CN111948181A - 利用烟草双荧光素酶报告系统检测ath-miRNA170-3p靶向MSH2的方法 - Google Patents

利用烟草双荧光素酶报告系统检测ath-miRNA170-3p靶向MSH2的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体为一种利用烟草双荧光素酶报告系统检测ath‑miRNA170‑3p靶向MSH2的验证方法。烟草双荧光素酶报告系统包含荧光虫荧光素酶(F‑Luc)和海肾荧光素酶(R‑Luc)；其中，R‑Luc作为内参，且F‑Luc的3′UTR区域中嵌入限制性酶切位点AvrII和AgeI。本发明方法有助于ath‑miRNA170‑3p调控拟南芥MSH2基因表达机理的阐明及生物标记物的筛选，对于ath‑miRNA170‑3p调控拟南芥MSH2基因响应逆境胁迫的研究具有重要意义。

Description

利用烟草双荧光素酶报告系统检测ath-miRNA170-3p靶向 MSH2的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种利用烟草双荧光素酶报告系统检测ath-miRNA170-3p靶向MSH2的验证方法。
背景技术
小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类约22个核苷酸(nt)、高度保守的内源性非编码单链小RNA。其表达具有明显的组织和时间特异性，能够互补或部分互补的与靶基因mRNA3'端非翻译区域(3'UTR)的特定序列结合，诱导靶基因mRNA被剪切或抑制其翻译，从而在转录后水平调控生物的生长、发育和对逆境的响应(Crosby等，2009；Noman等，2017；Sarver等，2009；Orangi等，2019)。成熟的miRNAs可以同时封闭多个靶基因的翻译，干预miRNAs可改变多个靶基因的表达水平，而且调控效率非常高(Orangi等，2019)。例如，人结肠直肠癌(CRC)细胞系中，miRNA-21过表达明显下调了MSH2和MSH6蛋白质的表达；然而，miR-21表达降低则明显增加了这2种蛋白质的表达(Bhandari et al.,2013；Valeri et al.,2010a)。双荧光素酶检测结果表明，miRNA-155可以靶向人CRC细胞系中MLH1、hMSH2和hMSH6基因mRNAs的3’UTR区域，从而降低其相应编码蛋白质的表达(Valeri等,2010b)。同样，人CRC肿瘤活组织检查结果表明，miRNA155过表达与MSH2和MLH1蛋白质表降低之间呈现显著的负相关(Valeri等,2010b)(Li等,2016；Santos等，2017；Svrcek等，2013)。研究表明，干旱/盐/低温/紫外线B胁迫下，拟南芥细胞内miRNA170的表达上调；干旱胁迫下，胡扬细胞内miRNA170的表达亦增加；但是，干旱胁迫下，胡杨/杨树/小麦细胞内miRNA170的表达下调；盐/低温/高温胁迫下，毛果杨细胞内miRNA170的表达下调；低温胁迫下，水稻细胞内miRNA170的表达亦下调(Sunkar等，2012)。植物中，miRNA170可以靶向GRAS家族或SCARECROW-like蛋白的mRNA 3’UTR区域，2者均为转录因子家族、参与根系形态建成、赤霉素和光信号传导等(Rhoades等，2002)。
DNA错配修复(MMR)系统是一种DNA复制后修复，在激活细胞周期检验点、确保基因组的稳定性和DNA复制的精确性,以及修复镉诱导的DNA损伤等方面发挥关键作用(Edelbrocka等，2013；Cao等，2018；Hassen等，2016)。植物DNA MMR家族为MutS-MutL系统，其中与DNA MMR反应有关的MutS同系物(MSH)为MSH2、MSH3、MSH6和MSH7，MutL同系物(MLH)为MLH1,MLH3和PMS1。我们前期研究工作表明,Cd胁迫对拟南芥野生型DNA MMR关键基因的抑制作用呈现明显的剂量-效应关系。但是拟南芥基因敲除突变体MSH2-KO、MSH6-KO、MLH1-KO在较高浓度Cd暴露下，其DNA MMR系统依然维持了识别/传递DNA损伤信号、调节细胞周期检验点的功能；我们亦发现MSH2和MSH6是镉诱导DNA损伤的关键感受器，直接参与DNA损伤的识别/传递与G2/M期阻滞,而MLH1不参与此过程(Cao等，2018)。本实验室分析了Cd胁迫下拟南芥MMR基因的启动子元件与启动子胞嘧啶甲基化水平变化不显著，无法解释其基因表达显著下降现象(何蕾等,2013)。但是，对于参与细胞增殖、细胞死亡、DNA损伤修复等多种重要功能的MSH2基因，其miRNA的靶向性研究，目前国内外尚未见报道。
有关检测植物miRNAs的方法研究，目前有很多报道，包括传统的共报告基因(例如CAT,β-Gal,GUS)系统、绿色荧光蛋白报告系统，体外切片技术，高通量测序方法、计算机软件预测miRNAs和潜在的靶基因以及验证miRNAs的功能。尽管这些方法的测定效果很好，但是验证miRNAs的功能涉及到分析稳定转基因/突变体品系中的分子和形态表型,所以它们的缺点是非常消耗时间、工作量极大；在某些情况下，翻译后调控靶位点技术的缺点是假阳性率太高；考虑到很多植物miRNAs调控蛋白质表达的水平明显大于mRNAs，体外切片技术仅仅检测靶位点的mRNA裂解情况，该技术的缺点是假阴性率太高；高通量测序方法的不足之处在于只能解析特定mRNA序列(Liu and Axtell，2015)。有关利用农杆菌浸染烟草叶片的双荧光素酶报告系统，验证拟南芥ath-miRNA170-3p是否靶向拟南芥MSH2基因的研究，目前尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于利用烟草双荧光素酶报告系统检测ath-miRNA170-3p靶向MSH2的验证方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的烟草双荧光素酶报告系统，烟草双荧光素酶报告系统包含荧光虫荧光素酶(F-Luc)和海肾荧光素酶(R-Luc)；其中，R-Luc作为内参(常数)，且F-Luc的3′UTR区域中嵌入限制性酶切位点AvrII和AgeI。
所述系统为对双荧光素酶报告(即3′UTR sensor，Addgene 55206)质粒进行修饰，并于F-Luc的3′UTR区域中嵌入的限制性酶切位点AvrII和AgeI之间插入ath-miRNA 170-3p的靶向基因-MSH2序列。
所述双荧光素酶报告系统在检测ath-miRNA170-3p在调控靶向拟南芥MSH2基因中的应用。
采用农杆菌介导的瞬时转化烟草叶片的双荧光素酶报告系统，检测植物ath-miRNA 170-3p与靶基因的相互作用的应用。
所述系统中R-Luc作为内参(常数)控制不同叶片或天数之间转化效率的差异，而F-Luc的3′UTR区域中嵌入了2个限制性酶切位点，限制性酶切位点之间插入靶向基因，利用农杆菌浸染烟草叶片的双荧光素酶报告系统，再通过双荧光素酶测定F-Luc/R-Luc的比值，即实现对植物ath-miRNA 170-3p与靶基因之间相互作用的检测。
烟草双荧光素酶报告系统检测MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的方法：
(1)构建所述的烟草双荧光素酶报告系统；
(1.1)设计/定购含有AvrII、Agel酶切位点、ath-miRNA170-3p靶向拟南芥MSH2基因的oligo序列、阳性对照和阴性对照，olig DNA信息见表1。对有意义链，AvrII位于oligo的5’末端，AgeI位于oligo的3’末端。
(1.2)将上述oligo冻干粉溶于无菌水中，配制成100μM的贮备液；分别取贮备液5μl、48.3μl水和1.67μl 0.3M NaCl于PCR管中混匀，于98℃5分钟后、每秒钟下降0.1℃至20℃，形成双链片段。
(1.3)使用AvrII、Agel(购自NEB公司)双酶切双荧光素酶质粒(3′UTR质粒，Addgene 55206)。酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶在100V电压条件下电泳30min；分离质粒条带，利用胶回收试剂盒回收目的大小片段(购自天根公司)；取回收纯化的双酶切质粒片段50ng及1.2中双链DNA片段400ng，加入T4DNA连接酶(购自Takara公司)16℃过夜连接。
(1.4)将连接产物与100μl TOP10E.coli感受态细胞(购自Sangon Biotech公司)混合，冰中放置15分钟。42℃加热60秒后，再在冰中放置10分钟，加入800μl LB液体培养基，37℃振荡培养1h，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB-琼脂平板上，37℃培养12-16h。
(1.5)挑选单菌落，进行菌落PCR验证并提取质粒进行测序验证(PCR引物及测序引物见表1)。
(1.6)将测序验证正确的质粒转入根癌农杆菌GV3101(含有pMP90和pSoup)感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司)：取1μg质粒加入到100μl农杆菌GV3101感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司)中，枪头轻轻搅动，放回冰上15min，液氮中冷冻5min，37℃水浴5min，冰浴10min。加入1ml YEB液体培养基(不含抗生素)，28℃摇匀4h。菌液涂布于含有利福平(Rifampicin,50μg/ml)、四环素(Tetracycline,5μg/ml)、庆大霉素(Gentamicin,25μg/ml)和卡那霉素(Kanamycin,25μg/ml)的YEB固体培养基上，倒置培养48h得到阳性转化子。
(2)构建烟草ath-miRNA 170-3p过表达质粒；
烟草ath-miRNA 170-3p过表达质粒为对GUS(Addgene ID 55208)质粒进行修饰得到。
(2.1)设计/定购含有XhoI和EcoRI酶切位点的拟南芥ath-miRNA 170-3p的前体miRNA的引物序列，引物信息如表1中所示，XhoI和EcoRI酶切位点分别位于PCR产物的5′和3′末端。
(2.2)提取拟南芥DNA为模板，使用2.1设计的引物，利用PCR方法扩增得到ath-miRNA 170-3p前体序列，PCR扩增体系及条件如下：
PCR反应体系如下：
试剂 用量
2xTaq Plus MasterMix 25μl
Sense primer 0.4μM
Antisense primer 0.4μM
Arabidopsis genomic DNA 150ng
ddH<sub>2</sub>O up to 50μL
PCR反应程序如下：
94℃预变性2min；94℃变性30s；55℃退火30s，72℃延伸30s；30个循环；72℃终延伸2min，4℃保存。
(2.3)PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶在100V电压条件下电泳30min；切下目的片段大小的琼脂糖胶，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根公司，DP209)回收纯化目的片段。
(2.4)将PCR产物连接pMDTM19-T质粒载体，转化感受态大肠杆菌后进行蓝白斑筛选，挑选阳性克隆子进行菌落PCR检测和测序验证。
(2.5)采用XhoI和EcoRI双酶切上述构建成功的pMD19-T质粒载体和GUS质粒(Addgene 55208),酶切体系如下：
试剂 用量
Xho I 1.5μl
EcoR1 1.5μl
质粒载体 1μg
H Buffer 5.0μl
ddH<sub>2</sub>O Up to 50μl
酶切后得到的目的片段和质粒经电泳后切胶回收(同2.3)，使用T4连接酶连接(同1.4)、转化大肠杆菌感受态细胞(同1.5)、菌落PCR的验证(方法同1.5，PCR引物见表1)、测序(测序引物见表1)。将测序验证正确的质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞等步骤，同上述1.6。
(3)农杆菌浸染烟草；
农杆菌浸染过程中双荧光素酶质粒与ath-miRNA 170-3p过表达质粒的农杆菌菌液比例为1:1-1:2。
(4)双荧光素酶活性检测，即实现利用系统的双荧光素酶的瞬时表达检测MSH2为ath-miRNA170-3p靶向相互关系；
(4.1)双荧光素酶检测，使用Promega的荧光测定试剂盒(catalog#E4550)进行样品的Firefly，Renila荧光值进行检测，在THERMOVarioskan Flash全波长多功能酶标仪上读取并保存数据。
(4.2)结果分析，确定ath-miRNA170-3p能够抑制拟南芥MSH2基因表达。
本发明的有益效果
本发明提供了一种在蛋白水平快速、准确验证/证实ath-miRNA170-3p可以通过靶向拟南芥MSH2基因的3’UTR负向调控MSH2表达的方法，有助于ath-miRNA170-3p调控拟南芥MSH2基因表达机理的阐明以及生物标记物的筛选，对于ath-miRNA170-3p调控拟南芥MSH2基因响应逆境胁迫的研究具有重要意义。
附图说明：
图1：生物信息学软件预测的ath-miRNA170-3p与靶基因MSH2的互补序列。
图2：凝胶电泳结果，(A)双酶切3’UTR质粒载体电泳图，顺序自左而右为marker、双酶切后、双酶切前；(B)MSH2 3’UTR PCR结果。
图3：重组质粒结构示意图，黑色框架为插入序列；(A.)miRNA过表达质粒结构；(B.)双荧光素酶报告质粒结构。
图4：双荧光素酶报告系统工作原理图。
图5：相对荧光素酶活性图，(A)方式一表示相对荧光酶活性图；(B)方式二表示相对荧光酶活性图。
图6：构建质粒测序结果图，(A)拟南芥MSH2 3’UTR测序结果；(B)阳性对照测序结果；(C)阴性对照测序结果；(D)拟南芥ath-miRNA170-3p过表达GUS载体测序结果。
具体实施方式
1材料和方法
1.1主要仪器
Figure BDA0002062574380000051
1.2主要试剂和试剂盒
Figure BDA0002062574380000061
1.3主要耗材
Figure BDA0002062574380000062
2.拟南芥ath-miRNA170-3p过表达GUS载体的构建
2.1拟南芥基因组DNA的提取
采用康为植物基因组DNA提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit，CW0553S)提取拟南芥基因组DNA,具体步骤如下：
(1)取约100mg拟南芥新鲜叶片，加入液氮充分研磨。
(2)将研磨后的粉末收集到离心管(自备)中，加入700μl 65℃预热的Buffer GP1，迅速颠倒混匀后，将离心管置于65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管混匀样品数次。
(3)加入4μl浓度为100mg/ml的RNase A溶液(CW0601S)，震荡混匀，室温放置5-10分钟。
(4)加入700μl氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5分钟。
(5)小心将上层水相转入一新的离心管(自备)中，加入700μl Buffer GP2，充分混匀。
(6)将步骤5中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns DM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(7)向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(8)向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(9)12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
(10)将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入50μl灭菌水，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，使用NanoDrop 2000进行DNA浓度及纯度检测，-20℃保存DNA。
2.2目的片段(pre-MIRNA)扩增
PCR体系如下：
2xTaq Plus MasterMix(Code No.:CW2849) 25μl
Sense primer 0.4μM
Antisense primer 0.4μM
Arabidopsis genomic DNA 150ng
ddH<sub>2</sub>O up to 50uL
使用引物如下：
Sense primer:(XhoI)ctcgagTTGAGAGTAGCAGAGTTAT
Antisense primer:(EcoRI)gaattcTCTTGGCAACAGACAATA
PCR反应程序如下：
94℃预变性2min；94℃变性30s；55℃退火30s，72℃延伸30s；30个循环；72℃终延伸2min，4℃保存。
2.3目的片段回收
(1)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，电压180V，20min电泳，康为DM2000(CW0632)为marker。
(2)采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)回收目的片段。
(3)柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(4)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量。
(5)向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μl PN溶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率。
(6)将上一步所得溶液加入到一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
(7)向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，静置2-5min，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
(8)重复操作步骤7。
(9)将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
(10)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液。
(11)使用NanoDrop 2000进行DNA浓度及纯度检测。
2.4TA克隆
使用Takara pMDTM19-T Vector Cloning Kit进行TA克隆
(1)在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为10μl。
试剂 使用量
pMD19-T Vector 1μl
Control Insert 1μl
ddH2O 3μl
Solution I 5μl
(2)16℃反应30分钟。
(3)全量(10μl)加入至100μl TOP10大肠杆菌感受态细胞中，冰中放置30分钟。
(4)42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
(5)加入890μl LB液体培养基，37℃振荡培养60分钟。
(6)在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。
(7)挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小，使用引物
Sense primer:ctcgagTTGAGAGTAGCAGAGTTAT，
Antisense primer:gaattcTCTTGGCAACAGACAATA
PCR体系如下：
2xTaq Plus MasterMix(Code No.:CW2849) 5μl
Sense primer 0.2μM
Antisense primer 0.2μM
菌落 约05.ul
ddH<sub>2</sub>O up to 10uL
PCR反应程序如下：
94℃预变性2min；94℃变性30s；55℃退火30s，72℃延伸30s；30个循环；72℃终延伸2min，4℃保存。
2.5目的基因验证
(1)将PCR确定的菌落接种到5ml液体LB(50mg/L Amp)培养基中，37℃×16h培养。
(2)使用天根TIANGEN质粒小提试剂盒(DP103)进行质粒提取
(3)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(4)取2ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用离心机，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
(5)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
(6)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
(7)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min。
(8)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中
(9)向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(10)重复操作步骤9。
(11)将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
(12)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
(13)将质粒送至长春华大中天生物公司进行测序验证，测序引物为M13F：TGT AAAACG ACG GCC AGT，将测序验证成功的质粒命名为19T-miRNA170
2.6酶切目的基因片段
(1)使用Xhol(Code No.1094S)、EcoR1(Code No.1040S)限制性内切酶(购自Takara公司)对GUS competitor plasmid(Addgene 55208)(www.addgene.org)载体和19T-miRNA 170质粒分别进行双酶切，酶切体系如下：
试剂 用量
Xho I 1.5μl
EcoR1 1.5μl
Vector 1μg
H Buffer 5.0μl
ddH2O Up to 50μl
37℃酶切4h
(2)采用1％琼脂糖凝胶电泳进行酶切片段分离
(3)割胶，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)回收目的片段回收目的片段，同2.3。
2.7载体连接
(1)使用T4DNA Ligase(Takara Code No.2011A)连接回收的线性片段，反应程序如下：
试剂 用量
T4Buffer 1μl
T4DNA Ligase 1μl
线性DNA片段 200ng
线性Vector片段 500ng
ddH2O Up to 10μl
16℃×12h连接。
(2)使用热激法将全部连接产物转化100μl TOP10大肠杆菌感受态细胞中(方法同1.4)，在LB平板培养基上(含有50mg/L卡那霉素)筛选阳性菌落。
(3)挑取阳性菌落进行菌落PCR验证(方法同1.4)。
(4)提取质粒，送测序(方法同1.5)
测序引物：M13F：TGT AAA ACG ACG GCC AGT，测序结果见图6.D。
2.8转化农杆菌GV3101
(1)取-80℃保存的农杆菌GV3101感受细胞(含pMP90和pSoup)(购自上海唯地生物技术有限公司)于室温，待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
(2)每100μl感受态加入取300ng测序成功质粒DNA,用手拨打管底混匀，依次于冰上静置15分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴10分钟。
(3)加入1ml无抗生素的YEB液体培养基，于28℃振荡培养4小时。
(4)6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含卡那霉素(50mg/L)、四环素(5μg/ml)、庆大霉素(25μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)抗生素的YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养48h。
(5)挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，方法同2.4，使用引物为：
Sense primer:ctcgagTTGAGAGTAGCAGAGTTAT，
Antisense primer:gaattcTCTTGGCAACAGACAATA
3.构建烟草双荧光素酶报告系统
3.1序列合成
将设计含有AvrII、Agel酶切位点的miRNA170-3p靶向拟南芥MSH2基因的oligo序列、阳性对照和阴性对照交由上海生工生物工程有限公司合成，序列信息见表1。
UTR-Sense：ctaggCTTACTGCCTTGGCTCAAGCAa
UTR-Antisense：ccggtTGCTTGAGCCAAGGCAGTAAGa
阳性对照-Sense：ctaggGATATTGACACGGCTCAATCAa
阳性对照-Antisense：ccggtTGATTGAGCCGTGTCAATATCc
阴性对照Sense：ctaggACAACTTCAGGGTCAGCTAGTa
阴性对照-Antisense：ccggtACTAGCTGACCCTGAAGTTGTc
3.2双链DNA片段合成
按照以下体系混匀以下试剂，共50μl
Figure BDA0002062574380000111
Figure BDA0002062574380000121
于98℃5分钟后、每秒钟下降0.1℃至20℃，形成双链片段。3.3酶切载体
(1)使用AVRII、AgeI限制性内切酶(购自NEB公司)对3′UTRsensor(Addgene55206)(www.addgene.org)载体和合成片段质粒分别进行双酶切，酶切体系如下：
试剂 用量
AVRII 1.0μl
AgeI 1.0μl
Cutsmart Buffer 5.0μl
DNA/Vector 1μg
ddH2O Up to 50μl
(2)37℃酶切4h
(3)采用1％琼脂糖凝胶电泳进行酶切片段分离
(4)割胶，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)回收目的片段回收目的片段(方法同2.3)。
3.4载体构建
使用T4连接酶连接DNA和载体(方法同2.7)，转化感受态大肠杆菌TOP10(方法同2.7),在LB平板培养基上(含卡那霉素，50mg/L)筛选阳性克隆菌落，对阳性克隆菌落进行PCR验证，使用引物
Sense:5′-GTTTTGGAGCACGGAAAGAC-3′
Antisense:5′-AAGCTCGGAATTAACCCTCA-3
反应体系和方法同2.5
对PCR验证成功的菌落进行扩繁，提取质粒送测序(方法同2.6)，使用测序引物为：
Sense:5′-GTTTTGGAGCACGGAAAGAC-3′，测序结果见图6.A-C。
3.5转化农杆菌
方法同2.8
4.农杆菌侵染烟草
4.1接种农杆菌
第1天，在含有利福平(R,50μg/ml)、四环素(T,5μg/ml)、庆大霉素(G,25μg/ml),卡那霉素(K,25μg/ml)的2mL YEP液体培养基中，分别接种MSH2-3’UTR测试组、阳性对照组、阴性对照组、miRNAs过表达农杆菌，另使用仅含RTG的YEP培养基培养无载体对照组农杆菌(仅GV3101))于28℃，150转，培养16-18小时后，农杆菌生长达到对数生长期，使用分光光度计测量菌液OD600的吸光度，调整培养时间，使OD600在1.5-1.8之间。
4.2扩繁农杆菌
第2天，同上述(3.1)，配制含RTG的20mL YEP液体培养基放于50mL三角瓶中；配制含RTGK的30mL YEP液体培养基,每10mL分装放于50mL三角瓶中，共3瓶；配制含RTGK的440mLLB液体培养基放于100mL三角瓶中。按照1:100的比例，将上述(3.1)的农杆菌分别进行第2次培养，28℃，150转，培养12-16小时。
4.3浸染烟草叶片
(1)第3天，上午约9时，测定每个三角瓶中农杆菌液的OD600，调整培养时间、将菌液的OD600调整在1.2-1.6之间。
(2)配制200mL浸染液(Infiltration media，IM)，含有88.85mL水，1mL 1M MgCl2，10mL 100mM 2-N-吗啉基-乙磺酸(MES)，150μl 100mM乙酰丁香酮。
(3)于25℃6000r离心5min分别收集4.2菌体，使用IM浸染液重悬菌体后再次离心收集，共重复清洗菌体2次，以去除培养基内的盐分和菌体代谢物。
(4)用IM重悬菌体，并分别调整农杆菌液的OD600，使各重悬菌液的浓度均为OD600＝0.7。
(5)标记5个15mL试管，取miRNA170-3p过表达菌液分别与阳性对照组、阴性对照组、MSH2-3’UTR测试组、无载体对照组(仅GV3101)侵染液按照1:1(V:V)混合均匀；另取1个无载体对照组(仅GV3101)侵染液。将所有的试管静置于室温、黑暗条件下4小时，期间试管口打开，以利于新鲜空气的交换。
(6)大约下午2：30，取完全展开3—5个叶片的烟草植株，使用单面徒手切片刀在烟草叶片的背面、远离主脉处切开1个5-9mm的小口。使用1ml显微注射器将混合后的菌液侵染液注满烟草植株叶片。注满浸染液的叶片整体呈现明显的深绿色。每组混合菌液选取3株烟草植株进行侵染，每株植株上侵染3片叶片，并对注射的叶片做标记。侵染后的烟草植株于24℃避光、保湿培养过夜。
4.4恢复培养
第4天，上午9时，避光过夜后，将注射的烟草置于光暗周期12h/12h培养条件下，继续培养约48h。
4.5采集样本。
第6天，取每个植株上侵染过的3个叶片，使用直径1cm的打孔器在每个叶片上分别打取3个叶圆片，取每个叶片上打取的一个小叶圆片置于2ml离心管中(每管3个叶圆片，共计3管)每个处理组共取3个植株。所有样品迅速置于液氮中，随后储存于-80℃冰箱中。
5双荧光素酶检测
5.1反应液配置
分别准备裂解液缓冲液(PLB)、F-Luc的底物溶液(LARII)和R-Luc的底物溶液(Stop&Glo)，其用量计算如下：
裂解液缓冲液(PLB)：
使用ddH2O稀释得到PLB裂解液；
PLB 5×buffer:(15×3)×500μl÷5＝4500μl。因为共5个处理组：miRNA170-3p过表达菌液+测试组、miRNA170-3p过表达菌液+阳性对照组，miRNA170-3p过表达菌液+阴性对照、miRNA170-3p过表达菌液+无载体菌液对照和无载体菌液对照。每个处理组具有3个生物学重复，共15个样品，每个生物学重复具有样品重复3次，每个样品需要500μl裂解缓冲液。
水：4500×4＝18000μl。
F-Luc的底物溶液(LARII)：
使用LARII缓冲液溶解LARII；
LARII：45×100＝4500μl。因为每个样品测试需要反应底物100μl，共45个样品。
R-Luc的底物溶液(Stop&Glo)：
将Stop&Glo 50×底物混匀于Stop&Glo缓冲液中；
Stop&Glo 50×底物：4500μl÷50＝90μl
Stop&Glo缓冲液：45×100＝4500μl。因为每个样品100μl，共45个样品。
5.2样品测定
(1)使用Promega的荧光测定试剂盒(catalog#E4550)，预先把PLB放在冰上融化，将配置好的F-Luc的底物溶液和R-Luc的底物溶液(Stop&Glo)置于室温，打开THERMOVarioskan Flash全波长多功能酶标仪，设置好测试程序。
(2)将样品从-80℃冰箱内取出，用镊子搅碎样品，加入冰冷的500μl PLB缓冲液，剧列摇动、涡旋后，放在冰上暂存。将处理好的全部样品于4℃最高速离心30s后，放在冰上。
(3)取10μl上清液，放入白色不透明的96孔板中相应的孔中，加入100μl LARII底物溶液，混匀，使用THERMO Varioskan Flash全波长多功能酶标仪，测定并记录每个样品的F-Luc荧光强度后；同一样品中加入100μl Stop&Glo底物溶液，混匀后测定R-Luc荧光强度，并记录数据，在一次测试中最多同时检测20个样品。
5.3数据处理与分析
将检测的miRNA170-3p过表达菌液+无载体菌液对照对照的荧光素酶值作为机器误差值，对实验数据进行矫正；
以两种计算方式表示miRNA170-3p对MSH2调控作用：
方式一：双荧光素酶比值＝(F-luc测–F-luc矫正)/(R-luc测–R-luc矫正)式中：F-luc测为同时含有miRNA170-3p过表达质粒及双荧光素酶报告质粒的萤火虫荧光值；F-luc矫正为只含有miRNA170-3p过表达质粒的烟草植株萤火虫荧光值；R-luc测为同时含有miRNA170-3p过表达质粒及双荧光素酶报告质粒海肾荧光值；R-luc矫正为只含有miRNA170-3p过表达质粒的烟草植株海肾荧光值。
方式二：设阳性对照组双荧光素酶值为0、阴性对照组为1，对测试组双荧光素酶比值变化情况进行计算，并使用SPSS 20软件分析差异显著性。
5.4实验结果
(1)烟草植株显微注射侵染后原始数据
Figure BDA0002062574380000151
Figure BDA0002062574380000161
(2)整理数据
Figure BDA0002062574380000162
(3)作图：
数据作图，见图5；
相对荧光素酶活性(Firefly/Renila ratio)；
阳性对照(Positive control，PC)；
阴性对照(Negative control，NC)；
实验结果表明：ath-miRNA170-3p能够抑制拟南芥MSH2基因表达。
表1引物序列信息
Figure BDA0002062574380000171

Claims (8)

1.一种MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的烟草双荧光素酶报告系统，其特征在于：烟草双荧光素酶报告系统包含荧光虫荧光素酶(F-Luc)和海肾荧光素酶(R-Luc)；其中，R-Luc作为内参(常数)，且F-Luc的3′UTR区域中嵌入限制性酶切位点AvrII和AgeI。
2.按权利要求1所述的MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的烟草双荧光素酶报告系统，其特征在于：所述系统为对双荧光素酶报告(即3′UTR sensor，Addgene 55206)质粒进行修饰，并于F-Luc的3′UTR区域中嵌入的限制性酶切位点AvrII和AgeI之间插入ath-miRNA170-3p的靶向基因-MSH2序列。
3.一种权利要求1所述的MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的烟草双荧光素酶报告系统的应用，其特征在于：所述双荧光素酶报告系统在检测ath-miRNA170-3p在调控靶向拟南芥MSH2基因中的应用。
4.按权利要求3所述的MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的烟草双荧光素酶报告系统的应用，其特征在于：
采用农杆菌介导的瞬时转化烟草叶片的双荧光素酶报告系统，检测植物ath-miRNA170-3p与靶基因的相互作用的应用。
5.按权利要求3所述的MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的烟草双荧光素酶报告系统的应用，其特征在于：所述系统中R-Luc作为内参(常数)控制不同叶片或天数之间转化效率的差异，而F-Luc的3′UTR区域中嵌入了2个限制性酶切位点，限制性酶切位点之间插入靶向基因，利用农杆菌浸染烟草叶片的双荧光素酶报告系统，再通过双荧光素酶测定F-Luc/R-Luc的比值，即实现对植物ath-miRNA 170-3p与靶基因之间相互作用的检测。
6.一种烟草双荧光素酶报告系统检测MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的方法，其特征在于：
(1)构建权利要求1所述的烟草双荧光素酶报告系统，
(2)构建烟草ath-miRNA 170-3p过表达质粒，
(3)农杆菌浸染烟草，
(4)双荧光素酶活性检测，即实现利用系统的双荧光素酶的瞬时表达检测MSH2为ath-miRNA170-3p靶向相互关系。
7.按权利要求6所述的烟草双荧光素酶报告系统检测MSH2为ath-miRNA170-3p靶向基因的方法，其特征在于：所述烟草ath-miRNA 170-3p过表达质粒为对GUS(Addgene ID55208)质粒进行修饰得到。
8.按权利要求6所述的烟草双荧光素酶报告系统检测MSH2为ath-miRNA170-3p靶向的方法，其特征在于：所述农杆菌浸染过程中双荧光素酶质粒与ath-miRNA 170-3p过表达质粒的农杆菌菌液比例为1:1-1:2。
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