JP2002515754A - 翻訳的に制御される遺伝子の同定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ストレス誘導性成分で未知の標的ｍＲＮＡ（標的ｍＲＮＡはｍＲＮＡのより大きい試料の一部である）の翻訳を選択的に刺激することを含む、翻訳的に制御される遺伝子の同定方法。ｍＲＮＡ試料は、翻訳ｍＲＮＡと非翻訳ｍＲＮＡのプールに分割され、これらは示差的に解析されて、ストレス誘導性成分により翻訳的に制御される遺伝子が同定される。内部リボゾームエントリー部位をコードする遺伝子配列の同定方法は、細胞中の５’キャップ依存性ｍＲＮＡ翻訳を阻害し、細胞からのｍＲＮＡのプールを採取し、およびｍＲＮＡのプールを示差的に解析して内部リボゾームエントリ一部位をコードする配列を有する遺伝子を同定する、ことを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 翻訳的に制御される遺伝子の同定方法 発明の背景技術分野 本発明は、翻訳的に制御される遺伝子の同定方法に関する。さらに詳しくは本 発明は、ｍＲＮＡを翻訳プールと非翻訳プールへ分離し、これらのプール中に存 在するｍＲＮＡの相対量を示差的解析により比較することにより、示差的に発現 されたかまたは発生的に制御された遺伝子配列の迅速な単離に関する。背景技術 ２つの細胞タイプもしくは組織タイプの間で、またはストレス条件、化合物も しくは病原体に暴露された細胞もしくは組織の間で、その発現が異なる遺伝子の 同定および／または単離は、種々の生理的症状、障害または疾患の背後にある機 構の理解に決定的に重要である。胚発生、老化、組織修復、および新生物形質転 換を含む多くの生物学的プロセスにおいて、遺伝子発現の制御は重要な役割を果 たすことが証明されている。翻訳のレベルでの遺伝子制御は、決定的に重要であ ることが証明されている。例えば一群のｍＲＮＡは、非翻訳ｍＲＮＡのプールと して卵の中に保存され、受精後に翻訳ｍＲＮＡのプール中にシフトすることが証 明されている。ｍＲＮＡの翻訳状態の変化の別の例は、正常な生理的条件下では 翻訳されない、熱ショックタンパク質をコードするｍＲＮＡのサブグループであ る。これらのｍＲＮＡは、細胞を高温に暴露した後に翻訳され始める。 発生的、生理的、薬理的、または他の指示されたイベントに応答して活性化ま たは抑制される遺伝子の検出および単離のために、多くの方法が開発されている 。１つの具体的な方法は、ゼング（Ｚｅｎｇ）の米国特許第５，５２５，４７１ 号に記載されている、サブトラクティブハイブリダイゼーション（ｓｕｂｔｒａ ｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）である。サブトラクティブハイブリ ダイゼーションは、あるＤＮＡまたはＲＮＡ集団中に存在するが別の集団中には 存在しない配列の選択的クローニングに、特に有用な方法である。選択的クロー ニングは、対照細胞／組織（ドライバーｃＤＮＡ）および試験すべき特定の変化 または応答中またはその後の細胞／組織（テスターｃＤＮＡ）の両方からの、１ 本鎖相補的ＤＮＡライブラリーの作成を伴う。２つのｃＤＮＡライブラリーは変 性され互いにハイブリダイズされて、ドライバーｃＤＮＡ鎖およびテスターｃＤ ＮＡ鎖の間に２本鎖が形成される。この方法では、共通の配列は除去され、残っ たハイブリダイズしない１本鎖ＤＮＡが、試験すべき特定の変化またはイベント に関連する実験的細胞／組織中に存在する配列について濃縮される（デービス（ Ｄａｖｉｓ）ら、１９８７）。 指示または刺激後に誘導／低下されるタンパク質をコードするｍＲＮＡを同定 するために現在使用されている方法は、示差的に発現されたｍＲＮＡのスクリー ニングを介する転写誘導／抑制後のｍＲＮＡレベルの変化に依存する。示差的に 発現されたｍＲＮＡの同定のためのそのような方法の１つは、ストクリフェ（Ｓ ｕｔｃｌｉｆｆｅ）らの米国特許第５，４５９，０３７号に開示されている。こ の方法では、ｍＲＮＡ集団が単離され、１２個のアンカープライマーの混合物を 使用してｍＲＮＡ集団から２本鎖ｃＤＮＡが調製され、２つの制限エンドヌクレ アーゼを用いてｃＤＮＡが切断され、次にベクター内でＴ３プロモーターに関し てアンチセンスであるような配向でベクター中に挿入される。大腸菌（Ｅ．ｃｏ ｌｉ）は、ｃＤＮＡ含有ベクターで形質転換され、第１および第２の制限エンド ヌクレアーゼとは異なる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼで消化して、 クローン化挿入体から線状化断片が作成され、線状化断片をＴ３ ＲＮＡポリメ ラーゼとともにインキュベートすることにより、アンチセンスｃＤＮＡ転写体の ｃＤＮＡ調製物が作成される。このｃＤＮＡ集団は、サブプールに分割され、各 サブプールからの第１のｃＤＮＡ鎖は、熱安定性逆転写酵素と１６個のプライマ ーのうちの１つを使用して転写される。１６個の反応プールのそれぞれの転写産 物は、３’プライマーおよび５’プライマーとともにポリメラーゼチェイン反応 （ＰＣＲ）の鋳型として使用され、ポリメラーゼチェイン反応で増幅された断片 は電気泳動で分離されて、試料中に存在するｍＲＮＡの３’末端であるバンドを 示す。この方法は、示差的に発現されたｍＲＮＡの同定と相対的濃度の測定に有 用である。しかしこの種の測定法は、そのレベルが一定であるがその翻訳性が可 変である（すなわち変化する）ｍＲＮＡを同定することができない。 シェナ（Ｓｈｅｎａ）らは、マイクロアレイを使用して多くの遺伝子の発現を 平行して追跡する高能カシステムを開発した。マイクロアレイは、ガラス上でｃ ＤＮＡの高速ロボット印刷により調製され、対応する遺伝子の定量的発現測定値 を提供する（シェナ（Ｓｈｅｎａ）ら、１９９５）。遺伝子の示差的発現測定は 、同時２色蛍光ハイブリダイゼーションを用いて行われる。しかしこの方法のみ では、翻訳的に制御される遺伝子の同定には不充分である。 非ポリソームｍＲＮＡ集団に対してポリソームｍＲＮＡ集団を示差的に示しな がら、細胞中のヒプシン（ｈｙｐｕｓｉｎｅ）形成デオキシヒプシルヒドロキシ ラーゼを可逆的に抑制するために、ヒプシン形成の既知のインヒビターであるミ モシム（ｍｉｍｏｓｉｍｅ）が使用された（ハナウスケーアベル（Ｈａｎａｕｓ ｋｅ−Ａｂｅｌ）ら、１９９５）。この方法を使用して、ヒプシン形成の阻害ま たは脱阻害に関してポリソームでそれぞれ消失および再出現し、かつ翻訳的に制 御される酵素をコードすると考えられている、いくつかのｍＲＮＡ種が発見され た。この方法は、翻訳的に制御される遺伝子を同定するための既知の刺激性成分 （すなわち、インデューサーまたはレプレッサー）の使用を教示するのみである 。この方法は、刺激性成分が未知である、翻訳的に制御される遺伝子の検出およ び／または同定のための機構を提供しない。 一般に真核生物ｍＲＮＡの翻訳は、５’キャップ介在リボゾーム結合に依存す る。翻訳の前に、リボゾーム小サブユニット（４０Ｓ）は、転写体上の５’キャ ップ構造体に結合し、次に大きいサブユニット（６０Ｓ）が完全なリボゾーム開 始部位を形成する翻訳開始部位まで、ｍＲＮＡ分子に沿ってスキャンする。多く の場合、翻訳開始部位は、第１のＡＵＧコドンである。この翻訳開始の「スキャ ニングモデル」は、ほとんどの真核生物ｍＲＮＡに適用できる。「スキャニング モデル」のいくつかの顕著な例外は、ピコナウイルス科により提供される。これ らのウイルスは、複数の非翻訳開始ＡＵＧコドンを含有する、長い（６００〜１ ２００ヌクレオチド）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を有する非キャップ化転写体を 生成する。キャップ構造がないため、これらのＲＮＡの翻訳効率は、内部リボゾ ームエントリ一部位（ＩＲＥＳ）として知られている非翻訳領域（ＵＴＲ）内の 特異的配列の存在に依存する。 最近、ＩＲＥＳを含有するｍＲＮＡ転写体が、免疫グロブリン重鎖結合タンパ ク質、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のアンテナペディア（ ａｎｔｅｎａｐｅｄｉａ）遺伝子、およびマウスＦｇｌ−２遺伝子をコードする ｍＲＮＡのような非ウイルス系で発見された。これらの発見により、正常および 異常プロセス中の遺伝子発現の発生制御におけるキャップ非依存性翻訳の役割に ついての推測が促進された。 上記非ウイルス性ＩＲＥＳ含有ｍＲＮＡの発見は、真核生物ＩＲＥＳ配列が従 来理解されているより広く広がっていることを意味する。真核生物ＩＲＥＳ配列 を同定することが困難なのは、これらが典型的には配列相同性によっては同定で きないという事実のためである［オー（Ｏｈ）ら、１９９３；マウントフォード （Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ）ら、１９９５；マセジャック（Ｍａｃｅｊａｋ）ら、１ ９９１；ペレチエア（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ）ら、１９８８；バグナー（Ｖａｇｎ ｅｒ）ら、１９９５］。従って、正常および異常プロセスとの関連を確認し評価 するために、５’キャップ非依存性翻訳を介して機能する翻訳的に制御される遺 伝子を同定するために、ＩＲＥＳを含有するｍＲＮＡの同定方法を有することが 有効であろう。 従って、先行技術の方法の本質的な問題を克服する、臨床的かつ治療的に関連 する示差的に発現される遺伝子の同定とクローニングのための、迅速で信頼でき かつ再現性のある方法を有することが好ましいであろう。 発明の要約 本発明において、ストレス誘導性成分で未知の標的ｍＲＮＡ（標的ｍＲＮＡは ｍＲＮＡのより大きい試料の一部である）の翻訳を選択的に刺激する工程、ｍＲ ＮＡの試料を翻訳ｍＲＮＡプールと非翻訳ｍＲＮＡのプールに分割する工程、そ してｍＲＮＡのプールを示差的に解析して、ストレス誘導性成分により翻訳的に 制御される遺伝子を同定する工程とを含む、生物中の翻訳的に制御される遺伝子 の同定方法が提供される。このストレス誘導性成分は、病理的、環境的（化学的 および物理的ストレッサー）またはｍＲＮＡ翻訳を誘導する他の刺激を含有する ことができる。また本発明において、内部リボゾームエントリー部位をコードす る遺伝子配列の同定方法が提供される。この方法は、細胞中の５’キャップ依存 性ｍＲＮＡ翻訳の阻害、細胞からのｍＲＮＡのプールの採取、および内部リボゾ ームエントリー部位をコードする配列を有する遺伝子を同定するためのｍＲＮＡ のプールの示差的解析を含む。 図面の簡単な説明 添付の図面とともに以下の詳細な記載を参照することにより、本発明の他の利 点は、容易に理解されるであろう。 図１Ａは、ショ糖密度勾配上の細胞質ＲＮＡの分画の吸光度プロフィールであ り、吸光度（２４５ｎｍで）を、細胞質ＲＮＡの沈降速度に対してプロットして ある。 図１Ｂは、アガロースゲルで電気泳動し臭化エチジウムで染色した精製ＲＮＡ の写真であり、ＲＮＡの分画を示す。 図２は、本発明のショ糖密度勾配からのｍＲＮＡの示差的翻訳解析を示す５％ アクリルアミドゲルの写真である。 図３Ａ〜Ｃは、（Ａ）プラスミドｐＴＫ−ＯＰ３−ＷＴ２Ａ中、（Ｂ）プラス ミドミニＴＫ−ＷＴ２Ａ中、および（Ｃ）ヒグロマイシン選択マーカーを含有す るプラスミド中に、ポリオウイルス２Ａ遺伝子を含有するプラスミドの略図であ る。 図４は、２Ａプロテアーゼの誘導後に細胞死に至るポリオウイルス２Ａプロテ アーゼの誘導を示すグラフである。 図５は、ＩＰＴＧで誘導後の形質転換ＨＥＫ−２９３細胞中のポリオウイルス ２Ａプロテアーゼ（２９３−２Ａ）発現の存在と、ＩＰＴＧで誘導後のＨＥＫ− ２９３細胞中のポリオウイルス２Ａプロテアーゼ（２９３−２Ａ）発現の欠如を 示すゲルの写真である。 図６は、４０Ｓリボゾームサブユニットのｐ２２０タンパク質成分の切断にお ける、ポリオウイルス２Ａプロテアーゼの活性を示すウェスタンブロットの写真 であり、ポリオウイルス２Ａプロテアーゼについて誘導されたクローンがｐ２２ ０タンパク質の切断産物を生成することを証明している。 発明の詳細な説明 本発明は、ストレス誘導性成分で未知の標的ｍＲＮＡ（標的ｍＲＮＡはより大 きい試料の一部である）の翻訳を選択的に刺激することによる、生物中の翻訳的 に制御される遺伝子の同定方法を提供する。該生物は、適当なｍＲＮＡを提供す る任意の生物でよい。ｍＲＮＡ試料は、翻訳ｍＲＮＡと非翻訳ｍＲＮＡのプール に分割され、これらは、ストレス誘導性成分により翻訳的に制御される遺伝子を 同定するために示差的に解析される。この方法は、翻訳レベルで制御される遺伝 子を同定かつクローニングするためにデザインされる。すなわち、本方法は、ア ップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされた遺伝子の同定かつク ローニング（特異的な病理的またはストレス条件に応答性の遺伝子の同定を含む ）のためにデザインされる。 本発明の方法は、生物中の基礎的細胞機能に関与し翻訳のレベルで制御される 遺伝子の同定とクローニングに対する新規アプローチを提供する。この方法の基 礎的な背景理論は、外部指示（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｃｕｅ）に対する迅速な応答 に必要なタンパク質をコードするｍＲＮＡは、一般に非翻訳ｍＲＮＡ中に保存さ れるという仮定に依存する。適切な外部指示に従って、ｍＲＮＡは翻訳され、コ ードされたタンパク質が迅速に出現する。特定の時間に「活性」または「不活性 」なｍＲＮＡ集団を比較することにより、「シフト機構」と呼ばれる機構により 制御される遺伝子を同定することができる。 この方法はまた、翻訳レベルで制御される遺伝子以外に：転写レベルで制御さ れる遺伝子；ＲＮＡ安定性により制御される遺伝子；核と細胞質の間のｍＲＮＡ 輸送速度により制御される遺伝子；および示差的スプライシングにより制御され る遺伝子、を同定するのに応用することができる。すなわち、その発現の一部が ｍＲＮＡレベルで調節／制御される遺伝子を同定することができる。 この方法は、分泌されたかつ膜タンパク質をコードする遺伝子；核タンパク質 をコードする遺伝子；ミトコンドリアタンパク質をコードする遺伝子；細胞骨格 タンパク質をコードする遺伝子を同定できるであろう。さらに、その発現をｍＲ ＮＡレベルで調節することができる任意の他の遺伝子を、本方法により同定する ことができる。 本明細書においてＲＮＡとは、刺激された、分化した、化合物に暴露された、 病原体などで感染された生物から単離された、細胞培養物、培養組織または細胞 もしくは組織から単離されたＲＮＡを意味する。本明細書において、翻訳は、ｍ ＲＮＡ鋳型上のタンパク質の合成として定義される。 本明細書において、未知の標的ｍＲＮＡの翻訳を刺激する、または刺激成分と いう用語は、「シフト機構」により制御される病理的および／またはストレス条 件下で、未変性の組織および／または細胞から得ることができる遺伝子からのｍ ＲＮＡ集団を、化学的に、病理的に、物理的に、または他の方法で誘導するかま たは抑制することを含む。すなわち、ストレス誘導性成分すなわち「ストレッサ ー」でｍＲＮＡの翻訳を刺激することは、試料からの細胞中の非翻訳ｍＲＮＡと して保存されるｍＲＮＡの翻訳を刺激または開始する、外部指示、刺激の適用を 含むことができる。未変性の細胞／組織中の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳を刺激 する以外に、刺激は、病理的および／またはストレス条件下での遺伝子の誘導お よび／または抑制を含むことができる。本方法は、ストレス誘導性成分またはス トレッサーにより翻訳的に制御される未知の標的遺伝子を同定するために、刺激 またはストレッサーを利用する。 本発明の方法は、本来は別々に使用された２つの既知の方法を組み込んでいる 。第１の方法は、ｍＲＮＡの別々の翻訳プールと非翻訳プールへのｍＲＮＡ試料 の分割である。第２の方法は、示差的表示、表象示差解析（ＲＤＡ）、遺伝子発 現マイクロアレイ（ＧＥＭ）、抑制的サブトラクションハイブリダイゼーション （ＳＳＨ）（ジアチェンコ（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ）ら、１９９６）、およびラ バ（Ｒａｖａ）らの米国特許第５，５４５，５３１号（アフィマックス・テクノ ロジーズ．エヌ．ブイ（Ａｆｆｙｍａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎ．Ｖ． ））に例示されたチップ技術、およびハイセク社（Ｈｙｓｅｑ，Ｉｎｃ）のＷＯ ９６／１７９５７特許出願により例示される直接配列決定法のような示差的解析 方法による、別のプール中に存在するｍＲＮＡ種の相対量の同時比較が関与する 。 簡単に説明すると、サブトラクティブハイブリダイゼーションは、溶液中のハ イブリダイゼーションによるｍＲＮＡの削除として定義される。２つのプールに 共通のＲＮＡは、除去可能な２本鎖を形成し、１つのプール中でユニークである かより豊富なＲＮＡが濃縮される。示差的表示は、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転 写、および縮重プライマーによるＰＣＲ増幅として定義される。２つのプールか らの増幅産物（電気泳動による）の量の比較は、転写体の豊富さを示す。ＲＤＡ 、ＧＥＭ、ＳＳＨ、ＳＡＧＥは、前記したものである。 翻訳的に制御される遺伝子を同定するために解析される特定の細胞／組織は、 任意の適切な細胞および／または組織を含むことができる。すべての細胞タイプ または組織が使用可能であり、樹立された細胞株または培養物、または暴露され た生物から直接単離されたものも使用することができる。 本法で解析される細胞／組織は、試料組織内のｍＲＮＡの翻訳を刺激し、その 発現が少なくとも一部はｍＲＮＡレベルで制御される遺伝子を同定するために、 生理的、化学的、環境的および／または病理的ストレス誘導性成分またはストレ ッサーを使用して選択的に刺激される。ＲＮＡの翻訳の刺激後、細胞／組織から のＲＮＡが単離されるかまたは細胞／組織から抽出される。ＲＮＡの単離は、当 業者に公知の方法を使用して行われ、例えば「モレキュラークローニング、実験 室マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏ ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプ リング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州 、１９８９）に記載されている。細胞／組織からのＲＮＡの単離と抽出のための 他の方法を使用することができ、これらは当業者に公知であろう（マッハ（Ｍａ ｃｈ）ら、１９８６、ジェフェリーズ（Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ）ら、１９９４）。 翻訳されているｍＲＮＡはリボゾームを有し、従ってリボゾームの無い非翻訳 ｍＲＮＡとは密度勾配上での移動が異なるため、翻訳および非翻訳ｍＲＮＡのプ ールの単離後、活発に翻訳に参加しているｍＲＮＡおよび翻訳されないままのｍ ＲＮＡを、ショ糖密度勾配、高速ゲル濾過クロマトグラフィー、またはポリアク リルアミドゲルマトリックス分離のような分画法（オギシマ（Ｏｇｉｓｈｉｍａ ）ら、１９８４、メナカー（Ｍｅｎａｋｅｒ）ら、１９７４、ヒラマ（Ｈｉｒａ ｍａ）ら、１９８６、メクラー（Ｍｅｃｈｌｅｒ）、１９８７、およびバルーチ ャ（Ｂｈａｒｕｃｈａ）とマーシー（Ｍｕｒｔｈｙ）、１９９２）を使用して分 離することができる。ある時点で翻訳で活性があるかまたは不活性のｍＲＮＡ集 団を比較することにより、「シフト機構」により制御される遺伝子を同定するこ とができる。 転写または翻訳を特異的に阻害または調節する薬物で標的細胞／組織を処理す ることにより、ポリソーム性分画および特異的解析が促進される。そのような薬 物の例は、それぞれアクチノマイシンＤおよびシクロヘキサミドである。 分画を完了させてポリソームサブ分類を作成することができる。サブ分類は、 当該分野で公知の方法により総ポリリボゾームまたは膜結合リボゾームを区別で きるように、作成することができる（メクラー（Ｍｅｃｈｌｅｒ）、１９８７） 。さらにｍＲＮＡ試料は、当該分野で公知の方法により、少なくとも以下のサブ セグメントまたは画分の１つまたはそれ以上に分画することができる：細胞質、 核、ポリリボゾーム、サブポリリボゾーム、ミクロソームまたは粗面小胞体、ミ トコンドリアおよびスプライセオソーム関連ｍＲＮＡ（表１を参照）。 総ｍＲＮＡの単離とｍＲＮＡの翻訳プールおよび非翻訳プールへの総ｍＲＮＡ 集団の分割後、これらのプール中に存在する多くのｍＲＮＡ種の相対量を、示差 的表示、表象示差解析（ＲＤＡ）、ＧＥＭ−遺伝子発現マイクロアレイ（ＧＥＭ ）（シェナ（Ｓｃｈｅｎａ）ら、１９９５、アイエロ（Ａｉｅｌｌｏ）ら、１９ ９４、シェン（Ｓｈｅｎ）ら、１９９５、バウア（Ｂａｕｅｒ）ら、１９９３、 リアング（Ｌｉａｎｇ）とパルディー（Ｐａｒｄｅｅ）、１９９２、リアング（ Ｌｉａｎｇ）とパルディー（Ｐａｒｄｅｅ）、１９９５、リアング（Ｌｉａｎｇ ）ら、１９９３、ブラウン（Ｂｒａｕｎ）ら、１９９５、ヒューバンク（Ｈｕｂ ａｎｋ）とシャッツ（Ｓｃｈａｔｚ）、１９９４）、および抑制的サブトラクシ ョンハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）のような示差的解析を使用して同時に比 較することができる。画分から単離されたＲＮＡは、ポリＡ選択によりリボゾー ムＲＮＡ無しで、、さらにｍＲＮＡに精製される。この方法を使用して複数のプ ールが解析できることに注意されたい。すなわち、異なるストレッサーに付した 異なる細胞アリコートは、互いに比較および参照試料と比較することができる。 ポリソーム、非ポリソームまたはｍＲＮＰ（プールまたは個々の画分）からの 標識ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡまたはＰＣＲ産物型）をプローブとして使用して、ラバ （Ｒａｖａ）らの米国特許第５，５４５，５３１号およびハイセク社（Ｈｙｓｅ ｑ，Ｉｎｃ）のＷＯ９６／１７９５７に示すような固体マトリックス様マイクロ アレイ（ＧＥＭ）、および任意の種類の膜（ここで、クローンは電気泳動後ブロ ットされるか、または膜上に直接のせられる（ドットブロット））上に固定され る、ｃＤＮＡのクローン、ゲノムクローン、およびｍＲＮＡ種を同定することが できる。標識物は、放射性、蛍光性でもよく、ヂゴキシゲニンやビオチンのよう な修飾塩基を取り込んでもよい。 ポリソームまたはポリリボゾーム画分または他の画分から得られる画分を総非 分画物質と比較することは、翻訳自体の調節により生じる発現レベルの差を翻訳 自体の調節の結果である差と区別するのに必須である。ポリソーム画分または群 は、膜結合ポリソーム、ゆるいかまたはきついポリソーム、または遊離の非結合 ポリソーム群を含んでよい。 示差的（翻訳的）に発現された遺伝子を同定するためのポリソームサブ集団の 使用の重要性は、例２に記載されており、総ｍＲＮＡを検出プローブとして使用 した時、熱ショック誘導条件下で翻訳的に発現されるものとしては多くの遺伝子 が検出されなかったが、ポリソームｍＲＮＡをプローブとして使用した時は多く の遺伝子が示差的に発現されるものとして同定された。これらの遺伝子は以前は 、総ｍＲＮＡをプローブとして使用した時は、非示差的に発現されるものと考え られていた。すなわち、例２に示すように、総ｍＲＮＡを用いる熱ショック誘導 条件下で翻訳的に発現されるものとして検出されなかった多くの遺伝子は、ポリ ソームｍＲＮＡ画分とプローブ結合させると検出された。 翻訳的に制御される遺伝子を同定するための本方法は、ｍＲＮＡプールの供給 源により限定されることはない。従って本方法は、「シフト機構」により制御さ れる病理的および／またはストレス条件下で未変性の細胞／組織からの遺伝子を クローニングし、また病理的および／またはストレス条件下で誘導／抑制される 遺伝子をクローニングするのに使用することができる。病理的とは、病原体およ び外傷により引き起こされる疾患を含む疾患状態を包含する。ストレス条件はま た、疾患状態、肉体的および心理的傷害、および環境的ストレスを包含する。示 差的解析の選択された方法による解析後、翻訳により制御されているとして同定 された遺伝子は、当業者に公知の任意の適切なクローニング法によりクローニン グすることができる（リシチン（Ｌｉｓｉｔｓｙｎ）とウィグラー（Ｗｉｇｌｅ ｒ）、１９９３）。 示差的比較は、ポリソームＲＮＡ対非ポリソームＲＮＡのすべての可能な組合 せについて行うことができ、画分タイプの定義は、例えば２５４ｎｍでの吸光度 プロフィール、図１Ａに示すショ糖勾配の密度（または、高速液体クロマトグラ フィーまたはゲルシステムが使用された場合は、別のサイズ標準物質）、および 図１Ｂに示すようにアガロースゲルで画分を電気泳動後に臭化エチジウムで染色 されるＲＮＡのタイプにより行われる。図１Ａでは、ポリソーム画分は、３つ以 上のリボゾームがのせられたｍＲＮＡを有するものである。この比較のための材 料と方法は、実験の項に記載される。 示差的比較はまた、各状態のポリソーム画分対非ポリソーム画分を含むことが できる。「状態」とは、異なる処理を受けているか、または異なる特徴を有する ようにまたは異なるセットの遺伝子を発現するように修飾されている、同じ供給 源（例えば、細胞株、一次細胞、または組織）からの細胞を意味する。例えば、 これは、分化、形質転換、ストレス（例えば、酸素欠乏、化学的処理、または放 射線照射）の適用により、行うことができる。組合せには、例えば： １．個々の（同じ密度で移動）またはプール中の状態の間のポリソーム画分； ２．個々の（同じ密度で移動）またはプール中の状態の間の非ポリソーム画分 ； ３．個々の（同じ密度で移動）またはプール中の各状態の間のおよび各状態内 の非ポリソーム対ポリソーム；および ４．分画されていない総ＲＮＡと比較することができる、個々の（同じ密度で 移動）またはプール中のポリソームおよび非ポリソームである各分画。 翻訳的に制御される遺伝子の同定のための上記方法は、多くの応用を有する。 この方法の具体的な応用は、生理的または病理的変化に関連する細胞／組織中の ｍＲＮＡ発現パターンの変化を検出するための使用である。翻訳ｍＲＮＡ対非翻 訳ｍＲＮＡを比較することにより、細胞／組織中のｍＲＮＡ発現パターンの変化 に及ぼす生理的または病理的指示またはストレスの影響が観察されるかおよび／ または検出される。この方法は、多くの指示、刺激、またはストレッサーの影響 を試験して、細胞／組織の種々の生理的および病理的活性に対するその影響また は寄与を確認するために使用することができる。特に本方法は、薬剤または化学 物質の投与前後の組織のｍＲＮＡパターンを比較することにより、個体への薬剤 または他の化学物質の投与の結果を解析するために使用することができる。この 解析は、翻訳制御のレベルで細胞／組織に影響を与える薬剤、化学物質、または 他の刺激を同定することを可能にする。この方法を使用して、特定の生理的状態 または病状に特定のｍＲＮＡ種が関与しているかどうかを確認、および特に外部 刺激（すなわち、薬剤）が、翻訳レベルで制御される遺伝子に影響を与える具体 的な細胞／組織を確認することができる。 本発明のさらなる実施態様は、内部リボゾームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を コードする遺伝子配列の同定方法を提供し、細胞中の５’キャップ依存性ｍＲＮ Ａ翻訳を阻害し、細胞からｍＲＮＡのプールを採取し、およびｍＲＮＡのプール を示差的に解析して内部リボゾームエントリ一部位をコードする配列を有する遺 伝子を同定する、一般的工程を含む。 上述のように、標準的な５’キャップ依存性翻訳開始に対する例外が存在する ことが知られている。ＲＮＡの非翻訳領域（ＵＴＲ）内に、内部リボゾームエン トリー部位（ＩＲＥＳ）として知られている具体的な配列の存在を含むことがで きる配列が存在する（エーレンフェルト（Ｅｈｒｅｎｆｅｌｄ）、１９９６）。 これらの内部リボゾームエントリー部位は、前記したようにいくつかの原核生物 および真核生物系の翻訳開始を支持することが証明されている。しかし、５’キ ャップ非依存性翻訳機構により翻訳的に制御される遺伝子と正常および異常プロ セスの両方との関連を同定するために、５’キャップで開始される翻訳を阻害し てｍＲＮＡ翻訳を選択することができるようにすることが必要である。ＩＲＥＳ 配列は、配列相同性により同定することは不可能ではないにしても困難であるた め、この阻害が必要である。 ５’キャップ依存性翻訳を阻害し従って５’キャップ非依存性翻訳の存在につ いて選択するために、内部リボゾームエントリー部位の存在について解析される 細胞または組織は、５’キャップ翻訳開始機構を防止または停止させるための何 らかの方法で処理する必要がある。標準的スキャニングタイプの翻訳開始の機構 は、本質的には翻訳平衡をＩＲＥＳで開始される翻訳の方向にシフトさせるため に、実質的に（完全ではないにしても）止めるかまたは停止することができる。 すなわち、５’キャップ構造の認識は、５’キャップ介在開始の正常な機構を破 壊することにより阻害される。５’キャップ翻訳の阻害機構は、５’キャップ介 在翻訳の開始を防止するための、任意の公知の手段または機構を含んでよい。５ ’キャップ介在開始を阻害するためのそのような機構の１つは、ＩＲＥＳ配列に ついて解析される細胞、細胞系、または組織へのポリオウイルス２Ａプロテアー ゼの発現である。ポリオウイルス２Ａプロテアーゼを使用すると、細胞性５’キ ャップ依存性翻訳機構を不活性化することにより、５’キャップ依存性ｍＲＮＡ 翻訳が阻害される。これは、翻訳的に制御される遺伝子を含有する細胞性ＩＲＥ Ｓの同定を可能にし、遺伝子活性化の前に、ストレス誘導性成分／ストレッサー （例えば、熱ショック、低酸素症、または前述の他のストレス誘導性成分）を適 用後の細胞の迅速な応答において決定的に重要な役割を果たす。ポリオウイルス ２Ａプロテアーゼは、ｍＲＮＡ５’キャップの認識に関与する真核生物翻訳開始 因子４（ｅＩＦ−４）のｅＩＦ−４−γ（ｐ２２０）の大きいサブユニットを切 断することにより、５’キャップ介在翻訳を防止する。 ５キャップ介在翻訳を阻害するために、ポリオウイルス２Ａプロテアーゼは、 内部リボゾームエントリー部位をコードする遺伝子配列の存在についておよび翻 訳的に制御される遺伝子を同定するために解析される細胞内に、取り込まれなけ ればならない。細胞中にポリオウイルス２Ａプロテアーゼを取り込むそのような １つの方法は、ポリオウイルス２Ａプロテアーゼをコードする遺伝子を含有する 発現ベクターを用いる標的細胞の形質転換を含む。ポリオウイルス２Ａプロテア ーゼは構成的に発現されると生きた細胞に有害であるため、ポリオウイルス２Ａ プロテアーゼ遺伝子を含有する発現ベクターは、細菌のＬａｃＩ誘導系（Ｏａｃ Ｉレプレッサーが、ＣＭＶプロモーター下で構成的に発現されている）に結合し ている。ポリオウイルス２Ａプロテアーゼは、３’末端でＬａｃＩレプレッサー 結合部位に結合している多くの適当なプロモーター（例えば、ＲＳＶ、ＴＫ、ま たはミニＴＫプロモーター）下で発現されてよい。ＬａｃＩレブレッサーを含有 する発現ベクターおよびポリオウイルス２Ａ発現ベクターで標的細胞を形質転換 することにより、ポリオウイルス２Ａプロテアーゼの発現は、細胞をイソプロピ ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で処理して、誘導することが できる。標的細胞をＩＰＴＧで処理すると、レプレッサー結合部位で結合したＬ ａｃＩレプレッサー分子の結合が弱められ、従ってポリオウイルス２Ａプロテア ーゼの転写が可能になる。ポリオウイルス２Ａプロテアーゼの発現を誘導系（例 えば、ＬａｃＩ系）に結合させることにより、この機構は、ポリオウイルス２Ａ プロテアーゼをコードする遺伝子の発現の制御の確立を可能にする。 内部リボゾームエントリ一部位をコードする遺伝子配列を同定するための本発 明の実施態様の例は、以下の例に示す。 標的細胞内でポリオウイルス２Ａプロテアーゼの発現を誘導した後、ＲＮＡ（ おそらく内部リボゾームエントリー部位を含有する）を採取し、前述の方法を使 用して解析して、その翻訳がポリオウイルス２Ａプロテアーゼの作用によりアッ プレギュレーションされる遺伝子を同定することができる。 実験 示差的翻訳 材料と方法 一般的スキーム ａ．供給源組織または細胞からのすべてのＲＮＡの総ｍＲＮＡ有機的抽出（ポリ Ａ＋ｍＲＮＡの追加の選択を含んでもよい）。 ｂ．低張緩衝液中でのホモジナイズによる細胞（組織または細胞株から）の核Ｒ ＮＡ溶解。遠心分離による核の採取とＲＮＡの有機的抽出。 ｃ．上記２からの上清のＲＮＡの有機的抽出。 ｄ．ポリリボゾーム／サブポリリボゾーム性分画。ホモジナイズ低張緩衝液によ る細胞の溶解、核の除去および線形ショ糖勾配によるポリリボゾームの分画、お よび勾配の各画分からのＲＮＡの有機的抽出。 ｅ．分泌されかつ膜をコードする転写体。 １．パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）勾配上のＲＥＲの単離（細胞のホモジナイ ズ後）。 ２．ＲＥＲを含有するミクロソームの調製。 ３．界面活性剤にる細胞の連続的処理による膜結合ポリリボゾームの単離。 ｆ．核タンパク質。細胞溶解物を異なる界面活性剤で処理することによる細胞骨 格関連ポリリボゾームの単離。 ｇ．ミトコンドリア遺伝子。パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）上のミトコンドリア の単離。 ｉ。代替スプライシング。核の分離と線形ショ糖勾配上のスプライセオソーム（ タンパク質とＲＮＡ複合体）の単離。細胞抽出物の調製 細胞を遠心分離した。ペレットをＰＢＳで洗浄し、再度遠心分離した。低張溶 解緩衝液（ＨＬＢ：２０mMトリス塩酸（ｐＨ＝７．４）；１０mM ＮａＣｌ；３ mM ＭｇＣｌ₂）で４×の１パック細胞容量（ＰＣＶ）中に、細胞を再懸濁した 。細胞を氷上で５分問インキュベートした。１．２％トリトンＸ−１００と０． ２Ｍショ糖を含有する１×ＰＣＶのＨＬＢを加えた。細胞をダウンス（Ｄｏｕｎ ｃｅ）ホモジナイザーでホモジナイズした（Ｂ乳棒で５ストローク）。細胞溶解 物を２３００ｇで４℃で１０分間遠心分離した。上清を新しい試験管に移した。 １０mg／mlヘパリンを含有するＨＬＢを、最終濃度１mg／mlヘパリンになるよう に加えた。ＮａＣｌを最終濃度０．１５Ｍになるように加えた。上清を液体窒素 で急速凍結した後−７０℃で凍結したか、または直ちに使用した。ショ糖勾配分画 ＨＬＢ中の０．５Ｍ〜１．５Ｍショ糖で線形ショ糖勾配を調製した。ポリアロ マー（Ｐｏｌｙａｌｌｏｍｅｒ）試験管（１４×８９mm）を使用した。０．５〜 １．０mlの細胞抽出物を勾配液上にのせた。細胞を３６，０００rpmで４℃で１ １０分間遠心分離した。ＩＳＣＯデンシティフラクショネーター（ＩＳＣＯ Ｄ ｅｎｓｉｔｙ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ）を使用して、画分を集め、吸光度プ ロフィールを記録した。ＲＮＡ精製 ＳＤＳを０．５％になるように加え、プロテイナーゼＫを０．１mg／mlになる ように加え、３７℃で３０分間インキュベートした。等量のフェノール＋クロロ ホルム（１：１）で抽出。水層を１部のクロロホルムで抽出し、０．３Ｍになる ように酢酸ナトリウムと２．５容量のエタノールを加え、−２０℃で一晩インキ ュベートして沈殿させた。１０分問遠心分離し、上清を吸引し、ＲＮＡペレット を無菌のジエチルピロカーボネート（以後「ＤＥＰＣ」と呼ぶ）ＤＥＰＣ処理水 に溶解した。示差的解析 示差的表示 逆転写：２μｇのＲＮＡを、６．５μｌ容量中の１pmolのオリゴｄＴプライマ ー（ｄＴ）₁₈と、７０℃で５分問加熱し氷上で冷却してアニーリングした。２μ ｌの反応緩衝液（×５）、１μｌの１０mM ｄＮＴＰミックス、および０．５μ ｌのスーパースクリプトII（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ II）逆転写酵素（ギブコ ビーアールエル（ＧｉｂｃｏＢＲＬ））を加えた。４２℃で１時問反応を行なっ た。７０μｌのＴＥ（１０mM トリス（ｐＨ＝８）；０．１mM ＥＤＴＡ）を加 えて反応を停止させた。示差的表示に使用したオリゴヌクレオチド：オリゴヌク レオチドは基本的に、デルタＲＮＡフィンガープリンティングキット（Ｄｅｌｔ ａ ＲＮＡ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｋｉｔ）（クロンテクラボズ社（ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｓ．ｉｎｃ．））に記載のものである。構造：５’Ｃ ＡＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＹ３’（配列番号 １）中に９個の「Ｔ」オリゴヌクレオチドがあった。１０個の「ｐ」オリヌクレ オチドは構造：３’ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡ”ＴＧＣＴＧＧＧＧＡ” ３’（配列番号１１）であった（カッコ内の９ヌクレオチドまたは１０ヌクレオ チドは任意の配列であり、各「Ｐ」オリゴに１つずつ、１０個の異なる配列（配 列番号１２〜２１）がある）。増幅反応 ：各反応は２０μｌで行い、５０μＭ ｄＮＴＰミックス、１μＭの各 プライマー、１×ポリメラーゼ緩衝液、１単位の拡張ポリメラーゼ（ベーリンガ ーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））、２μＣｉ［α−³² Ｐ］ｄＡＴＰと１μｌのｃＤＮＡ鋳型を含有する。サイクリング条件は：９５ ℃で３分、次に９４℃で２分、４０℃で５分、６８℃で５分を３サイクル。次に 、９４℃で１分、６０℃で２分、６８℃で２分を２７サイクル行なった。６８℃ で７分間インキュベートし、２０μｌの配列決定停止溶液（９５％ホルムアミ ド、１０mM ＮａＯＨ、０．０２５％ブロモフェノールブルー、０．０２５％キ シレンシアノール）を加えて、反応を停止させた。ゲル解析 ：５％配列決定用ポリアクリルアミドゲルに３〜４μｌをのせ、遅い色 素（キシレンシアノール）が底から約２cmのところまで、試料を２０００ボルト ／４０ミリアンペアで電気泳動した。ゲルをろ紙に移し、真空下で乾燥し、Ｘ線 フィルムに露光させた。示差的バンドの回収 ：種々のプールの間で差を示すバンドを、乾燥ゲルから切り 取り、微量遠心分離管中に入れた。５０μｌの無菌水を加え、試験管を１００℃ で５分間加熱した。示差的表示で使用したものと同じプライマーを使用して４９ μｌのＰＣＲ反応物に１μｌを加え、試料を３０サイクル（９４℃で１分、６０ ℃で１分、６８℃で１分）増幅した。１０μｌをアガロースゲルで解析して視覚 化し、うまく増幅されたことを確認した。表象示差解析 逆転写 ：上記したように行なったが、２μｇのポリＡ＋選択されたｍＲＮＡを使 用した。２本鎖ｃＤＮＡの調製：前の工程からのｃＤＮＡをアルカリで処理して ｍＲＮＡを除去し、沈殿させ、２０μｌの水に溶解した。５μｌの緩衝液、２μ ｌの１０mM ｄＡＴＰ、Ｈ₂Ｏで４８μｌになるように加え、２μｌの末端デオ キシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を加えた。反応物を３７℃で２ 〜４時間インキュベートした。５μｌのオリゴｄＴ（１μｇ／μｌ）を加え、６ ０℃で５分間インキュベートした。５μｌの２００mM ＤＴＴ、１０μｌの１０ ×セクション緩衝液（１００mM ＭｇＣｌ₂、９００mM ヘペス、ｐＨ６．６） 、１６μｌのｄＮＴＰ（１mM）、および１６Ｕのクレノウを加え、混合物を室温 で一晩インキュベートして、ｄｓ ｃＤＮＡを作成した。１００μｌのＴＥを加 え、フェノール／クロロホルムで抽出した。ＤＮＡを沈殿させ、５０μｌのＨ₂ Ｏに溶解した。表象の作成 ：２５μｌのｃＤＮＡに３μｌのＤｐｎII反応緩衝液２０ＶとＤｐｎ IIを加えて、３７℃で５時間インキュベートして、ＤｐｎIIを有するｃＤＮＡを 消化した。５０μｌのＴＥを加え、フェノール／クロロホルムで抽出した。ｃＤ ＮＡを沈殿させ、１０ng／μｌの濃度に溶解した。 この方法では以下のオリゴヌクレオチドを使用した： Ｒ−Ｂｇｌ−１２ ５’ＧＡＴＣＴＧＣＧＧＴＧＡ３’（配列番号２２） Ｒ−Ｂｇｌ−２４ ５’ＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧＣＡ３ ’（配列番号２３） Ｊ−Ｂｇｌ−１２ ５’ＧＡＴＣＴＧＴＴＣＡＴＧ３’（配列番号２４） Ｊ−Ｂｇｌ−２４ ５’ＡＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣＡ３ ’（配列番号２５） Ｎ−Ｂｇｌ−１２ ５’ＧＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＧ３’（配列番号２６） Ｎ−Ｂｇｌ−２４ ５’ＡＧＧＣＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＴＣＣＧＡＧＧＧＡＡ３ ’（配列番号２７） Ｒ−Ｂｇｌ−１２とＲ−Ｂｇｌ−２４オリゴを、テスターとドライバーに連結 した：１．２μｇのＤｐｎII消化したｃＤＮＡ。各オリゴから４μｌと、５μｌ 連結緩衝液Ｘ１０を６０℃で１０分間アニーリングした。２μｌのリガーゼを加 え、１６℃で一晩インキュベートした。１４０μｌのＴＥを加えて連結混合物を 希釈した。Ｒ−Ｂｇｌ−２４プライマーと２μｌの連結生成物を使用して、２０ ０μｌの容量中で増幅を行い、各試料について２０個の試験管で繰り返した。Ｔ ａｑＤＮＡポリメラーゼを加える前に、試験管を７２℃で３分間加熱した。ＰＣ Ｒ条件は以下の通りである：７２℃で５分、２０サイクルの９５℃で１分と７２ ℃で３分、次に７２℃で１０分。 各４つの反応物を一緒にし、フェノール／クロロホルムで抽出し、沈殿させた 。増幅したＤＮＡを０．５μｇ／μｌの濃度に溶解し、すべての試料をプールし た。サブトラクション ：テスターＤＮＡ（２０μｇ）を上記したようにＤｐｎIIで消 化し、１．２％アガロースゲルで分離した。ゲルからＤＮＡを抽出し、Ｒ−オリ ゴについて記載したように、２μｇをＪ−Ｂｇｌ−１２とＪ−Ｂｇｌ−２４オリ ゴに連結した。連結したテスターＤＮＡをＴＥで１０ｎｇ／μｌに希釈した。ド ライバーＤＮＡをＤｐｎIIで消化し、再度０．５μｇ／μｌの最終濃度になるよ うに精製した。４０μｇのドライバーＤＮＡを０．４μｇのテスターＤＮＡと混 合した。抽出はフェノール／クロロホルムで行い、７０％エタノールで２回洗浄 して沈殿させ、４μｌの３０mM ＥＰＰＳ（ｐＨ＝８．０）、３mM ＥＤＴＡ中 にＤＮＡを再懸濁し、３５μｌの鉱物油を重層した。９８℃で５分変性させ、６ ７℃に冷却し、１μｌの５Ｍ ＮａＣｌをＤＮＡに加えた。６７℃で２０時間イ ンキュベートした。４００μｌのＴＥを加えてＤＮＡを希釈した。増幅 ：最終容量２００μｌ中のサブトラクトションしたＤＮＡの増幅は以下のよ うに行なった：緩衝液、ヌクレオチドおよび２０μｌの希釈ＤＮＡを加え、７２ ℃に加熱し、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを加えた。７２℃で５分間インキュベー トし、Ｊ−Ｂｇｌ−２４オリゴを加えた。９５℃で１分と７０℃で３分を１０サ イクル行なった。７２℃で１０分インキュベートした。４つの別々の試験管で増 幅を繰り返した。増幅したＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、沈殿さ せ、すべての４つの試験管を４０μ１の０．２×ＴＥ中で一緒にし、ムングビー ンヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）で以下のように消化 した：２０μｌのＤＮＡに、４μｌの緩衝液、１４μｌのＨ₂Ｏ、および２μｌ のムングビーンヌクレアーゼ（１０単位／μｌ）を加えた。３０℃で３５分イン キュベートした＋第１の示差的産物（ＤＰＩ）。繰り返しサブトラクションハイブリダイゼーションとドライバーでのＰＣＲ増幅 ：Ｎ−ＢｇｌオリゴヌクレオチドとＪ−Ｂｇｌオリゴヌクレオチドを使用して、 それぞれ示差的比１：４００（ＤＰII）および１：４０，０００（ＤＰIII）。 示差的産物を、個々のクローンの解析のために、ＢａｍＨＩ部位でＢｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔベクター中にクローン化した。例１ ショ糖密度勾配からのｍＲＮＡの示差的翻訳解析 Ｃ６グリオーム細胞を正常な条件下（酸素正常状態）または酸素欠乏条件下（ 低酸素状態）で８時間増殖させた。次に細胞を採取し、細胞質抽出物をショ糖勾 配にかけた。ショ糖勾配から得られた画分からＲＮＡを抽出し、ポリソームおよ び非ポリソーム試料中にプールした。逆転写後、表２に記載のプライマーＴ１と Ｐ１０を使用して、示差的表示法を適用した。ＰＣＲ産物を５％アクリルアミド 配列決定用ゲルで分離した。次にゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに露光させた。結 果を図２に示すが、「Ａ」は、８時間の低酸素状態後の細胞の非ポリソーム画分 中にのみ現れるｍＲＮＡ種を示す。これは、長時間の低酸素状態後にまだ翻訳的 に抑制されているが活性に転写されている、転写的に誘導された可能性のあるｍ ＲＮＡ種である。「Ｂ」は、低酸素状態後にポリソーム画分中に移動した、正常 な酸素レベル下で増殖させた細胞の非ポリソーム画分中に存在するｍＲＮＡ種を 示す。 材料と方法は、前述のように行なった。本例は、ストレス誘導性成分により制 御される翻訳的に制御される遺伝子の同定のために、本発明が有用であることを 証明する。例２ 表象的熱ショックＧＥＭ示差的発現解析 材料と方法 実験細胞を、正常温度（３７℃）と熱ショック温度（４３℃）で４時間増殖さ せた。次に細胞を採取し、細胞質抽出物を得て、そこからＲＮＡを抽出した。次 に抽出したＲＮＡを、前述のＧＥＭ技術を使用して解析した。 表３と４は、熱ショックのような刺激に応答して示差的に発現される遺伝子を 同定するのに、示差的発現解析において総ｍＲＮＡプローブに対してポリソーム プローブを使用することの有用性を証明している。これらの表は、フィブロネク チン、ピルビン酸キナーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ポリ（ＡＤ Ｐリボース）ポリメラーゼ、サイモポエチン、９０Ｋｄ熱ショックタンパク質、 アクリルアミノ酸放出酵素、β−スペクトリン、およびピルビン酸キナーゼは、 ポリソームプローブを使用してすべて示差的に発現されるとして同定され、一方 フィブロネクチンの例外を除いて、総ｍＲＮＡプローブを使用した時他のタンパ ク質は示差的に発現されるとして同定されなかった。本例は、ストレス誘導性成 分により制御される、翻訳的にまたは示差的に制御される遺伝子の同定において 、本発明の有用性を証明している。さらに表３に、ポリソームプローブと総ｍＲ ＮＡプローブの両方を用いる、熱ショック示差的遺伝子発現解析の結果を示す。 表３は、ポリソームプローブを使用して多くの示差的に発現される遺伝子が同定 されるが、総ｍＲＮＡを使用した時はこれらの遺伝子は、必ずしも示差的に発現 されるものとして同定されないことを例示している。表４は、総ｍＲＮＡまたは ポリソームｍＲＮＡをプローブとして使用して同定される示差的に発現される遺 伝子の数を統計的に示す。表４は、ポリソームｍＲＮＡプローブは、示差的に発 現される遺伝子対総ｍＲＮＡプローブの数の２〜１０倍以上の上昇を与えること を明白に示す。例３ ＩＲＥＳ含有遺伝子の同定 ２Ａプロテアーゼを発現する哺乳動物細胞の樹立 予備実験では、２ＡプロテアーゼがＨＥＫ−２９３ヒト（ＡＴＣＣ ＣＲＬ− １５７３）細胞中でＩＲＥＳ含有遺伝子の発現を増強することが示されたため、 ＨＥＫ−２９３ヒト（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）細胞をポリオウイルス２Ａ プロテアーゼ誘導発現のモデル系として使用した。ＨＥＫ−２９３細胞を、それ ぞれ図３Ａ〜Ｃに示すように、ＰＣＩｂｂ−Ｌａｃｌ−Ｈｙｇ（ストラタジーン （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのベクターをベースにして本出願人が作製した） 上の、ポリオウイルス２Ａプロテアーゼ発現ベクターＰＴＫ−ＯＰ３−ＷＴ２Ａ 、ミニＴＫ−ＷＴ２Ａ、のいずれか１つと組合せて、ＣＭＶ−ＬａｃＩ−（当業 者に公知技術を使用して本出願人が作製した）で同時トランスフェクションした 。ＬａｃＩ発現ベクターは、ヒグロマイシン選択マーカーを含有し、ポリオウイ ルス２Ａプロテアーゼ発現ベクターは、ネオマイシン選択マーカー（これは、両 方のマーカーに耐性のクローンの単離を可能にし、おそらくＬａｃＩレプレッサ ーとポリオウイルス２Ａタンパク質の両方を発現する）を含有した。ポリオウイルス２Ａプロテアーゼ発現の解析 死滅測定法 ：ヒグロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とネオマイシン（５００μｇ／ ｍｌ）で選択した後に増殖した耐性クローンを、ＩＰＴＧ（５mMで４８時間＋５ mMでさらに４８時間）で処理した。次に生存性について細胞を追跡し、ポリオウ イルス２Ａプロテアーゼ誘導で完全な死滅を示したクローン（おそらく、ポリオ ウイルス２Ａプロテアーゼの有害作用を発現する）を、さらなる解析のために選 択した。図４に示すように、そのようなクローンの２つ（ＴＫプロモーターの制 御下でポリオウイルス２Ａプロテアーゼを発現するＨＥＫ−２９３細胞（クロー ン＃１４）とミニＴＫプロモーターの制御下でポリオウイルス２Ａプロテアーゼ を発現するＨＥＫ−２９３細胞（クローン＃１））を単離した。２Ａプロテアーゼ発現の解析 ：ＩＰＴＧ誘導後のＨＥＫ−２９３ミニＴＫ＃１ク ローンとＨＥＫ−２９３ＴＫ＃１４クローン中のポリオウイルス２Ａプロテアー ゼ発現の直接解析は、このタンパク質に対する抗体が欠如していたため実施しな かった。遺伝子発現の変化を測定するために、ノーザンブロット解析、ＲＮａｓ ｅ保護測定法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および逆転写酵素ポリ メラーゼチェイン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含むいくつかの現在利用可能な技術を 使用することができる。ＲＴ−ＰＣＲは非常に高感度な方法であり、ＩＰＴＧ処 理後のＨＥＫ−２９３ミニＴＫ＃１クローン中のポリオウイルス２Ａプロテアー ゼをコードするｍＲＮＡの誘導を追跡するために使用した。ｍＲＮＡを、異なる 時点でＩＰＴＧで処理後ＨＥＫ−２９３親細胞とＨＥＫ−２９３ミニＴＫ−２Ａ クローンから調製した。ポリオウイルス２Ａプロテアーゼ特異的オリゴヌクレオ チド（５’ＧＣＡＡＣＴＡＣＣＡＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧ３’（配 列番号２８）と５’ＧＣＡＡＣＣＡＡＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧ３’ （配列番号２９））を使用して、ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ反応に付した。 ポリオウイルス２ＡプロテアーゼｍＲＮＡはＨＥＫ−２９３親細胞中で検出さ れなかったが、ＩＰＴＧ処理後に誘導され、図５に示すようにＩＰＴＧ処理の４ ８時間後に最も高いレベルに達した。２Ａプロテアーゼ活性の解析 ｐ２２０切断 ：ポリオウイルス２Ａプロテアーゼの充分性状解析された機能は、 ｐ２２０タンパク質（４Ｆγ翻訳因子）（４０Ｓリボサブユニットの成分）の切 断である。ｐ２２０の切断により、翻訳後修飾のために、１００〜１２０ＫＤａ 分子量の３つのＮ−末端切断生成物を生成する。ｐ２２０とその切断生成物は、 図６に示すようにＮ−末端領域ｐ２２０に対して特異的に作成したポリクローナ ル抗ｐ２２０抗体を使用して、７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロット解析 により同定された。図６は、ＨＥＫ−２９３ミニＴＫ２Ａ＃１クローンとＨＥＫ −２９３ＴＫ２Ａ＃１４クローンがポリオウイルス２Ａプロテアーゼ発現につい て誘導されて、ｐ２２０の切断生成物を生成するという解析を示す。対照として 、ＨＥＫ−２９３細胞溶解物を、インビトロ翻訳で産生されたポリオウイルス２ Ａプロテアーゼで処理し、ＨＥＫ−２９３ ２Ａクローン中と同じ７％ＳＤＳ− ＰＡＧＥ上の、移動度の同じ切断生成物を生成することがわかった。 この系を、ポリソーム分画のｍＲＮＡの供給源として使用した。ポリオウイル ス２Ａプロテアーゼの作用によりその翻訳がアップレギュレーションされる遺伝 子を同定するために、上記プロトコールを使用してＲＤＡ解析を行なった。表５ は、上記方法に従って行なった解析の結果とこれにより単離された遺伝子を要約 する。 本出願を通して、種々の刊行物は引用により特許は番号により参照される。刊 行物の完全な引用は、以下のリストに示す。本発明が関連する技術の現状をより 詳細に記載するために、これらの刊行物のその全体の開示は、参照のため本出願 に取り込まれる。 本発明は例示的に記載されており、使用された用語は、限定するものではなく 説明を目的とするものであることに注意されたい。 上記教示から、本発明の多くの修飾や変更が可能であることは明らかである。 従って、添付の請求の範囲内で、本発明は具体的に記載したもの以外に使用可能 であることは理解されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ハリス，ニコラス イスラエル国 レホボト，ハナシ ハリス ホン 14／17 (72)発明者 スカリテル，ラミ イスラエル国 ネス―ジオナ，ハバニム 117／10 (72)発明者 グロスマン，ゼハバ イスラエル国 レホボト，タラン ストリ ート 20

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．翻訳的に制御される遺伝子の同定方法であって、 特定の病理的またはストレス誘導性成分で未知の標的ｍＲＮＡ（標的ｍＲＮＡ はｍＲＮＡのより大きい試料の一部である）の翻訳を刺激する工程； ｍＲＮＡの試料を翻訳ｍＲＮＡと非翻訳ｍＲＮＡのプールに分割する工程；そ して ｍＲＮＡのプールを示差的に解析して、ストレス誘導性成分により翻訳的に制 御される遺伝子を同定する工程 とを含む上記方法。 ２．ストレス誘導性成分は、遺伝子翻訳に対して未知の関係のストレッサーとし てさらに定義される、請求の範囲第１項記載の方法。 ３．ストレス誘導性成分は毒素である、請求の範囲第２項記載の方法。 ４．ストレス誘導性成分は化学物質である、請求の範囲第２項記載の方法。 ５．ストレス誘導性成分は薬剤である、請求の範囲第２項記載の方法。 ６．ストレス誘導性成分は電流である、請求の範囲第２項記載の方法。 ７．ストレス誘導性成分は病原体である、請求の範囲第２項記載の方法。 ８．ストレス誘導性成分は病理的ストレスである、請求の範囲第２項記載の方法 。 ９．標的ｍＲＮＡの別々のアリコートの翻訳を刺激するために、少なくとも２つ のストレス誘導性成分が使用される、請求の範囲第１項記載の方法。 １０．請求の範囲第１項記載の方法であって、解析工程は、示差的表示、表象示 差解析（ＲＤＡ）、抑制的サブトラクションハイブリダイゼーション（ＳＳＨ） 、遺伝子発現の連続的解析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現マイクロアレイ（ＧＥＭ） 、核酸チップ技術、直接配列決定法、およびこれらの方法の変法または組合せよ りなる群から選択される、上記方法。 １１．翻訳的に制御されるとして同定される遺伝子をクローニングする工程をさ らに含む、請求の範囲第１項記載の方法。 １２．翻訳を刺激する工程は、細胞を化学的に処理するとしてさらに定義される 、請求の範囲第１項記載の方法。 １３．翻訳を刺激する工程は、細胞に放射線照射をするとしてさらに定義される 、請求の範囲第１項記載の方法。 １４．翻訳を刺激する工程は、細胞の酸素を欠乏させるとしてさらに定義される 、請求の範囲第１項記載の方法。 １５．細胞は分化するように刺激される、請求の範囲第１項記載の方法。 １６．ｍＲＮＡ試料は、ｍＲＮＡの少なくとも１つのプール中でｍＲＮＡの翻訳 を刺激するために異なる処理と受けている細胞を含む、請求の範囲第１項記載の 方法。 １７．解析工程は、拡散した勾配中またはプール中で、同じ密度で移動するポリ ソーム画分を区別する、請求の範囲第１項記載の方法。 １８．解析工程は、個々にまたはプールとして非ポリソーム画分を区別する、請 求の範囲第１項記載の方法。 １９．解析工程は、個々にまたはプール中で、刺激されたポリソーム画分と非ポ リソーム画分とを区別する、請求の範囲第１項記載の方法。 ２０．解析工程は、未分画総ＲＮＡプールと比較して、個々にまたはプールとし てポリソームおよび非ポリソーム画分のそれぞれを区別する、請求の範囲第１項 記載の方法。 ２１．特定の病理的またはストレス条件に応答性の遺伝子の同定方法であって： （ａ）生物または組織または細胞に病理または病理的刺激ストレスを適用する 工程； （ｂ）ストレスに付された生物または組織または細胞からｍＲＮＡを単離する 工程； （ｃ）発現制御およびそのコードされるタンパク質局在により、少なくとも２ つのプールにｍＲＮＡ試料を分割する工程；および （ｄ）病理的またはストレス条件に付されていない対照プールと比較して、ｍ ＲＮＡ試料のプールを示差的に解析して、病理的またはストレス条件に応答した 遺伝子を同定する工程 とを含む上記方法。 ２２．請求の範囲第２０項記載の方法であって、示唆的解析は、示差的表示、表 象示差解析（ＲＤＡ）、抑制的サブトラクションハイブリダイゼーシヨン（ＳＳ Ｈ）、遺伝子発現の連続的解析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現マイクロアレイ（ＧＥ Ｍ）、核酸チップ技術、直接配列決定法、およびこれらの方法の変法または組合 せよりなる群から選択される、上記方法。 ２３．その発現がストレス下のｍＲＮＡレベルで制御される遺伝子の同定方法で あって： ストレス誘導性成分で未知の標的ｍＲＮＡ（標的ｍＲＮＡはｍＲＮＡのより大 きい試料の一部である）の翻訳を選択的に刺激する工程； ｍＲＮＡの試料を翻訳ｍＲＮＡプールと非翻訳ｍＲＮＡのプールに分割する工 程；そして ｍＲＮＡのプールを示差的に解析して、その発現がストレス誘導性成分により ｍＲＮＡレベルで制御される遺伝子を同定する工程 とを含む上記方法。 ２４．請求の範囲第１項または第２３項記載の方法であって、遺伝子は翻訳レベ ルで制御され：遺伝子は転写レベルで制御され；遺伝子はＲＮＡ安定性により制 御され；遺伝子は核と細胞質の間のｍＲＮＡ移動速度により制御され；そして遺 伝子は示差的スプライシングにより制御される、上記方法。 ２５．ストレス誘導性成分は、毒素または化学物質、または薬剤または電流、ま たは病原体または病理的ストレスである、請求の範囲第２３項記載の方法。 ２６．請求の範囲第２３項記載の方法であって、解析工程は、示差的表示、表象 示差解析（ＲＤＡ）、抑制的サブトラクションハイブリダイゼーション（ＳＳＨ ）、遺伝子発現の連続的解析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現マイクロアレイ（ＧＥＭ ）、核酸チップ技術、直接配列決定法、およびこれらの方法の変法または組合せ よりなる群から選択される、上記方法。 ２７．請求の範囲第２４項記載の方法であって、翻訳を刺激する工程は、細胞を 化学的に処理する、または細胞に放射線を照射する、または細胞から酸素を欠乏 させて、分化するように刺激するとしてさらに定義される、上記方法。 ２８．内部リボゾームエントリー部位をコードする遺伝子配列の同定方法であっ て： 細胞中の５キャップ依存性ｍＲＮＡ翻訳を阻害する工程： 細胞からｍＲＮＡのプールを採取する工程；および ｍＲＮＡのプールを示差的に解析して、内部リボゾームエントリー部位をコー ドする配列を有する遺伝子を同定する工程 とを含む上記方法。 ２９．阻害工程は、非５’キャップ依存性ｍＲＮＡ翻訳について選択するとして さらに定義される、請求の範囲第２８項記載の方法。 ３０．阻害工程は、細胞中のポリオウイルス２Ａプロテアーゼをコードする遺伝 子を取り込む工程をさらに含む、請求の範囲第２８項記載の方法。 ３１．取り込み工程は、ポリオウイルス２Ａプロテアーゼをコードする遺伝子を 含有するベクターで細胞を形質転換するとしてさらに定義される、請求の範囲第 ３０項記載の方法。 ３２．ポリオウイルス２Ａプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を制御する工 程を含む、請求の範囲第３０項記載の方法。 ３３．解析工程は、示差的表示解析としてさらに定義される、請求の範囲第２８ 項記載の方法。 ３４．解析工程は、表象示差解析としてさらに定義される、請求の範囲第２８項 記載の方法。 ３５．解析工程は、遺伝子発現マイクロアレイ解析を実施するとしてさらに定義 される、請求の範囲第２８項記載の方法。 ３６．翻訳的に制御されるとして同定される遺伝子をクローニングする工程をさ らに含む、請求の範囲第２８項記載の方法。 ３７．解析工程は、個々にまたはプールとして同じ密度で移動するポリソーム画 分を区別する、請求の範囲第２８項記載の方法。 ３８．解析工程は、個々にまたはプールとして非ポリソーム画分を区別する、請 求の範囲第２８項記載の方法。 ３９．解析工程は、個々にまたはプールとして刺激されたポリソーム画分および 非ポリソーム画分を区別する、請求の範囲第２８項記載の方法。 ４０．解析工程は、未分画総ＲＮＡプールと比較して、個々にまたはプールとし てポリソームおよび非ポリソーム画分のそれぞれを区別する、請求の範囲第２８ 項記載の方法。