S)限制性内切酶分别对pUC19-LUC载体(胡积祥等，2019)和lncRNA17978片段进行双酶切，37℃酶切30min。
酶切消化体系：
Figure BDA0002781989520000132
采用琼脂糖凝胶电泳，使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根，DP209)切胶回收消化后的pUC19-LUC和lncRNA17978片段，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。使用T4DNA Ligase(全式金)，按照如下体系和条件对pUC19-LUC线性载体和lncRNA17978酶切产物进行连接。
连接反应体系：
Figure BDA0002781989520000141
16℃连接过夜，转化筛选阳性克隆，获得pUC-35S-lncRNA17978载体。
使用pUC-35S-lncRNA17978载体转化水稻原生质体。水稻原生质体的分离和转化分别采用酶裂解法和PEG介导法(参见Yu et al.,2018；胡积祥等,2019)。水稻植株总RNA的提取采用TRIzol法，具体步骤参照TRIzol Regent(Invitrogen，15596-026)产品说明书。使用SuperScriptTM III Reverse Transcriptase(Invitrogen，18080-044)，参照产品说明书记载的步骤对提取的总RNA进行反转录，获得反转录产物。以反转录产物作为模板，qPCR分析lncRNA17978和防卫反应基因PR1a、PR1b、PR2、PR3、PR5以及WRKY45的转录水平。以空白载体(pUC19-LUC)转化作为对照。
RT-qPCR用引物及序列：
lncRNA17978-qRT-F：GGTATGGATTACAACTTGGCACTG；
lncRNA17978-qRT-R：GGAACAATAACACTATGGCGAACA。
PR1a-qRT-F:GGCCAATCTCCCTACTGATTAA；
PR1a-qRT-R:GCATAAACACGTAGCATAGCAT。
PR1b-qRT-F:CGATCAGCGCCCTTACTAGC；
PR1b-qRT-R:ACACACAATCCGGCTACATAGAT。
PR2-qRT-F:CAAATCTTGATGATGCGTTTGC；
PR2-qRT-R:CATCGAATGTAACATCTGCTGG。
PR3-qRT-F:TTGTGACAAGAGCAACAAACAG；
PR3-qRT-R:GTTGAAGTTCCATGAGATCTGC。
PR5-qRT-F:CAACAGCAACTACCAAGTCGTCTT；
PR5-qRT-R:CAAGGTGTCGTTTTATTCATCAACTTT。
WRKY45-qRT-F:GGACGCAGCAATCGTCCGGG；
WRKY45-qRT-R:CGGAAGTAGGCCTTTGGGTGC。
Actin-qRT-F:TCTTACGGAGGCTCCACTTAAC；
Actin-qRT-R:TCCACTAGCATAGAGGGAAAGC。
结果如图5所示，A.水稻原生质体瞬时表达的lncRNA17978转录水平测定；B.瞬时表达lncRNA17978对防卫反应基因水平的影响。T-test分析lncRNA17978转化体和空白载体(Vec)转化体之间的差异显著性(**表示P<0.01)。可以看出，在水稻原生质体中过表达lncRNA17978后，防卫反应基因PR1a、PR1b、PR2、PR3、PR5以及WRKY45等显著下调表达，表明lncRNA17978负调控水稻的抗病性。
参考文献：
Chen H,Zou Y,Shang Y,Lin H,Wang Y,Cai R,Tang X,Zhou JM*:Fireflyluciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions inplants.Plant physiology 2008,146(2):368-376.
Chen S,Songkumarn P,Liu J,Wang GL:A versatile zero background T-vector system for gene cloning and functional genomics.Plant Physiol 2009,150(3):1111-1121.
Yu C,Chen Y,Cao Y,Chen H*,Wang J,Bi YM,Tian F,Yang F,Rothstein SJ,Zhou X et al:Overexpression of miR169o,an Overlapping MicroRNA in Response toBoth Nitrogen Limitation and Bacterial Infection,Promotes Nitrogen UseEfficiency and Susceptibility to Bacterial Blight in Rice.Plant Cell Physiol2018,59(6):1234-1247.
胡积祥#，曹雅倩#，朱秀梅，余超，田芳，杨凤环，陈华民*，何晨阳。基于瞬时表达系统的水稻miRNA靶基因快速验证系统的建立。生物技术通报2019,35(10):57-63.
Yu,C.,H.Chen,F.Tian,J.E.Leach and C.He*(2014)."Differentially-expressed genes in rice infected by Xanthomonas oryzae pv.oryzae relative toa flagellin-deficient mutant reveal potential functions of flagellin in host-pathogen interactions."Rice(N Y)7(1):20.。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> lncRNA17978在水稻抗病性改良中的应用
<130> P200552-ZWB
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 795
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
cttcatcagc gcgttcattt ctgttttaat aattaacttt tttttgcata tgtctttctt 60
gaattatggg gtggttctta tttttttggt atatgtaaac agaacctgaa catcagattt 120
aatgagagat tcaaccaaga agctgaaatt ttttacaact gatgtgcatt gctaaaccag 180
ttttctgttg cataaagagt cctgaaactt cttgttgcaa actgaagtga tgtttaacaa 240
ttttccattg gagctttcac tggtttcttc agaactgaaa tcttgttttc tcatcagctt 300
ctcttgcatc tttctgcaag gtttctttca tgtagggaaa ggaaatgtga ttttagttac 360
ctgactgctg ccgcaatctg cgaagcatct acaagcgatg ccatcggttc aggcagctgg 420
cacggcaatg ccggttcccc ttgcctccat atccaactcc tcttgttcca tttacacctc 480
ccgatggtat ggattacaac ttggcactgc aagaacacag ctactttttt gagttttttt 540
tccctgatgt tggttggtca cctagaaatg ttggcctaag tgttatttga tatttctcac 600
gaccattcaa aaaattgaat ctttcccaag atgtacatgc catagtgttc gccatagtgt 660
tattgttcct ggttcagagg ttgcagttta ttctgctcat agaaatcctg aaagtttaga 720
gaactccctg ttgagaaaat ggaagttttt ttactgctga gttttgttgt cttaaaagaa 780
attaatgcat ggtag 795
<210> 2
<211> 1967
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 2
attgtttttg ctgcttgctg cctactccgt ctgtttatcc ggaagttccg gatcctctta 60
tctggaagtt ccgaacctgg cagctccctc gctatttatt cctgtcaaca tgtccggaag 120
ttccgggttt tttatccgga agttccggac ctggcagtcc tttggcctct tctcttaaga 180
acttatggac atgtaataat tctctatttg tgtggatgta atgtctgtta gatgctctta 240
gctgctcttt atatatattg cacttcattt atgctattag tgtcttattt gttgattgtg 300
atgtgatgtt gattttatcc ttttgaatgc tcaccatgtc gtatcttttg catatcatat 360
ctattcttac tgtttatttg catcccacga atgagtagag atgaaggaaa ctctcctcgg 420
ttgctccctt ataaatatgc atatgagctt cactcatatc ttccatatgc atacactaag 480
ggggagtttc attcacctct aactattcaa aacaaaattt atttcaatct tttgtaagct 540
ttaaccatgt tgtcatcaat caccaaaaag ggggagattg aaagtgcatt aatcccccta 600
gtgggttttg gtgattcatg acaaatgtgg ttaagggatt aatgagttca ttgagtaact 660
ttcaggtgca ttagtccaaa ggtgtggaag atggatgctt ggagaccccc caaaagtaca 720
aaatcaaagc ggaccggaac tcgagaagtg cataggatag tttatctttt gaaatcgagt 780
ttttaggaaa aaccgtacta ttaagagggg ttccaggtga tgatctgaga tatgtcaagt 840
gctcttagtg tgaaccaagt gtcaagtttc cctaggagtc ttttttgcat atactccatc 900
tgtccaaaag tgcaagtccg gaacttcctg tcttccaggt ccaaaagttc cggtcttgtg 960
aaaaagattt tcctaagtgt agtccggaag ttcctgtctt ccaggtccgg aacttcctgt 1020
ctagtttcca gttcaaaatt atgagtaacg gctagatgtc gtcacctagc cgttatacat 1080
atacagctcg tttccagctc gttccttggc cattccactt tcacttttca aacctagagc 1140
tgttgctagc ctctcccaag tgtttcttgc cttctccact caatctagag cctaattctt 1200
gtgagaaaga gagattgaga ggtagagaag aagatttggg gaggtgtgaa gactaggaac 1260
ttgtgtgagc acttggaata tctcgtgggc tgtcatctcg gtgcttatta ctcttggaga 1320
tgatctccta gacggttagg tgtcgcccgc gagaatccgt tgcatattgt ggatgtcccg 1380
ggtaagtttg tgaatgattt cctctcctcc gaaagggaac gaggtaagtt agtgaagttc 1440
ttgtgctgag attctagagg ctttccaagt agagcaaccc acacttgtgg tggatttcta 1500
gaagtaggtt gagttggatc ttggtggtca ctcaattcta gaaacttgcc taggggtgtt 1560
tggggttgaa ggctgtggat ttcctctggg gtttttgcac aagtgaggca aggggttaat 1620
cgagacccag ctctttggag ctcctcaacg gagagtagga tcgcaagatc cgaactttgg 1680
gaaaaaatcg ctcttgtctc tttctgtgat atttctgtgg atgattctgt gatatatcct 1740
cttcttagaa tacctgtgca ccatcttgtg aagattggct tagtctcctg tttttaaatt 1800
tgaatttcat ctctgttctg ttacccggaa gttcatgtct tagaacaccg gaagttccgg 1860
gcctgggagg ccggaagttc cggagttcct taccaggaag ttctgggtct gtttgaattt 1920
taccgatgcg atttgttttt aagttttcag ggacagccta ttcaccc 1967
<210> 3
<211> 428
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 3
caaccacctc tgcatcttct acttcctctc tctctttcta gatagttttc ttgctgttct 60
tgggtggtgg tggtggtggt gatgatgtga tgaggtgaga attgtgatgt ggggggaaag 120
atgtgcgggc atgctttcca caggctttct tgaactgtga actcgtgggg gtgtatgtgc 180
tcatgttggg attgtggtcg gtggcctcca attctctgaa aagaaagctg aattgtcgag 240
ctccccgttc tgtctttggt cgtctctacc tgttgatggt tcaagaaagc ccatggaaac 300
catgccgcgt ctttgtgtgc ttcccgttcc gccatccgga gaattccggc cacacagatc 360
cctggggggg ttgaattctg tggttttggt tctgaatttg gatggttttt ggctctctgg 420
ggcgtaat 428
<210> 4
<211> 428
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 4
attacgcccc agagagccaa aaaccatcca aattcagaac caaaaccaca gaattcaacc 60
cccccaggga tctgtgtggc cggaattctc cggatggcgg aacgggaagc acacaaagac 120
gcggcatggt ttccatgggc tttcttgaac catcaacagg tagagacgac caaagacaga 180
acggggagct cgacaattca gctttctttt cagagaattg gaggccaccg accacaatcc 240
caacatgagc acatacaccc ccacgagttc acagttcaag aaagcctgtg gaaagcatgc 300
ccgcacatct ttccccccac atcacaattc tcacctcatc acatcatcac caccaccacc 360
accacccaag aacagcaaga aaactatcta gaaagagaga gaggaagtag aagatgcaga 420
ggtggttg 428
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ataggatcca ttacgcccca gagagccaaa aac 33
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atactgcagc aaccacctct gcatcttcta cttcc 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ataggatccc aaccacctct gcatcttcta cttcc 35
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atactgcaga ttacgcccca gagagccaaa aac 33
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atagcatgcc ttcatcagcg cgttcatttc 30
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ataactagtc taccatgcat taatttcttt taagac 36
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atagaattca ttgtttttgc tgcttgctgc 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ataggtaccg ggtgaatagg ctgtccctga 30
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgttgggat tgtggtcgg 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caaagacaga acggggagc 19
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtatggatt acaacttggc actg 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggaacaataa cactatggcg aaca 24
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggccaatctc cctactgatt aa 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcataaacac gtagcatagc at 22
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgatcagcgc ccttactagc 20
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acacacaatc cggctacata gat 23
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caaatcttga tgatgcgttt gc 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
catcgaatgt aacatctgct gg 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ttgtgacaag agcaacaaac ag 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gttgaagttc catgagatct gc 22
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
caacagcaac taccaagtcg tctt 24
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
caaggtgtcg ttttattcat caacttt 27
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggacgcagca atcgtccggg 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cggaagtagg cctttgggtg c 21
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcttacggag gctccactta ac 22
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tccactagca tagagggaaa gc 22
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
caaccacctc tgcatcttct acttcc 26
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggaagtagaa gatgcagagg tggttg 26

Claims (8)

1.一种获得抗病性改良的水稻品种的方法，其特征在于，包括：在水稻受体材料中过量表达MIR396e的反义核苷酸序列，或降低水稻受体材料中的lncRNA17978的转录水平，或敲除水稻受体材料中的lncRNA17978，获得转基因水稻植株；
所述MIR396e的反义核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述水稻受体材料中的lncRNA17978的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述抗病性为抗水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MIR396e的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，向水稻受体材料中转入过量表达核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的基因片段的过表达载体，获得转基因水稻植株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述过表达载体通过农杆菌介导到水稻受体材料中。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻受体材料为日本晴(Oryzasativa L.cv.Nipponbare)。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述lncRNA17978在水稻基因组中的位置为第10号染色体5651781～5652575bp。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过CRISPR、RNAi或反义序列的方法来降低水稻受体材料中lncRNA17978的转录水平或敲除水稻受体材料中的lncRNA17978。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：将获得的转基因水稻植株与其它水稻植株进行杂交。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105903035A (zh) * 2015-07-09 2016-08-31 上海市中西医结合医院 植物药miRNA396家族的应用
CN108660245A (zh) * 2018-05-21 2018-10-16 浙江农林大学 miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的应用
CN110551719A (zh) * 2019-07-30 2019-12-10 中山大学 长链非编码rna基因alex1及其在提高水稻白叶枯病抗性中的应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10023873B2 (en) * 2014-10-14 2018-07-17 Clemson University Methods and compositions for transgenic plants with enhanced cold tolerance, ability to flower without vernalization requirement and impacted fertility

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105903035A (zh) * 2015-07-09 2016-08-31 上海市中西医结合医院 植物药miRNA396家族的应用
CN108660245A (zh) * 2018-05-21 2018-10-16 浙江农林大学 miR396e和miR396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的应用
CN110551719A (zh) * 2019-07-30 2019-12-10 中山大学 长链非编码rna基因alex1及其在提高水稻白叶枯病抗性中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
miR396-OsGRFs Module Balances Growth and Rice Blast Disease-Resistance;Chandran et al.;《Frontiers in Plant Science》;20190131;第9卷;全文 *
Non-coding RNAs as emerging targets for crop improvement;Aarohi Summanwar et al.;《Plant Sci.》;20200518;全文 *
The OsmiR396–OsGRF8–OsF3H-flavonoid pathway mediates resistance to the brown planthopper in rice (Oryza sativa);Zhengyan Dai et al.;《Plant Biotechnology Journal》;20191231;第17卷;1657-1669 *

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