JP5769173B2 - 環境ストレス下の翻訳抑制を回避する5’utrをコードする組換えdna分子 - Google Patents
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Description
的な要因ではないと考えられる」と言及している(非特許文献4)。
項1.
以下の(a)又は(b)の5’UTRを有するmRNAをコードする組換えDNA分子。
(a)
(i)5’端から1〜7番目が配列番号4の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号4の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(ii)5’端から1〜7番目が配列番号6の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号6の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iii)5’端から1〜7番目が配列番号20の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号20の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iv)5’端から1〜7番目が配列番号36の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号36の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、又は
(v)5’端から1〜7番目が配列番号60の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号60の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR
(b)(a)の5’UTRの塩基配列において、1又は数個の塩基が置換され、かつ、熱ストレス及び塩ストレスからなる群より選択される少なくとも1種の環境ストレスによる翻訳抑制を回避する5’UTR。
項2.
(a)の5’UTRが、5’端に配列番号4、6、20、36、又は60の塩基配列を有する5’UTRである、請求項1に記載の組換えDNA分子。
項3.
項1又は2に記載の組換えDNA分子をプロモーターの転写開始点直後に連結してなるベクター。
項4.
項3に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
項5.
形質転換体が形質転換植物である、項4に記載の形質転換体。
項6.
項4又は5に記載の形質転換体を、熱ストレス及び塩ストレスからなる群より選択される少なくとも1種の環境ストレス下で生育させ、前記組換えDNA分子がコードするタンパク質を産生させる方法。
項7.
項3に記載のベクターを植物に導入し、熱ストレス及び塩ストレスからなる群より選択される少なくとも1種の環境ストレスによる翻訳抑制を回避できる植物を製造する方法。
項8.
以下の(a)又は(b)の5’UTRを有するmRNAをコードするよう塩基配列を組み換えて、熱ストレス及び塩ストレスからなる群より選択される少なくとも1種の環境ストレスによる翻訳抑制を回避する遺伝子を製造する方法。
(a)
(i)5’端から1〜7番目が配列番号4の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号4の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(ii)5’端から1〜7番目が配列番号6の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号6の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iii)5’端から1〜7番目が配列番号20の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号20の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iv)5’端から1〜7番目が配列番号36の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号36の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、又は
(v)5’端から1〜7番目が配列番号60の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号60の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR
(b)(a)の5’UTRの塩基配列において、1又は数個の塩基が置換され、かつ、熱ストレス及び塩ストレスからなる群より選択される少なくとも1種の環境ストレスによる翻訳抑制を回避する5’UTR。
項9.
(a)の5’UTRが、5’端に配列番号4、6、20、36、又は60の塩基配列を有する5’UTRである、項8に記載の遺伝子を製造する方法。
項10.
以下の(a)又は(b)の5’UTRを有するmRNAをコードするよう、任意の遺伝子の塩基配列を組み換えて、熱ストレス及び塩ストレスからなる群より選択される少なくとも1種の環境ストレスにより、当該遺伝子がコードするタンパク質の翻訳が抑制されるのを回避する方法。
(a)
(i)5’端から1〜7番目が配列番号4の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号4の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(ii)5’端から1〜7番目が配列番号6の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号6の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iii)5’端から1〜7番目が配列番号20の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号20の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iv)5’端から1〜7番目が配列番号36の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号36の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、又は
(v)5’端から1〜7番目が配列番号60の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号60の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR
(b)(a)の5’UTRの塩基配列において、1又は数個の塩基が置換され、かつ、熱ストレス及び塩ストレスからなる群より選択される少なくとも1種の環境ストレスによる翻訳抑制を回避する5’UTR。
項11.
(a)の5’UTRが、5’端に配列番号4、6、20、36、又は60の塩基配列を有する5’UTRである、項10に記載のタンパク質の翻訳が抑制されるのを回避する方法。
項12.
以下の(a)又は(b)の5’UTRを有する人工mRNA分子。
(a)
(i)5’端から1〜7番目が配列番号4の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号4の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(ii)5’端から1〜7番目が配列番号6の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号6の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iii)5’端から1〜7番目が配列番号20の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号20の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iv)5’端から1〜7番目が配列番号36の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号36の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、又は
(v)5’端から1〜7番目が配列番号60の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号60の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR
(b)
(a)の5’UTRの塩基配列において、1又は数個の塩基が置換され、かつ、熱ストレス及び塩ストレスからなる群より選択される少なくとも1種の環境ストレスによる翻訳抑制を回避する5’UTR。
項13.
(a)の5’UTRが、5’端に配列番号4、6、20、36、又は60の塩基配列を有する5’UTRである、項8に記載の人工mRNA分子。
本発明では、遺伝子の実体はmRNAをコードしているDNA分子である。遺伝子から転写されたmRNAは5’UTR、ORF(open reading frame)、及び3’UTRの3つの領域に区分けされる。本発明の組換え遺伝子は、特定の5’UTR配列を有するmRNAをコードするように組み換えられた遺伝子である。すなわち特定の5’UTR配列をコードする組換え遺伝子であるともいえる。特定の5’UTR配列を有するmRNAを発現する組換え遺伝子であるともいってもよい。本発明の組換え遺伝子は、自然界に存在する遺伝子(つまり、各種生物種が有する遺伝子)ではなく、人工的に少なくとも5’UTRに相当する部分の塩基配列を変化させて製造した遺伝子である。
5’端から1〜7番目の塩基配列がacacaagであり、5’端から12〜32番目の塩基配列がuucaaggauaucaaaucacaaである5’UTR、
5’端から1〜7番目の塩基配列がuacaucaであり、5’端から12〜32番目の塩基配列がcacacaaaacuaacaaaagauである5’UTR、
5’端から1〜7番目の塩基配列がauaacacであり、5’端から12〜32番目の塩基配列がcaagcauuggauuaaucaaagである5’UTR、
5’端から1〜7番目の塩基配列がauuaacaであり、5’端から12〜32番目の塩基配列がaaccgaaaaaagaaaaaaacuである5’UTR、又は
5’端から1〜7番目の塩基配列がuuaaaaaであり、5’端から12〜32番目の塩基配列がacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaである5’UTRである。
−上述の特定の5’UTR配列おいて1又は複数個(好ましくは1又は数個)の塩基が置換された塩基配列からなるポリヌクレオチドを5’UTRとして有するmRNAをコードし、かつ、
−当該mRNAからタンパク質への翻訳が、熱ストレス及び塩ストレスからなる群より選択される少なくとも1種の環境ストレスにより抑制されるのを回避する
という特徴を有する組換え遺伝子(組換えDNA分子)も包含される。
本発明のベクターは、上述の本発明の組換え遺伝子をプロモーターの転写開始点直後に連結してなるベクターである。より詳細には、本発明のベクターは、プロモーター配列を備えたクローニングベクターに、本発明の組換え遺伝子をプロモーターの転写開始点直後に連結してなる発現ベクターである。
本発明の形質転換体は、本発明のベクターを含む形質転換体である。より詳細には、本発明の形質転換体は、本発明のベクターが導入され、本発明のベクターにより形質転換された形質転換体である。
本発明は、本発明の形質転換体を、熱ストレス及び塩ストレスからなる群より選択される少なくとも1種の環境ストレス下で生育(培養)し、前記組換え遺伝子がコードするタンパク質を産生させる方法も包含する。形質転換体の生育又は培養方法は、宿主の生育又は培養方法において、環境ストレスを加えればよい。
本発明は、また、任意の遺伝子において、コードする5’UTR配列が上記特定の5’UTR配列となるように、5’UTRコード部位の塩基配列を改変することにより、ストレス環境下(好ましくは熱ストレス及び/又は塩ストレス下)でコードされるタンパク質の翻訳が抑制されるのを回避又は低減することができる組換え遺伝子(組換えDNA分子)を作製する方法も包含する。
本発明は、また、上記「組換え遺伝子(組換えDNA分子)」欄で記載した“特定の5’UTR配列を有するmRNA分子”も包含する。なお、当該mRNA分子は人工物(すなわち人工mRNA分子)であり、自然界に存在するmRNA分子は含まない。
さらにまた、本発明は、植物における環境ストレスによる翻訳抑制を回避又は低減させる、5'UTRにおける配列特徴の予測方法も提供する。また、当該予測方法で予測された配列特徴を備えた5'UTRを有する核酸等も提供する。具体的には、本発明には、例えば以下の項A〜Fに記載する発明が包含される。
植物内で天然に発現するN個の遺伝子について、各5’UTRを含む核酸分子の対照条件下に対する環境ストレス条件下における翻訳レベルの相対活性値を求める工程、
前記5′UTRにおける5'末端からの塩基位置kからk+L-1までの長さLの配列について、少なくとも1回出現するt個の塩基からなる塩基配列の出現頻度を求める工程、
前記相対活性値と、前記塩基配列の出現頻度との相関式を構築し、多変量解析により各塩基配列の出現頻度の回帰係数を求める工程、
前記回帰係数を用いて、塩基位置kからk+L−1までの長さLの領域における各塩基位置における4つの塩基A、U、G、Cに対応した回帰係数の値を求め、各塩基位置における前記相対活性値に対する各塩基の寄与度を求める工程、
得られた寄与度及び前記相対活性値を用いて多変量解析により回帰モデルを構築する工程、
k及びLを変えて構築した回帰モデルの中から、相対活性値に対する予測精度を設定値以上とする塩基位置k'及びL'の回帰モデルを選定し、選定した回帰モデルを用いて塩基位置k'からk'+L'−1の領域における特定配列を予測する工程
を含む予測方法。
前記5’非翻訳領域は、植物内で天然に発現する遺伝子由来の5’非翻訳領域における項1で設定した塩基位置k'からk'+L'−1の領域が項1の特定配列である配列であり、
前記改変配列は、植物内で天然に発現する遺伝子由来の5’非翻訳領域における項1で設定した塩基位置k'からk'+L'−1の領域が項1の特定配列で置換されている配列である、核酸配列。
i番目のサンプルにおいて、k+jを開始とする長さtの配列を
植物における環境ストレスによる翻訳抑制を回避又は低減させる、5'非翻訳領域(5'UTR)における配列特徴の予測システムであって、
植物内で天然に発現するN個の遺伝子について、各5’UTRを含む核酸分子の対照条件下に対する環境ストレス条件下における翻訳レベルの相対活性値を求める手段、
前記5′UTRにおける5'末端からの塩基位置kからk+L-1までの長さLの配列について、少なくとも1回出現するt個の塩基からなる塩基配列の出現頻度を求める手段、
前記相対活性値と、前記塩基配列の出現頻度との相関式を構築し、多変量解析により各塩基配列の出現頻度の回帰係数を求める手段、
前記回帰係数を用いて、塩基位置kからk+L−1までの長さLの領域における各塩基位置における4つの塩基A、U、G、Cに対応した回帰係数の値を求め、各塩基位置における前記相対活性値に対する各塩基の寄与度を求める手段、
得られた寄与度及び前記相対活性値を用いて多変量解析により回帰モデルを構築する手段、
k及びLを変えて構築した回帰モデルの中から、相対活性値に対する予測精度を設定値以上とする塩基位置k'及びL'の回帰モデルを選定し、選定した回帰モデルを用いて塩基位置k'からk'+L'−1の領域における特定配列を予測する手段
を備える予測システム。
本発明には、上記予測方法により得られる配列特徴を備えた5’非翻訳領域又はその改変配列を含む核酸分子も含まれる。換言すると、本発明は、(1)上記1の予測方法により得られた配列特徴を備えた5’非翻訳領域を含む核酸分子、及び(2)上記1の予測方法により得られた配列特徴を備えた5’非翻訳領域の改変配列を含む核酸分子を含む。
5'UTR1(good(1)):配列表の配列番号4
acacaagcauuuucaaggauaucaaaucacaaucccaagaagagcaauaacaagagaagaagaaguaguucaagaauuaaggaagagagcuucuccguuaaaguauagugagagaau
の配列、
5'UTR2(good(2)):配列表の配列番号5
auaacacauuucaagcauuggauuaaucaaagacaaagaaaacgaaa
の配列、
5'UTR3(good(3)):配列表の配列番号6
uacaucacaaucacacaaaacuaacaaaagaucaaaagcaaguucuucacuguugaua
の配列が挙げられる。
改変5'UTR1:植物内で天然に発現する遺伝子由来の5’非翻訳領域の配列における5'端から1〜7番目の配列が配列表の配列番号7(uuaaaaa)の配列で置換されている配列を含む核酸分子、
改変5'UTR2:植物内で天然に発現する遺伝子由来の5’非翻訳領域における5'端から12〜32番目の配列が配列表の配列番号8(acaaaaaaaaaaaaaaaaaaa)の配列に置換されている配列を含む核酸分子、
改変5'UTR3:植物内で天然に発現する遺伝子由来の5’非翻訳領域における5'端から1〜7番目の塩基配列が配列表の配列番号7(uuaaaaa)の配列に置換され、かつ5'端から12〜32番目の配列が配列表の配列番号8(acaaaaaaaaaaaaaaaaaaa)の配列に置換されている配列を含む核酸分子が挙げられる。
1-1. 使用した培養細胞
シロイヌナズナ培養細胞 (Arabidopsis thaliana T87)は、理化学研究所ジーンバンク室植物細胞開発銀行より分与して頂いた。300 ml容のマイヤーフラスコに改変LS培地 (Nagata, T. et al., 1992. Int. Rev.Cytol. 132: 1-30)を95ml入れ、培養は22℃、18時間明期/6時間暗期、攪拌速度120rpmの条件で行った。1週間ごとに定常期に達した細胞4 mlを新しい培地95mlに移植し継代培養を行った。実験には8ml移植したものを3日間培養した細胞を用いた。また、後述する安定形質転換細胞作出に使用した培養細胞は、定常期に達した細胞2 mlを植えつぎ、3-4日間培養した細胞を使用した。
大腸菌を用いた遺伝子操作は、公知の方法(例えばMolecular Cloning (Sambrook et al., 2001)に記載の方法)に従った。
Firefly luciferase(以下、「f-luc」)用ベクターの鋳型となるpT3-FL-pAベクター、並びにRenilla luciferase (以下、「r-luc」用)ベクターの鋳型となるpT3-RL-pAベクターを下記の方法で作製した。
ポリA配列を持つin vitro転写用プラスミド (pT3-5’UTR-FL-pA、pT3-RL-pA)はin vitro転写反応に先立ち、SspI(AATATT)によりポリA配列の末端部分を切断し直鎖状にした。従って、合成されるmRNAの3’末端には49塩基のアデニン残基 (ポリA配列)に続いてチミン残基が1塩基付加されることになる。SspI処理したDNA断片は、QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)を用いて精製した。精製されたDNA断片を鋳型に、Megascript T3 transcription kit (Ambion)を用いて、キャップ構造を持たないmRNAを合成した。合成は、キットに添付されたプロトコールに従って行った。合成されたRNAはキットに付属のDNaseIで処理した後、LiCl沈殿により精製し、付属のRNase-free水で溶解した。キャップ構造の付加はScriptCap m7G Capping System (EPICENTRE)を用いた。操作は、キットに添付されたプロトコールに従った。
キャップを付加したRNAはRNeasy kit (QIAGEN)を用いて精製し、RNase-free水で溶出した。RNA濃度は分光光度計を用いて測定した。RNAの品質は1.5%変性アガロースゲル電気泳動により検定した。
シロイヌナズナ培養細胞T87からのプロトプラスト調製は、佐藤らの方法に若干の変更を加えて行った (Satoh J. et al., 2004, J.Biosci. Bioeng. 1: 1-8)。
培養細胞を0.4Mマンニトールで洗浄した後、酵素液 (0.4M Manitol、10% Cellulase RS [Yakult Honsha]、0.1% Pectolyase [Kikkoman]、pH 5.5)を加え、25℃にて2時間穏やかに攪拌した。40μmナイロンメッシュ (Cell Strainer;BD Falcon)でろ過した後、遠心 (800rpm、5min、4℃)を行い、沈殿を回収した。回収した沈殿に0.4Mマンニトールを加え、再度遠心 (800rpm、5min、4℃)することによりプロトプラストを得た。更に、0.4Mマンニトールで洗浄した後、プロトプラストをW5溶液 (154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mM Mes-KOH、pH 5.6)に再懸濁し、氷中に30分静置した。細胞数の計測は血球計算板を用いて行った。再度遠心操作によりプロトプラストを回収し、細胞濃度が1×104cell/μlになるようにMMg溶液 (0.4M mannitol、15mM MgCl2、4mM Mes-KOH、pH5.7)に懸濁した。
mRNAのプロトプラストへの導入は、基本的にKovtunのpolyethlen glycol (PEG)を用いた方法に従った (Kovtun et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 6: 2940-2945)。典型的にはmRNA (5μl前後)に1×104 cell/μlのプロトプラストを加えた後、混合液と等量のPEG溶液 (40% PEG 4000、0.2M Mannitol、0.1M Ca (NO3)2) (Sheen J., 2001, Plant Physiol. 127:1466-1475)を加えてゆっくりと混和した。5分間室温にて静置した後、W5溶液を加えて転倒混和し、遠心操作により回収した細胞をprotoplast-medium (Dansako et al.,2003. J. Biosci. Bioeng. 95: 52-58)により再懸濁した。再懸濁した細胞は、試験温度に一定時間静置した後、超小型遠心器を用いた遠心操作を行い、上清を除いた。その後、液体窒素で凍結して−80℃にて保存した。
細胞の溶解は、5×105個のプロトプラスト当たり75μlのpassive lysis buffer (Promega)を用い、室温で15分間、ミキサーで溶解させた。溶解液中のf-luc、r-luc活性測定には、Dual-luciferase reporter assay system (Promega)とルミノメータ (Lumat LB 9501;Berthold)を付属のプロトコールに従って使用した。
2-1 配列情報と活性情報の定義
上記1-1〜1-7の方法に従った実験(換言すると、翻訳状態が異なるいくつかの遺伝子を抽出し、それら遺伝子の5’UTRを連結したレポーターmRNAを培養細胞プロトプラストに導入して行う一過性発現実験)において得られる、通常温度 (22℃)と熱ストレス条件 (37℃)に静置したプロトプラストにおける相対f-luc活性値 (つまり、通常温度 (22℃)に静置したプロトプラストにおけるf-luc活性値に対する、熱ストレス条件 (37℃)に静置したプロトプラストにおける相対f-luc活性値)を、以降「相対活性値」と表現する。
N個のサンプルにおける塩基位置kからk+L-1の範囲の長さLの配列において少なくとも1回出現するt個の塩基からなる配列をR1(t), R2(t), …, Rv(t), RV(t)とした。今回の実験では、t=3とした。
i番目のサンプルにおいて、k+jを開始とする長さtの配列を
得られた配列情報及び相対活性値を基に、PLS (Partial Least Squares)法により回帰モデルを構築した。PLS法は、因子X(N×V行列)を応答y(N×1)へ線形的に関連付ける方法である。
3-1.試験に用いた39遺伝子の選択
植物における環境ストレスによる翻訳状態の変化をゲノムワイドに解析するために、シロイヌナズナにおける通常細胞及びストレス処理した細胞由来の19099遺伝子について、ポリソーム/マイクロアレイ解析を行った。
即ち、ΔPSの値が大きいほど、ランキングの上位とし、値が小さいほど、下位に順位づけした。△PSの値が大きいほど、翻訳状態が影響を受けないことを示し、ΔPSの値が小さいほど翻訳が顕著に阻害されることを示す。
選択した39遺伝子の5’UTRの熱ストレス下における翻訳への寄与を検証するために、試験する5’UTRを付加したin vitro合成レポーターmRNAをプロトプラストに導入し、レポーターの発現を評価する一過性発現実験を行った。
プロトプラストサンプルの1方を通常温度下(22℃)、もう1方を熱ストレス下(Heat stress)に20分間静置した。その後両プロトプラストサンプルを回収し、f-luc及びr-luc活性を測定した。m7Gはキャップ構造を、n=49はポリA配列の長さを示す。
前記3では、5’UTRが熱ストレス下におけるmRNAの翻訳レベルの応答を決定する重要な要因であることが示された。
先の一過性発現実験に供した計39遺伝子の5’UTRの配列情報と22℃に対する37℃の相対活性値の情報を基に、実際の相対活性値に対する変数 (部分塩基配列)の係数を求める多変量解析法 (PLS法)による回帰モデルの構築を行った。概念図を図10に表した。
in silico解析から予測された5’UTRの5’端側7塩基 、別言するとin silico解析より予測された9塩基からT3プロモーター由来のGGを除く7塩基、の重要性を一過性発現実験により検証した。
4-2より、熱ストレスによる翻訳抑制の回避に、5’UTRの5’端7塩基以外の領域も、貢献している可能性が示唆された。
これまでの実験結果より、5’UTR内の5’端7塩基及び12〜32番目の塩基が、熱ストレス下におけるレポーターmRNAの発現を規定する重要な要因であることが示された。
これまでの実験では、一過性発現実験により実際に試験した5’UTRの配列情報とその実測値 (相対活性値)を基に、PLS法を用いたモデル構築を行い、熱ストレス下におけるレポーターmRNAの翻訳に寄与する重要領域 、即ち、5’端7塩基及び12〜32番目の塩基を見出した。
5-1.in silico解析を用いた、熱ストレス下においても翻訳の抑制を受けない最適5’UTR配列の抽出
続いて、PLS法により構築されたモデルを基に、熱ストレスによるレポーターmRNAの翻訳抑制の回避に寄与する最適配列の抽出を行った。
5-1に示すin silico解析の結果を受けて、提示された最適配列が実際のレポーターmRNAの熱ストレス下での翻訳抑制回避に寄与しているのかどうかを一過性発現実験によって検証した。
相対活性値の低かった遺伝子At2g41630の5’UTR(灰色枠)の5’端7塩基および12〜32番目の塩基、またはそれら両方を最適配列に入れ換えることによるレポーターmRNAの翻訳への影響を検証した。
通常、有用遺伝子や5’UTRを連結した植物発現ベクターは、基本となるベクターのプロモーター領域下流に位置する制限酵素部位を利用して構築する(図23)。図23に一般的な植物発現ベクターの構築図を示す。この場合は、基本となる発現ベクターのXbaIおよびSacI部位に5’UTRおよび遺伝子を導入している。
相対活性値が高いAt1g77120の5’UTR 、およびその末端に図23でXbaI部位を利用してベクターに連結した場合に予想されるベクター由来の配列が付加された場合のmRNAをそれぞれ合成し、ベクター由来の配列が付加された場合の翻訳抑制回避への影響を一過性発現実験によって検証した。
7-1 バイナリーベクターの構築
At1g77120+の5’UTRがCaMV35SプロモーターとGUS遺伝子(β−グルクロニダーゼ遺伝子)の間に挿入されているプラスミドAtADH NF (Sugio et al., J. Biosci. Bioeng., 3, 300-302.2008)のNOSターミネーター領域をSacI/EcoRIサイトを用いてHSPターミネーター (Nagaya et.al., Plant Cell Physiol. 51(2): 328-332 (2010))と置換した(At1g77120+ NF HSP-T)。At4g14560、At3g47610、At5g39740、At5g39740-Sの5’UTRについてXbaIサイトを持つforwardプライマーと3’側にStuIサイトを持つbackwardプライマー(表9)を用い、各5’UTRが挿入されているpT3-5’UTR-FL-pA を鋳型としてPCRを行った。得られたPCR産物をXbaI/StuIサイトを用いてAt1g77120+ HF HSP-TのAt1g77120の5’UTRと置換した。得られたプラスミドをそれぞれAt4g14560+ NF HSP-T、At3g47610+ NF HSP-T、At5g39740+NF HSP-T、At5g39740-S+ NF HSP-Tと名付けた。次にCaMV35Sプロモーターの転写開始点とそれぞれの5’UTRとの間の余分配列を取り除くために、forwardとbackward プライマー(表10)を用いてインバースPCRを行った。PCR産物を自己連結し、得られたプラスミドをそれぞれ At4g14560 NF HSP-T、At1g77120 NF HSP-T、At3g47610 NF HSP-T、At5g39740NF HSP-T、At5g39740-S NF HSP-Tと名付けた。また塩基配列を決定することで変異がないことを確認した。最後に、At4g14560+ NF HSP-T、At1g77120+ NF HSP-T、At4g14560 NFHSP-T、At1g77120 NF HSP-T、At3g47610 NF HSP-T、At5g39740 NF HSP-T、At5g39740-S NF HSP-TのHindIII/EcoRI断片をpRI910 (TAKARA-BIO)に挿入し形質転換用ベクターを作製した。作製したバイナリーベクターをエレクトロポレーション法によりAgrobacterium tumefaciens EHA105株に導入し、グリセロールストックとして-80℃で保存した。なお、図26に、作製したバイナリーベクターの構築図を例示する。
定常期に達した7日目のシロイヌナズナ培養細胞T87を新しい改変LS培地(95 ml)に2 mlを植え継ぎ、3日間24時間明期、22℃にて振蘯培養した。3日目シロイヌナズナ培養細胞T87培養液に2×YT培地(Molecular Cloning (Sambrook et al., 2001)に記載)で培養したアグロバクテリウム(作製した各バイナリーベクターが導入されている)を500 μlまたは1 ml (O.D.600測定値≒1)接種した。同時に終濃度100 μMのアセトシリゴンを添加し、22℃、連続明期、攪拌速度120 rpmの条件下で2日間、振蘯共存培養した。その後、共存培養液50 ml(全量の半分)を50 mlファルコンに移し、遠心(800×g, 1 min, 4℃)を行った後、上清を除き、100 mg/l カルベニシリンナトリウムを含む改変LS培地(洗浄培地)を約20 ml加え、洗浄を行った(5回)。洗浄の後の培養細胞を洗浄培地100 mlに移し、22℃、連続明期、攪拌速度120 rpmの条件下で2日間、振蘯回復培養した。回復培養後の培養細胞全量を洗浄培地で洗浄を行った(洗浄方法は上記と同様)。洗浄後の培養細胞と等量の洗浄培地を加えたものを1 ml又は500 μl、改変LS Km Cbプレート(改変LS培地, 40 mg/l カナマイシン, 250 mg/lカルベニシリンナトリウム, 3 g/l ゲランガム)に広げた。22℃、連続明期に2〜3週間静置し、形成したカルスを新たな改変LS Km Cbプレートに移し、さらに増殖の良好なカルスを選択し、後述するGUS染色を行い、GUS遺伝子の発現を確認の後、十分に増殖したカルス塊を、95 mlの改変LS Km Cb液体培地中で培養し、その後の実験に使用した。
基本的にJeffersonらの方法 (Jefferson et al., (1987). EMBO J. 6, 3901-3907)に従い、GUS染色を行った。調整したGUS Extraction Buffer (50 mM NaH2PO4 pH7.0, 10 mMbeta-Mercaptoethanol, 10 mM Na2EDTA)に0.1 mM 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (x-gluc)を染色の直前に加え、混合液を回収したカルス塊に1 ml加え攪拌し、37℃にて30分〜2時間静置した。色の変化を観察した。GUS遺伝子の発現が確認されたカルスを形質転換細胞として以下の実験(ポリソーム解析、RT-PCR、及びGUS活性測定)に用いた。
培養は22℃、18時間明期/6時間暗期、攪拌速度120 rpmの条件で行い、95 mlの改変LS Km Cb液体培地を300 ml容の三角フラスコに入れ使用した。一週間ごとに、定常期に達した細胞4〜10 mlを新しい培地95 mlに移植し、継代培養を行った。
8-1 安定形質転換細胞の生育条件及びストレス処理
形質転換細胞に対し、熱ストレス処理又は塩ストレス処理を行った。形質転換細胞の熱ストレス処理には、培養3日目の細胞を用い、37℃で10分間振蘯培養した。熱ストレス処理後、吸引濾過により培地を除き、液体窒素中で凍結させ、-80℃にて保存した。通常細胞は温度が22℃である以外は、熱ストレス処理した細胞と同様に扱った。塩ストレス処理にも、培養3日目の形質転換細胞を用いた。終濃度200 mMとなるようにNaClを細胞培養液に加えた後、通常の培養条件(上記7-4に記載の条件)で10分間振蘯培養した。吸引濾過した細胞を液体窒素中で凍結させ、-80℃にて保存した。
ショ糖密度勾配遠心を利用したポリソーム解析は、Davisらの方法に準じて行った (Davies, E., and Abe, S. (1995). Methods Cell Biol. 50, 209-222.)。通常細胞もしくは熱ストレス/塩ストレス処理した細胞約300 mgを乳棒と乳鉢を用いて液体窒素中で細かく破砕した後、破砕粉末に1.5 mlのbuffer U (200 mM Tris-HCl, pH 8.5, 50 mM KCl, 25 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 100 μg/ml heparin, 2% polyoxyethylene 10-tridecyl ether, 1%sodium deoycholate)を加え、緩やかに懸濁した。遠心(15,000 ×g, 10 min, 4℃)により細胞残さを除いたのち、buffer B (50 mM Tris-HCl, pH8.5, 25 mM KCl, and 10 mM MgCl2)により調製した15-60%ショ糖密度勾配4.5 ml上に上清を重層し、超遠心を行った (SW55Ti rotor, 55,000 rpm, 50 min, 4℃, brake-off) (Beckman Coulter)。ペリスタポンプ (Minipuls 3; Gilson)に連結したマイクロピペット (40 μl Calibrated Pipet; Drummond)をショ糖密度勾配の上部から挿入し、下部からショ糖密度勾配液を約1 ml/minの速度で吸引すると同時に、バイオミニ紫外吸収モニターAC-5200 (ATTO)を用いて254 nmの吸光度を記録した。
ショ糖密度勾配遠心液約350 μlずつを、終濃度5.1 Mになるように8 Mグアニンジン塩酸塩を予め加えておいたチューブ15本に回収した。混合液と等量の100% エタノールを加え、-20℃にて一晩冷却した後、遠心操作(12,000×g, 45 min, 4℃)を行った。得られたペレットは85%エタノールにて一度洗浄した後、乾燥させた。その後のRNA精製にはRNeasyMini Kit (Qiagen)を付属のプロトコールに従い用いた(DNaseI処理をオプションとして行った)。 すべての画分のRNAをそれぞれ30 μlのRNase-free waterで溶解した。精製したRNAの品質は、1.5%変性ゲル電気泳動により検定した。
15の画分から精製したRNA溶液を、等容量ずつ用いて逆転写反応を行った。逆転写反応には、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche)を用い、反応系は20 μlとした (oligo dTプライマー使用)。PCR反応による特異的なcDNA産物の増幅は、2倍希釈した逆転写反応液2-3 μlを鋳型とし、遺伝子特異的なプライマー(表11)及びKAPA Taq Extra PCR Kit (KAPABIOSYSTEMS)を用いて行った(反応系は20 μl)。増幅産物は、アガロース電気泳動及びEtBr染色により可視化した。PCRのサイクル数はPCR産物の指数増加期内に設定した。
<熱ストレス処理>
(At3g47610形質転換細胞)
At3g47610形質転換細胞に37℃10分間の熱ストレス処理を行うことで、通常細胞と比較してポリソーム画分が減少するとともに非ポリソーム画分が増大していることがRNA量の指標とした254 nmの吸光プロファイルから示された(図28 A)。また、リボソームの構成因子である28S rRNAと18S rRNAのショ糖密度勾配液における分布が、吸光プロファイルの挙動を反映していることも、遠心後のショ糖密度勾配液を分画し、それぞれの画分から回収したRNAをアガロース電気泳動することにより確認された(図28 B)。さらに、アレイ解析の結果から、熱ストレス下でも翻訳が維持される遺伝子であるAt1g77120もしくはAt4g14560のmRNAのショ糖密度勾配液における分布をRT-PCR法により調べたところ、熱ストレス条件(37℃/10 min)においても、翻訳が抑制されることなくポリソーム画分にとどまっていた(図28 C)。一方で、アレイ解析の結果から、熱ストレス下で翻訳抑制を受けるハウスキーピング遺伝子Actin2 (Act2)とAt3g47610のmRNAでは熱ストレス処理により、mRNAの分布がポリソームから非ポリソーム画分に著しく移行しており(図28 C)、At3g47160の5’UTRを付加したGUS mRNAでも、At3g47610 mRNAと同様に、熱ストレス下においてポリソーム形成が阻害され、翻訳が抑制されることが示された(図28 C)。
At5g39740形質転換細胞についても、At3g47610形質転換細胞と同様の解析を行った。その結果、At3g47610形質転換細胞と同様、ストレス処理によるポリソーム画分の減少と非ポリソーム画分の増大(図29 A)、28S rRNAと18S rRNAのショ糖密度勾配液における分布とその吸光プロファイルの挙動の一致(図29 B)、そしてAt1g77120 mRNA のポリソーム形成の維持とAct2、At3g47610 mRNAの非ポリソーム画分への移行が観察された(図29 C)。また、熱ストレス下で翻訳が抑制される遺伝子であるAt5g39740の5’UTRを付加したGUS mRNAではAt3g47610の5’UTRを用いた場合と同様に熱ストレス下での翻訳が抑制された(図29 C)。
At4g14560形質転換細胞についても、同様の解析を行った。その結果、これまでと同様に、37℃10分間の熱ストレス処理による、ポリソーム画分の減少と非ポリソーム画分の増大(図30 A)、28S rRNAと18S rRNAのショ糖密度勾配液における分布とその吸光プロファイルの挙動の一致(図30 B)、そして熱ストレス下でも翻訳が維持されるAt4g14560 mRNAのポリソーム形成の維持と熱ストレス下で翻訳抑制をうけるAct2とAt3g47610 mRNAの熱ストレス処理による非ポリソーム画分への移行が認められた(図30 C)。一方で、At3g47610形質転換細胞とAt5g39740形質転換細胞とは異なり、熱ストレス下でも翻訳が維持されるAt4g14560の5’UTRを付加したGUS mRNAでは熱ストレス下においてもポリソーム画分にとどまっていた (図30 C)。
At1g77120形質転換細胞についても、同様の解析を行った。その結果、37℃10分間の熱ストレス処理によりポリソーム画分の減少と非ポリソーム画分の増大(図31 A)、28S rRNAと18S rRNAのショ糖密度勾配液における分布とその吸光プロファイルの挙動の一致(図31 B)、熱ストレス下でも翻訳が維持されるAt1g77120 mRNAの熱ストレス下でのポリソーム形成の維持と熱ストレス下で翻訳抑制をうけるAct2とAt3g47610 mRNAの熱ストレス処理による非ポリソーム画分への移行が認められた (図31 C)。一方、At1g77120の5’UTRを付加したGUS mRNAでは熱ストレス下においてもポリソーム画分にとどまっていた (図31 C)。
At4g14560+形質転換細胞及びAt1g77120+形質転換細胞を、それぞれ2ラインずつ、計4種類の形質転換細胞を用い、通常条件下(22℃)と熱ストレス下(37℃/10 min)で培養した細胞のGUS mRNAの挙動を、ポリソーム/RT-PCRにより解析した。その結果、余分配列を含むAt4g14560+形質転換細胞とAt1g77120+形質転換細胞では、上記4種の形質転換細胞を用いた解析結果と同様、熱ストレス処理によりポリソーム画分の減少と非ポリソーム画分の増大(図32 A, 図33 A)、28S rRNAと18S rRNAのショ糖密度勾配液における分布とその吸光プロファイルの挙動の一致(図32 B, 図33 B)、そして熱ストレス下で翻訳が維持されるAt4g14560及びAt1g77120 mRNAのポリソーム形成の維持、熱ストレス下で翻訳抑制を受けるAct2とAt3g47610 mRNAの非ポリソーム画分への移動が確認された (図32 C, 図33 C)。一方で、At4g14560+ 5’UTRを付加したGUS mRNAでは、At3g47610 やAt5g39740の5’UTRを付加したGUS mRNAほどではないが、At4g14560形質転換細胞のGUS mRNA(図30 C)と比較して、熱ストレス処理により、GUS mRNAの分布が非ポリソーム画分へ移行した(図32 C)。また、At1g77120+形質転換細胞の場合も、At1g77120形質転換細胞と比較してAt1g77120+ 5’UTRを付加したGUS mRNAが全体として非ポリソーム画分に移行していることが確認された(図31 C, 図33 C)。これらの結果は、6-1で行った一過性発現実験の結果と一致しており、5’UTRの5’側に余分な配列が存在すると、熱ストレス下での翻訳維持能力が損なわれることを示している。またこの結果は、発現ベクターを構築する際には、5’UTRにできるだけ余分な配列が付加されないように考慮する必要であることを示している。
熱ストレス下で翻訳が抑制されるAt5g39740の5’UTRを予想最適配列(5’端から1-7塩基:uuaaaaa, 12-32塩基:acaaaaaaaaaaaaaaaaaaa, 図20参照)に置換した5’UTRを作製し、この5’UTRを発現する発現ベクターを構築した。予想最適配列のAt5g39740 5’UTRへの導入は図21(e)及び図22(e)と同じ位置に行った。構築したバイナリーベクターを導入したAt5g39740-S形質転換細胞を作出し、予想最適配列の効果を上述の形質転換細胞の解析と同様にして検証した。結果を図34に示す。
熱ストレス下でも翻訳を維持する5’UTR(At4g14560及びAt1g77120)と翻訳が抑制される5’UTR(At3g47610)を用いて、塩ストレス下での翻訳維持能力を検証した。すなわち、At4g14560形質転換細胞、At1g77120形質転換細胞、及びAt3g47610形質転換細胞を用いてポリソーム/RT-PCR解析を行った。
上述のポリソーム/RT-PCR解析では、短時間の強い熱ストレス処理(37℃/10 min)を行い、mRNAのポリソーム形成状態の変化から5’UTRの翻訳能力評価を行った。ここでは、形質転換細胞を長時間の熱ストレス下におき、翻訳産物であるGUSタンパク質の蓄積量の変化を調べることにより各5’UTRの翻訳維持能力を検証した。なお、37℃で長時間細胞を培養すると形質転換細胞は死滅するため、本検討では、下述するようにより弱い熱ストレスである32℃で培養を行った。
植え継ぎ後3日目の安定形質転換細胞を、24時間32℃で培養し、熱ストレス処理とした。それ以外の条件は上記8-1に記載の条件と同様とした。
Jeffersonらの方法 (Jefferson et al., (1987). EMBO J. 6, 3901-3907)に従い、GUS活性を測定した。培養細胞を遠心操作(800 rpm, 1 min, 22℃)により、細胞を沈殿させ、300 μlのPassive Lysis buffer (Promega)を加え、Handy Sonic(TOMY SEIKO CO., LTD)による細胞破砕を行った。破砕した細胞を再度遠心(15000 rpm, 5 min, 4℃)し、200 μlの上清を回収した。100 μlの上清と200 μlの1.5 mM 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide液を混合し、反応させたのち、SPECTRAFLUOR(TECAN)を用いて励起波長365 nm、蛍光波長455 nmで反応生成物4-methyl-umbelliferone (4-MU)の蛍光強度を1分毎に30分間測定した。10分から20分までの1分あたりの測定値の増加量の平均値からblankの平均値を引き、1分あたりの4MU平均増加量を決定した。GUS活性はpmol/min/mg protinとして算出した。
総タンパク質量の測定はBradfordの方法(Bradford, M. (1976).Anal. Biochem. 72, 248-254.)に従った。10 μlのタンパク質溶液に500 μlのタンパク質定量試薬を加えSPECTRAFLUOR (TECAN)を用いて測定し、既知濃度のBSAを用いて作製した検量線からタンパク質濃度を決定した。
Commassie Brilliant blue G-250 100 mg/l
95% Ethanol 50 ml/l
85%(w/v) Phosphoric acid 100 ml/l
32℃/24時間の熱ストレス条件下において、翻訳維持能力のある遺伝子由来の5’UTR (At4g14560とAt1g77120)を付加した形質転換細胞では、GUSタンパク質蓄積量の維持傾向が見られた(図38)。一方、翻訳抑制を受ける遺伝子由来の5’UTR (At3g47610とAt5g39740)を用いた形質転換細胞では緩やかな熱ストレスに長時間曝される(24時間32℃)ことにより、GUSタンパク質の蓄積量に減少傾向が見られた(図38)。
Claims (16)
- 以下の5’UTRを有するmRNAをコードする組換えDNA分子:
(i)5’端から1〜7番目が配列番号4の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号4の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(ii)5’端から1〜7番目が配列番号6の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号6の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iii)5’端から1〜7番目が配列番号20の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号20の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iv)5’端から1〜7番目が配列番号36の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号36の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、又は
(v)5’端から1〜7番目が配列番号60の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号60の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR。 - 前記5’UTRが、5’端に配列番号4、6、20、36、又は60の塩基配列を有する5’UTRである、請求項1に記載の組換えDNA分子。
- 請求項1又は2に記載の組換えDNA分子をプロモーターの転写開始点直後に連結してなるベクター。
- 請求項3に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
- 形質転換体が形質転換植物である、請求項4に記載の形質転換体。
- 請求項5に記載の形質転換体を、熱ストレス及び塩ストレスからなる群より選択される少なくとも1種の環境ストレス下で生育させ、前記組換えDNA分子がコードするタンパク質を産生させる方法。
- 請求項3に記載のベクターを植物に導入し、熱ストレス及び塩ストレスからなる群より選択される少なくとも1種の環境ストレスによる翻訳抑制を回避できる植物を製造する方法。
- 以下の5’UTRを有するmRNAをコードするよう塩基配列を組み換えて、熱ストレス及び塩ストレスからなる群より選択される少なくとも1種の環境ストレスによる翻訳抑制を回避する遺伝子を製造する方法:
(i)5’端から1〜7番目が配列番号4の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号4の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(ii)5’端から1〜7番目が配列番号6の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号6の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iii)5’端から1〜7番目が配列番号20の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号20の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iv)5’端から1〜7番目が配列番号36の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号36の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、又は
(v)5’端から1〜7番目が配列番号60の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号60の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR。 - 前記5’UTRが、5’端に配列番号4、6、20、36、又は60の塩基配列を有する5’UTRである、請求項8に記載の遺伝子を製造する方法。
- 以下の5’UTRを有するmRNAをコードするよう、任意の遺伝子の塩基配列を組み換えて、熱ストレス及び塩ストレスからなる群より選択される少なくとも1種の環境ストレスにより、当該遺伝子がコードするタンパク質の翻訳が抑制されるのを回避する方法:
(i)5’端から1〜7番目が配列番号4の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号4の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(ii)5’端から1〜7番目が配列番号6の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号6の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iii)5’端から1〜7番目が配列番号20の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号20の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iv)5’端から1〜7番目が配列番号36の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号36の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、又は
(v)5’端から1〜7番目が配列番号60の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号60の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR。 - 前記5’UTRが、5’端に配列番号4、6、20、36、又は60の塩基配列を有する5’UTRである、請求項10に記載のタンパク質の翻訳が抑制されるのを回避する方法。
- 以下の5’UTRを有する人工mRNA分子:
(i)5’端から1〜7番目が配列番号4の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号4の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(ii)5’端から1〜7番目が配列番号6の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号6の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iii)5’端から1〜7番目が配列番号20の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号20の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、
(iv)5’端から1〜7番目が配列番号36の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号36の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR、又は
(v)5’端から1〜7番目が配列番号60の1〜7番目の塩基配列からなり、5’端から12〜32番目の塩基配列が配列番号60の12〜32番目の塩基配列からなる5’UTR。 - 前記5’UTRが、5’端に配列番号4、6、20、36、又は60の塩基配列を有する5’UTRである、請求項12に記載の人工mRNA分子。
- 植物における環境ストレスによる翻訳抑制を回避又は低減させる、5’UTRにおける配列特徴の予測方法であって、
植物内で天然に発現するN個の遺伝子について、各5’UTRを含む核酸分子の対照条件下に対する環境ストレス条件下における翻訳レベルの相対活性値を求める工程、
前記5’UTRにおける5’末端からの塩基位置kからk+L-1までの長さLの配列について、少なくとも1回出現するt個の塩基からなる塩基配列の出現頻度を求める工程、
前記相対活性値と、前記塩基配列の出現頻度との相関式を構築し、多変量解析により各塩基配列の出現頻度の回帰係数を求める工程、
前記回帰係数を用いて、塩基位置kからk+L-1までの長さLの領域における各塩基位置における4つの塩基A、U、G、Cに対応した回帰係数の値を求め、各塩基位置における前記相対活性値に対する各塩基の寄与度を求める工程、
得られた寄与度及び前記相対活性値を用いて多変量解析により回帰モデルを構築する工程、及び
k及びLを変えて構築した回帰モデルの中から、相対活性値に対する予測精度を設定値以上とする塩基位置k'及びL'の回帰モデルを選定し、選定した回帰モデルを用いて塩基位置k'からk'+L'−1の領域における特定配列を予測する工程
を含む予測方法。 - 植物における環境ストレスによる翻訳抑制を回避又は低減させる、5'UTRにおける配列特徴を予測するための、CPU及びメモリを含むシステムであって、
前記CPU及び前記メモリを使用して、植物内で天然に発現するN個の遺伝子について、各5’UTRを含む核酸分子の対照条件下に対する環境ストレス条件下における翻訳レベルの相対活性値を求める手段、
前記CPU及び前記メモリを使用して、前記5'UTRにおける5'末端からの塩基位置kからk+L-1までの長さLの配列について、少なくとも1回出現するt個の塩基からなる塩基配列の出現頻度を求める手段、
前記CPU及び前記メモリを使用して、前記相対活性値と、前記塩基配列の出現頻度との相関式を構築し、多変量解析により各塩基配列の出現頻度の回帰係数を求める手段、
前記CPU及び前記メモリを使用して、前記回帰係数を用いて、塩基位置kからk+L−1までの長さLの領域における各塩基位置における4つの塩基A、U、G、Cに対応した回帰係数の値を求め、各塩基位置における前記相対活性値に対する各塩基の寄与度を求める手段、
前記CPU及び前記メモリを使用して、得られた寄与度及び前記相対活性値を用いて多変量解析により回帰モデルを構築する手段、及び
前記CPU及び前記メモリを使用して、k及びLを変えて構築した回帰モデルの中から、相対活性値に対する予測精度を設定値以上とする塩基位置k'及びL'の回帰モデルを選定し、選定した回帰モデルを用いて塩基位置k'からk'+L'−1の領域における特定配列を予測する手段、
を備える予測システム。 - コンピューターに請求項14に記載の各工程を実行させるための、配列特徴の予測プログラム。
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